Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays

Samenvatting

We illustreren hoe u opnemen en elektrische modulatie van 4-aminopyridine-geïnduceerde epileptiform activiteit in knaagdier hersenen segmenten met behulp van micro-elektrode arrays. Een aangepaste opname-kamer onderhoudt weefsel levensvatbaarheid in langdurige experimentele sessies. Leven van de elektrode toewijzing en selectie van stimulerende paren worden uitgevoerd door een aangepaste grafische gebruikersinterface.

Samenvatting

Temporale kwab epilepsie (TLE) is de meest voorkomende complexe partiële epileptische syndroom en de minste inspelen op medicijnen. Diepe hersenstimulatie (DBS) is een veelbelovende aanpak als farmacologische behandeling mislukt of Neurochirurgie wordt niet aanbevolen. Acute hersenen segmenten gekoppeld aan micro-elektrode matrices (MEA's) vormen een waardevol instrument om te bestuderen van neuronale netwerk interacties en hun modulatie door elektrische stimulatie. In vergelijking met conventionele extracellulaire opname technieken bieden ze de toegevoegde voordelen van een groter aantal waarnemingspunten en een bekende tussen elektrode afstand, waardoor het propagatie pad en de snelheid van elektrofysiologische studeren signalen. Weefsel oxygenatie kan echter worden sterk aangetast tijdens MEA opname, waarbij een hoge perfusie-tarief, dat ten koste van verminderde signal-to-noise verhouding en hogere trillingen in de experimentele temperatuur gaat. Elektrische stimulatie verder benadrukt het hersenweefsel, waardoor het moeilijk te voeren langdurige opname/stimulatie tijdperken. Bovendien moet de elektrische modulatie van hersenactiviteit segment te richten op specifieke structuren/studierichtingen binnen het segment van de hersenen, die vereisen dat toewijzing van de elektrode worden gemakkelijk en snel live uitgevoerd tijdens het experiment. Hier, we illustreren het uitvoeren van de opname en elektrische modulatie van 4-aminopyridine (4AP)-geïnduceerde epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes met behulp van vlakke multilaterale milieuovereenkomsten. We laten zien dat het hersenweefsel verkregen muizen rat hersenweefsel overtreft en dus beter voor MEA experimenten geschikt is. Dit protocol staat garant voor de generatie en het onderhoud van een stabiel epileptiform patroon dat getrouw reproduceert het elektrofysiologische functies waargenomen met conventionele veld potentiële opname, enkele uren of langer aanhoudt en outlasts opgelopen elektrische stimulatie voor langdurige tijdperken. Weefsel levensvatbaarheid gedurende het gehele experiment is bereikt dankzij het gebruik van een kleine-volume aangepaste opname kamer waardoor laminaire flow en snelle oplossing uitwisseling zelfs op lage (1 mL/min) perfusie tarieven. Snelle MEA toewijzing voor real-time bewaking en selectie van stimulerende elektroden wordt uitgevoerd door een aangepaste grafische gebruikersinterface (GUI).

Inleiding

Epilepsie is een levensbedreigende progressieve aandoening veroorzaakt door ongecontroleerde activiteit van de hersenen¹; het draagt onder de hoogste last van ziekte en belangrijke sociale stigma^2,3. TLE is het meest voorkomende syndroom (40%) en de meeste vaak (~ 30%) resistent tegen anti-epileptische medicatie⁴. Terwijl chirurgische ablatie van de epileptogene weefsel de conditie van de patiënt verbeteren kan, het is niet haalbaar in alle patiënten en kan geen garantie voor een volledig beslag-vrij leven⁵. Modulatie van epileptische limbische netwerken door elektrische DBS is een veelbelovende aanpak als farmacologische behandeling of Neurochirurgie zijn niet geschikt.

Knaagdier hersenen segmenten zijn een waardevol instrument om te bestuderen hoe neuronale netwerken functie in gezondheid en ziekte⁶ door middel van in vitro electrofysiologie technieken, zoals ze, ten minste in deel, de oorspronkelijke architectuur en connectiviteit van de hersenen behouden regio('s) van belang (ROI). In het bijzonder, horizontale gecombineerde hippocampus-Entorinale cortex (hippocampus-EG) segmenten omvatten de essentiële neuronale netwerken die betrokken zijn bij TLE en in in vitro TLE onderzoek⁷daarom regelmatig werkzaam zijn.

Inbeslagneming-achtige activiteit kan acuut worden veroorzaakt in plakjes van de hersenen door het veranderen van de Ionische samenstelling van de kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF), zoals het verminderen van magnesium terwijl het verhogen van kalium^8,9,10, of door middel van farmacologische manipulaties, zoals het blokkeren van remmende GABAergic activiteit (Zie¹¹ voor een algehele herziening). Deze modellen zijn echter gebaseerd op de eenzijdige wijziging van excitatie en inhibitie; ze staan dus geen bestuderen de interactie en de gezamenlijke bijdrage van excitatory en remmende netten te ictogenesis. Continue perfusie van segmenten van de hersenen met de convulsant drug-4AP verbetert zowel de excitatory als de remmende transmissie, waardoor acute ictogenesis studeren terwijl synaptic activiteit over het algemeen intact¹².

MEA's laten opnemen van de elektrische activiteit door neuronale netwerken uit een groter aantal waarnemingspunten in vergelijking tot conventionele extracellulaire veld potentiële opname, waar ruimtelijke beperkingen beperken het aantal elektroden die kunnen worden gegenereerd ondergebracht op de hersenen segment oppervlak. Bovendien, MEA chips bieden het extra voordeel van bekende tussen elektrode afstand, die erg handig voor trace propagatie is en beoordelen van de reizende snelheid van opgenomen signalen. Hoewel oorspronkelijk ontworpen voor opname van beschaafde neuronen^13,14, worden MEA's nu ook gebruikt te karakteriseren de elektrofysiologische kenmerken van acute hersenen segmenten knaagdieren¹⁵ en mens¹⁶verkregen. Dus, in het kader van epilepsie onderzoek, MEA's vertegenwoordigen een waardevol instrument voor het lokaliseren van interacties van de neuronale netwerken de kern van ictogenesis^16,17,18.

MEA opname draagt echter inherent technische uitdagingen in de verkrijging of het behoud van een stabiele epileptiform patroon in heel lang (enkele uren) experimentele protocollen. Eerst, weefsel oxygenatie kan niet toereikend zou zijn binnen de grote en ronde ondergedompeld-type opname kamer^19,20 typische van verkrijgbare MEAs, terwijl arme signal-to-noise verhouding en temperatuur instabiliteit kunnen beïnvloeden de kwaliteit van de opname wanneer een hoge perfusie-tarief (6-10 mL/min) wordt gebruikt voor het verbeteren van de zuurstoftoevoer naar de hersenen-segment (zie bijvoorbeeld de technische opmerkingen over verwarming en perfusie apparatuur²¹). Tweede, terugkerende lozingen met hoogfrequente componenten, zoals epileptiform de lozingen, worden nauwelijks nageleefd bij het gebruik van ondergedompeld-type opname kamers¹⁹; Dit is met name het geval wanneer de acute epileptiform-patroon chemisch geïnduceerde is en ephaptic mechanismen omvat, zoals het geval voor de 4AP model²² (Zie¹¹ voor een uitgebreid overzicht). Om deze beperkingen te overwinnen, hebben onderzoekers verschillende strategieën voorgesteld. Bijvoorbeeld, zijn de perfusie tarief^19,20 te verhogen terwijl het verminderen van de hersenen segment dikte (≤300 µM) en gebied^17,18 cruciale factoren voor het bereiken van onvoldoende zuurstoftoevoer naar het weefsel. Verbeterde hersenen segment levensvatbaarheid kan daarnaast ook worden bereikt door gebruik te maken van geperforeerde MEA's (pMEAs), waardoor het hersenweefsel van beide zijden¹⁸zoogdierlevercellen.

Overwegende dat de beschreven aanpak aanzienlijk verbeterd de haalbaarheid van MEA opnemen vanaf de hersenen segmenten, ze zijn niet getest tegen verlengd (enkele uren) opnemen en elektrische stimulatie sessies, de laatste vertegenwoordigen een aanzienlijke stress voor het hersenweefsel. Langdurige opnamesessies kunnen worden verplicht te bestuderen van de evolutie in de tijd van de specifieke kenmerken van de epileptiform patronen die zou niet mogelijk zijn te ontmaskeren door op korte termijn metingen. In het kader van de DBS onderzoek, langdurige experimentele protocollen mogelijk moet evalueren en vergelijken van de effecten van verschillende stimulatie paradigma's in het zelfde segment van de hersenen.

Wanneer alleen spontane elektrische activiteit worden geregistreerd moet, in kaart brengen van de elektroden met betrekking tot de ROI gebeurt meestal a posteriori, dat wil zeggen, tijdens de analyse van de gegevens; in plaats daarvan, de studie van evoked reacties of elektrische neuromodulatie paradigma's vereist dat stimulatie worden afgeleverd aan specifieke ROI(s), de noodzaak van snelle en gemakkelijke live elektrode toewijzing tijdens het experiment te dicteren.

We illustreren hier, een eenvoudige experimentele protocol waarmee voor inductie en onderhoud van een stabiele 4AP-geïnduceerde epileptiform patroon in volwassen knaagdieren hersenen plakjes. De waargenomen activiteit weergave getrouwe van de elektrofysiologische kenmerken van dit model zoals gekenmerkt met behulp van conventionele extracellulaire electrofysiologie technieken. Het aantal uur of langer aanhoudt en outlasts aanhoudende elektrische stimulatie voor herhaalde langdurige tijdperken. De kamers gebruikt om te handhaven en uit te broeden van de segmenten van de hersenen kunnen worden gemakkelijk gemonteerd met behulp van standaard laboratorium benodigdheden (figuur 1A) Overwegende dat een aangepaste opname kamer waardoor optimale oplossing wisselkoers en laminaire flow (figuur 1B) worden verkregen uit commerciële bronnen of met behulp van 3D-printing technologie tegen een betaalbare prijs. Snelle toewijzing van de ROI(s) voor real-time bewaking en voor de selectie van stimulerende elektroden wordt mogelijk gemaakt door een aangepaste gebruikersvriendelijke GUI met de naam mapMEA, vrij beschikbaar op aanvraag.

Figuur 1: aangepaste apparatuur die wordt gebruikt voor dit protocol. (A) het bedrijf kamers voor herstel, vooraf opwarming van de aarde en pre-incubatie in 4AP worden geassembleerd met behulp van een bekerglas en een petrischaal. De petrischaal moet kleiner in diameter dan de breker en is op zijn plaats gehouden door middel van een zuiger van de spuit. De onderkant van de petrischaal wordt vervangen door een nylon gaas (van zachte kousen) gelijmd met cyanoacrylaat op de rand van de petrischaal. Zuurstof wordt geleverd via een gebogen wervelkolom naald 22 G, ingevoegd tussen de muren van de petrischaal en het bekerglas. Bubbels moeten tekenen van de kant van het bekerglas en nooit bereiken de nylon gaas om te voorkomen dat hersenen segment verplaatsing. De bovenkant van een petrischaal kan worden gebruikt als een deksel te voorkomen ACSF verdamping en handhaven van zuurstof saturatie. (B) aangepaste opname kamer. in: inlaat reservoir aan de canule verwarming en de referentie-elektrode. uit: outlet reservoir aan de zuiging naald. rec: opname kamer. (C) glas Pasteur Pipet, gekruld door brand-polijsten, gebruikt voor het behandelen van het weefsel en haar positie binnen de kamer opnemen aanpassen. (D) aangepaste segment hold-down anker. (E) de eindmontage van de opname-kamer op de MEA-chip gemonteerd. Een segment van de hersenen ligt op de bodem op zijn plaats gehouden door het anker. De rode pijl geeft de PTFE-buis die betrekking hebben op de canule Verwarming, overwegende dat de rode cirkel geeft aan de referentie-elektrode, een verzadigde KCl pellet ondergedompeld door ACSF in het inlaat-reservoir dat. De blauwe pijl geeft de zuig naald in het outlet-reservoir. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van gezondheid (vergunning n. 860/2015-PR) in overeenstemming met de EU richtlijn 2010/63/EG inzake dierenwelzijn.

1. voorbereiding van de vergadering van MEA/aangepaste kamer

Opmerking: Begint 2 dagen voordat het experiment. Gebruik een MEA zonder een ring (Zie Materialen tabel).

1. Reinig de MEA (duur: 35-40 min).
   1. Los een enzymatische cleaner poeder in warme gedestilleerd water. Borstel de warme schoonmaakvloeistof MEA oppervlak dan de MEA genieten in de warme schoonmaakvloeistof voor ten minste 3 uur.
   2. Spoel de MEA grondig met gedestilleerd water en droog het met behulp van een pluisvrije neen-kras weefsel.
2. Monteren van de MEA met de opname-kamer (duur: 10 minuten + overnachting).
   1. Gelijkmatig het elastomere afdichtmiddel op het oppervlak van de bodem van de kamer van de opname. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen.
   2. Monteren van de kamer van de opname op de MEA met behulp van een pincet en zachte druk uitoefenen. Als er bubbels, beweeg licht de kamer in een cirkel terwijl het toepassen van zachte druk met de vingers totdat alle bellen zijn verdwenen. Het verspreiden van een laag sealant helemaal rond de buitenste rand van de kamer van de opname.
      Opmerking: kritische! Hebben geen betrekking op de MEA contacten met het afdichtmiddel.
   3. Plaats de MEA/kamer vergadering binnen een 15 cm petrischaal. Plaats een 5 mL petrischaal of een 10 mL-bekerglas gevuld met gedestilleerd water dichtbij de MEA. Alles om te houden van een vochtige omgeving omvatten. Uitharding bij kamertemperatuur 's nachts laat.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
3. Coat de MEA zodat het hydrofiele (duur: 5-10 min + overnachting).
   1. Plaats de MEA in een 15 cm petrischaal. Giet 50 µL van poly-D-lysine op het gebied van MEA opname. Sluit de petrischaal, zegel met het afdichten van film en 's nachts bewaren bij 4 ° C.
   2. Spoel de MEA grondig met behulp van gedestilleerd water en bewaar de MEA bij 4 ° C in gedestilleerd water.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Gecoate MEA's kunnen worden opgeslagen en opnieuw gebruikt voor verschillende experimenten. Regelmatig reinigen en opnieuw coating de MEA helpt verwijderen van weefsel puin en signal-to-noise verhouding te verbeteren.

2. voorbereiding van de stamoplossingen

Opmerking: 1 dag voor het experiment starten (duur: ~ 2 h). Stamoplossingen helpen versnellen het experiment op de experimentele dag. Ze kunnen worden voorbereid en opgeslagen. Zie tabel 1 voor concentratie factor en samenstelling. Zie tabel 2 voor de samenstelling van de definitieve oplossing.

1. Los van de chemische stoffen in gedistilleerd water op kamertemperatuur. Filteren van de voorraadoplossingen met een filter fles (Filterdiameter: 0,22 µm).
2. Bewaren bij 4 ° C (zie tabel 1 voor aanbevolen maximale opslagtijd).
   Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

3. voorbereiding van de Agar

Opmerking: 1 dag voor het experiment starten (duur: ~ 1 h).

1. Schenk 250 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 500 mL en start roeren van 350 toeren per minuut. Voeg toe 5 g agar en wacht totdat het volledig is opgelost.
2. Verwarm de oplossing bij 250-300 ° C. Laat het water verdampen totdat de oplossing ~ 200 mL is tot het opleveren van een 2,5% w/v agar oplossing.
   Opmerking: Moet de temperatuur hoog genoeg is om te laten water verdampen zonder borrelen.
3. Giet de oplossing van de agar op een plastic vierkant doosje 200 mL van ~1.5 cm hoge muren en laat het afkoelen bij kamertemperatuur totdat het stevig wordt.
4. Het vak dekking en op te slaan bij 4 ° C. Het blok van de agar is goed voor enkele weken.
   Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

4. voorbereiding van de bevroren vliegtuig

Opmerking: Begin 1 dag voor het experiment.

1. Vul een flat-onderkant roestvrij staalkom met gedestilleerd water tot 0,5 - 1 cm onder de rand.
2. Bewaren bij-20 ° C's nachts.

5. bereiding van neuroprotectieve snijden ACSF

Opmerking: Start 1 dag voor het experiment of dezelfde dag van het experiment (Zie tabel 1 en tabel 2) (duur: 30 min).

1. Giet 200 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 500 mL en start roeren met een magneetroerder van 350 toeren per minuut.
2. Voeg 50 mL voorraad B en 50 mL voorraad C (Zie tabel 1).
3. 3 mM pyrodruivenzuur, sacharose voor 208 mM, 10 mM D-glucose en 1 mM L-ascorbinezuur zuur toevoegen.
   Opmerking: Het werkelijke volume van pyrodruivenzuur hangt af van de dichtheid en de zuiverheid en variëren met de batchverwerking. Altijd het vereiste volume te berekenen bij het openen van een nieuwe partij.
4. Bedek met het afdichten van film en laat roer gedurende 30 min.
5. Breng de oplossing kwantitatief over in een volumetrische maatkolf van 500 mL en Voeg gedistilleerd water te vullen van de kolf.
6. Verzegel de maatkolf met het afdichten van de film en voorzichtig omkeren 3 - 5 keer totdat de oplossing gelijkmatig helder is.
7. Breng het snijden ACSF in een glazen fles met dop.
8. Opslaan van het snijden ACSF bij-80 ° C gedurende 20-30 min of bij 4 ° C's nachts te koelen tot 4 ° C.
   Opmerking: Het protocol kan worden gepauzeerd hier indien de voorkeur wordt 's nachts koeling. Anders de tijd die nodig is voor koeling van het snijden ACSF kan worden gebruikt voor het nastreven van stap 6.

6. bereiding van het bedrijf ACSF

Opmerking: De oplossing vers bereiden op de dag van het experiment (duur: 5-10 min). Het bedrijf ACSF worden gebruikt voor het spoelen van de segmenten van de hersenen van de stek ACSF tijdens de segmenteringshulplijnen procedure (zie stap 8.16) en voor hersenen segment langetermijnopslag en vooraf opwarming van de aarde. Om de spoel van de segmenten van de hersenen, is 100 mL van het bedrijf ACSF voldoende. De kamers van het bedrijf en vooraf opwarming van de aarde gebruikt in dit protocol zijn op maat gemaakt en bevatten een volume van 300 mL en 100 mL, respectievelijk (Zie figuur 1A). Met deze instelling is 500 mL bedrijf ACSF voldoende. Chambers verkregen uit commerciële bronnen kan het bevatten van een ander volume, in die geval de totale hoeveelheid van de holding ACSF worden voorbereid moet dienovereenkomstig worden aangepast.

1. Giet 200 mL gedestilleerd water in een maatkolf van 500 mL.
2. Voeg 50 mL voorraad A, 50 mL voorraad B en 6,5 mL voorraad M 1 mM L-ascorbinezuur. Zachtjes doorroeren met behulp van roterende bewegingen tot L-ascorbinezuur, is volledig opgelost.
3. Voeg gedistilleerd water te bereiken van het uiteindelijke volume, verzegelen de maatkolf met het afdichten van de film, en voorzichtig omkeren 3 - 5 keer totdat de oplossing gelijkmatig helder is. Raadpleeg tabel 2 voor het bedrijf ACSF samenstelling.

7. voorbereiding van de experimentele bankjes

Opmerking: Dit vereist 15 min, plus 30 min te verkrijgen van een constante temperatuur van het warme bad.

1. Opname Bank
   1. Start de warm bad, stel deze in op 32 ° C, en bedek het om te houden van de temperatuur.
      Opmerking: Het warme bad in dit protocol gebruikt kan worden op maat gemaakt met behulp van een hard plastic doos en een aquarium thermostaat vooraf ingesteld op de gewenste temperatuur. Constante gewenste temperatuur kan worden bereikt in ~ 30 min. vanaf kamertemperatuur. Sinds de pre opwarming van de aarde en drachtige kamers aan de onderkant van de plastic doos zitten, moet het water niveau net genoeg ter dekking van de thermostaat om te houden van de kamers van het drijvende.
   2. Monteren van het bedrijf en de vooraf opwarming van de aarde kamers (Zie figuur 1A), en giet het bedrijf ACSF in hen. Het bedrijf kamer houden bij kamertemperatuur en plaats van de vooraf opwarming van de aarde kamer binnen het warme bad. Start de oplossingen met 95% O₂/5% CO₂ gasmengsel borrelen en verwijder elke gevangen bubbels met behulp van een precisiepipet Pasteur omgekeerde. Overdekte houden.
2. Snijden van Bank- en vibratome
   1. Lijm een kleine agar blok in het midden van de schijf van de monster met behulp van Cyanoacrylaat lijm.
   2. Een bekerglas van 250 mL gebracht een ijsemmer en giet ACSF erin te snijden.
   3. Neem twee bekerglazen van 100 mL en giet 50 mL van het ACSF in elk bedrijf. Laat de bekers bij kamertemperatuur. Dit zijn de spoeldouche bekers.
   4. Start de oplossingen met een mengsel van 95% O₂/5% CO₂ gas borrelt.
   5. Monteren van de buffer-lade op de vibratome en surround met crushed ijs. Giet wat ethanol op de crushed ijs om te helpen bij het handhaven van koude temperaturen tijdens de segmenteringshulplijnen procedure. Na het gieten ethanol, toevoegen meer ijs zo nodig.
      Opmerking: Een temperatuur van 2 ° C is optimaal.
   6. De waterpijp in de buffer lade, plaats dan assembleren en monteren van het blok van de blade vibratome.
      Opmerking: Zorg ervoor dat het blad is gemonteerd in de hoek van de klaring van ~ 10°.
   7. Crushed ijs in een bekerglas van 500 mL opgemaakt tot 2/3 van het volume en de opvulling met gedestilleerd water.
   8. Neem de bevroren kom uit de vriezer, plaats het ondersteboven op de segmenteringshulplijnen Bank, en bedek het met een papieren handdoek en een filtreerpapier schijf.
3. Anesthesie Bank
   1. Leg een schaaltje in een bakje ijs gevulde en giet ACSF snijden in het. Start met een mengsel van 95% O₂/5% CO₂ gas borrelt.

8. brain Slice voorbereiding en onderhoud

Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van volwassene (4 - 6 weken oud) mannelijke CD1 muizen, maar andere stammen (bijvoorbeeld, c57/bl6^17,18) kunnen worden gebruikt. Wij vergelijken ook later de experimentele output verkregen met behulp van de muis hersenen segmenten met dat leverde door hersenen segmenten verkregen mannelijke Sprague-Dawley ratten van dezelfde leeftijd. Volgt verwijzen naar de voorbereiding van gedeeltelijk verbroken hersenen segmenten waarin CA3-gedreven snel the-achtige activiteit aan de juiste hippocampus is ingetogen en kan niet doorgeven aan de parahippocampal cortices, als beschreven in²³. Hippocampus-cortex afsluiting is een vereiste om te elektrische modulatie studie in het gebruik van de hippocampus-EG hersenen segment voorbereiding. De vibratome gebruikt refereert aan het model vermeld in de Tabel van de materialen. Andere modellen kunnen vereisen een andere procedure.

1. Anesthetize het knaagdier Isofluraan met 5% in een carbogen gas mengsel geleverd aan een verdoving inductie kamer op 2 L/min.
2. Onder diepe verdoving (geen reflexen in reactie op de voet en poten knijpen), uittreksel van de hersenen binnen 1 min volgens standaard procedures zoals in²³. Plaats van de hersenen in de kleine kom met geëquilibreerd ijskoude snijden ACSF en laat chill voor 90-120-s.
   Opmerking: Laat niet de hersenen chill voor te lang, anders het vastlopen.
3. Giet het ijskoude snijden ACSF in de lade van de buffer. Verspreid snijden ACSF op het papier van de filter geplaatst op de bevroren kom. Plaats van de hersenen op het koffiefilter en isoleren van de vereiste hersenen weefsel blok door het verwijderen van het cerebellum en de frontale paal snijden van rechte.
4. Met de hulp van een gebogen spatel, lijmt u de dorsale kant van de hersenen op de schijf van het exemplaar met de gesneden frontale zijde naar het agar-blok en de occipital paal geconfronteerd met het blad van de vibratome. Gebruik een dun laagje Cyanoacrylaat lijm. Plaats het specimen-disc in de lade van de buffer onmiddellijk en veilig.
5. Pas de vectorafbeeldingsbestanden aan zodat het bewegen van het blad vibratome helemaal over het weefsel tot het agar-blok. De specimen schijf hoogte te bereiken van het niveau van de mes met de hersenen weefsel blok aangepast.
6. Negeren van de weefselsecties totdat de hippocampus duidelijk zichtbaar is (meestal ~ 900 µm). Vervolgens stelt u de dikte van een segment van 400 µm en start snijden als u wilt behouden de weefselsecties. Voor elke sectie van de hersenen splitsen de twee hemisferen en snijd het geen onnodige weefsel om te verkrijgen van twee segmenten van de hersenen. Als de buffer-lade is verhoogd tijdens latere secties, vul de buffer lade lodgment met iced gedestilleerd water (zie stap 7.2.7).
7. Gebruik een omgekeerde Pasteur pipet zachtjes overbrengen van de segmenten van de hersenen in de eerste spoeldouche bekerglas, legen van de Pipet van Pasteur en overbrengen van de segmenten van de hersenen naar het tweede spoeldouche bekerglas. Dan, breng de segmenten van de hersenen in de zaal van het bedrijf en laat ze herstellen voor ten minste 60 min.
   Opmerking: Het is meestal mogelijk te verkrijgen van 6-8 hersenen segmenten algemene. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

9. voorbereiding van de ACSF met 4-AP (4AP-ACSF)

Opmerking: Dit vereist 10 min. voor voorbereiding, plus 20 min van opwarming van de aarde. Let op! 4-AP is een convulsant drug, en het is giftig. Hanteren met handschoenen en Vermijd morsen.

1. Giet 200 mL gedestilleerd water in een maatkolf van 500 mL.
2. Voeg 50 mL voorraad A, voorraad B 50 mL, 5 mL voorraad M en 1 mM L-ascorbinezuur. Zachtjes doorroeren met behulp van roterende bewegingen tot de L-ascorbinezuur, is volledig opgelost.
3. Voeg 500 µL van 4AP voorraad.
4. Voeg gedistilleerd water te bereiken van het uiteindelijke volume, verzegelen de maatkolf met het afdichten van de film, en voorzichtig omkeren het 3 - 5 keer totdat de oplossing gelijkmatig helder is.
5. Monteren van de drachtige zaal van 4AP (Zie figuur 1A) en giet ~ 80 mL van 4AP-ACSF in het. Dekking van de zaal, over te brengen naar het warme bad en start borrelen met een gasmengsel voor 95% O₂/5% CO₂ . Verwijder eventuele gevangen bubbels met behulp van een precisiepipet Pasteur omgekeerde. Overdekte houden.
6. Wacht tot de temperatuur van de 4AP-ACSF 30-32 ° C (~ 20 min).
   Opmerking: Het protocol kan worden gepauzeerd hier als hersenen segmenten nog steeds herstellende is zijn.

10. pre opwarming van de aarde en incubatie van segmenten in 4AP (duur: 90 min)

1. Controleer of de vooraf opwarming van de aarde ACSF en de 4AP-ACSF-temperatuur is 30-32 ° C.
2. Gebruik een omgekeerde glazen pipet van Pasteur Pipetteer 1 segment van de hersenen in de kamer vooraf opwarming van de aarde en laat de rest van de weefsel voor 25-30 min. Vervolgens breng het segment van de hersenen in de drachtige kamer van 4AP-ACSF en laat het rusten voor 60 min.

11. bereiding van de MEA Set-up

Opmerking: Start 15 min voordat u gaat opnemen.

1. Breng de resterende hoeveelheid 4AP-ACSF in een 500 mL conische kolf.
2. Plaats de erlenmeyer op een plank boven de MEA versterker en buizen gebruiken om de oplossing te voortdurend voeden een injectiespuit 60 mL. Pas de hoogte van de kolf en de spuit om een zwaartekracht-gevoed tarief van 1 mL/min.
   Opmerking: De juiste hoogte hangt de binnendiameter van de buis (ID). Voor buis van 5/32 inch ID volstaan 30 cm.
3. Start de 4AP-ACSF in de erlenmeyer en in de spuit met een mengsel van 95% O₂/5% CO₂ gas borrelt.
4. Laat de 4AP-ACSF stroom door de buis van de perfusie in een bekerglas tot er is geen lucht in; dan stoppen met de stroom van de oplossing.
5. Het verwarmingselement aan de basis van MEA verbinden met de thermostaat. Plaats de droge MEA-chip in de MEA versterker en de versterker hoofd veilig. Gebruik een plastic pipet van Pasteur 4AP-ACSF overbrengen naar de inlaat en de buitenste reservoir van de kamer van de opname.
6. Beveiligen van de canule verwarming aan een magnetische houder en plaats de tip binnen de opname kamer perszijde; de Magneethouder hechten aan een magneetstrip op de MEA versterker hoofd; de perfusie-buizen verbinden met de canule; Sluit de canule aan de thermostaat.
   Opmerking: De verwarming canule moet worden gedekt door de afgeschuinde polytetrafluorethyleen (PTFE) buizen te bereiken de opname zaal perszijde en tot een minimum beperken van lawaai als gevolg van de metaalachtig materiaal van de canule. Wanneer het reservoir van de inlaat is voldoende gevuld met 4AP-ACSF, moeten druppels vallen uit de perfusie-systeem niet zichtbaar zijn.
7. De zuiging naald binnen het reservoir en controleer of er negatieve druk door de zuigkracht naald ondergedompeld in de ACSF; Controleer voor een constante zuigkracht laagfrequent geluid.
   Opmerking: De zuig naald moet worden geplaatst zodat de 4AP-ACSF te stromen net boven de hersenen segment oppervlak. Een vacuüm lijn of een geluidsarme vacuüm pomp kan worden gebruikt.
8. De regulator van de stroom te maken een debiet van 1 mL/min en start zoogdierlevercellen instellen
   Opmerking: Gravity-gevoed perfusie elimineert het lawaai dat kan worden veroorzaakt door peristaltische pompen; Als peristaltische pompen voorkeur zijn, zijn geluidsarme modellen verplicht.
9. Zodra 4AP-ACSF via de canule stroomt, zet de thermostaat. De canule verwarming tot 37 ° C en de MEA base tot 32 ° C te bereiken een temperatuur van 32-34 ° C in de zaal van de opname instellen
   Opmerking: Let op! Nooit warmte de canule zonder oplossing in het of het onherstelbaar beschadigd. Stel de temperatuur van de canule hoger dan de opname temperatuur (dat wil zeggen, 32-34 ° C) aan bij de intrinsieke temperatuur gecompenseerd tussen de ingestelde waarde en de werkelijke waarde aan het uiteinde van de canule verwarming en in de vergaderzaal van de opname. De stroomsnelheid, omgevingstemperatuur en volume van de opname kamer alle invloed van de temperatuur van de oplossing voor het opnemen. De instellingen die zijn gemeld in stap 11,9 zijn geoptimaliseerd voor het beschreven protocol en apparatuur. Altijd Controleer de temperatuur van de opname met behulp van een thermokoppel en pas de instellingen indien nodig. Niet verhit de MEA base boven 34 ° C om oververhitting van het segment van de hersenen.
10. Plaats de externe referentie-elektrode in het opname reservoir voor de inlaat van de kamer.
    Opmerking: Hoewel MEA chips zijn uitgerust met een interne referentie-elektrode, valt dit door de aangepaste opname-kamer. Dus, een externe referentie-elektrode moet worden gebruikt. Een verzadigde KCl pellet is de meest praktische, aangezien het klaar is voor gebruik zonder noodzaak van chloor.

12. MEA Live koppelen

1. Zodra de 4AP-ACSF-niveau en de temperatuur van de opname is gestabiliseerd als gewenst, draai de perfusie en de zuiging kranen in de uit-stand tijdelijk stoppen met hen.
   1. Breng snel een deel van de hersenen naar de zaal van de MEA opname met behulp van een omgekeerde glazen pipet van Pasteur. Haar positie op het gebied van MEA opname als nodig met behulp van een brand-gepolijst gekrulde Pasteur Pipet (Figuur 1 c) of een zachte compacte kleine borstel aanpassen. Plaats het hold-down-anker (Figuur 1 d) op het segment van de hersenen. Herstart de perfusie en de zuiging door hun kranen draaien terug naar de aan-positie.
      Opmerking: kritische! Het segment moet worden overgeheveld en de perfusie opnieuw gestart binnen 60 s of het weefsel zou sterven. Het segment hold-down anker moet worden bewaard in 4AP-ACSF om te voorkomen dat de hersenen segment verplaatsen terwijl de plaatsing van het anker op het segment van de hersenen als gevolg van verschillen in oppervlakkige spanning. Het anker teneinde het segment van de hersenen naar de MEA kan op maat met behulp van roestvrij staal draad en nylon draad (Figuur 1 d) of verkregen uit commerciële bronnen. Figuur 1E toont de laatste experimentele opstelling met de MEA chip op de versterker van hoofd aangesloten: een segment van de hersenen rusten op de MEA-chip in de vergaderzaal van de opname door het aangepaste anker ingedrukt wordt gehouden. De referentie-elektrode (rode cirkel) en de PTFE slang die betrekking hebben op de verwarming canule (rode pijl) zijn geplaatst in het inlaat reservoir, overwegende dat de zuiging naald (blauwe pijl) bevindt zich in het outlet-reservoir.
2. Maak een foto van het segment van de hersenen met behulp van een camera gemonteerd op een omgekeerde Microscoop stadium.
3. Het script mapMEA uitvoeren op de computersoftware om te starten van de GUI om toe te wijzen van de elektroden.
   Opmerking: De op maat gemaakte software kan de gebruiker selecteren de elektroden die correspondeert met specifieke structuren van de hersenen-segment. Deze stap is cruciaal voor het activeren van de juiste route en Ictale activiteit onderdrukken met behulp van elektrische stimulatie.

Fig 2: GUI voor live MEA elektrode toewijzing. (A) Schematische weergave van het segment van de gecombineerde hippocampus-EG gepositioneerd op de MEA. De structuren van de standaard gebruikt voor dit protocol zijn cornu ammonis 3 (CA3), de enthorinal cortex (EG), de perirhinal cortex (PC), en subiculum (SUB). De referentie-elektrode is geschematiseerde als een driehoekje. Elektroden omcirkeld in gestippelde lijnen vertegenwoordigen de XY-coördinaten van de afbeelding strekken. (B) Screen capture van de GUI tijdens de live MEA-toewijzing. Het stroomschema aan de linkerkant van de opname toont u de stapsgewijze procedure te volgen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

4. Klik op de knop Bladeren om het laden van de afbeelding van het segment van de hersenen. Zorg ervoor dat de referentie-elektrode wordt weergegeven in de bovenste rij van de half-linkerzijde van de MEA (figuur 2A, driehoek markeren). Klik op de knop Aanwijzer activeren en selecteer vervolgens de boven- en onderkant elektroden in de meest linkse rij van de matrix ter gelegenheid van de XY-coördinaten van de afbeelding rechttrekken en elektrode toewijzing.
5. Het SegmentType drop-down menu Selecteer horizontale. Vink de checkbox standaard structuren .
   Opmerking: Het is mogelijk om de structuren aanpassen door op de knop Nieuwe structuren invoeren . De standaard-structuren voor het segment van de horizontale hersenen zijn afgebeeld in figuur 2A.
6. Met behulp van de genummerde drukknoppen onder de hersenen segment afbeelding, selecteert u de elektroden die overeenkomt met de ROI en klikt u op de corresponderende knop in het deelvenster structuren te wijzen hen (figuur 2B); Herhaal deze stap voor elke ROI.
7. Druk op de knop Opslaan : de software genereert een resultaat-map met de naam #EXP_LabelledElectrodes met een tabel rapportage van de geselecteerde elektroden en ROIs.

13. opname en elektrische modulering van de Epileptiform-activiteit

1. Het toestaan van het segment van de hersenen te stabiliseren in de vergaderzaal van de opname voor 5-10 min voordat u gaat opnemen.
2. Inschakelen van de stimulus eenheid ten minste 10 min voordat het protocol van de stimulatie om zelf kalibratie en stabilisatie. Start de software van de controle van de stimulus en controleer of dat stimulator en MEA versterker correct zijn aangesloten zoals aangegeven door een groene LED in het hoofdpaneel van de software van de controle van de stimulus. Raadpleeg de gebruiksaanwijzing van de specifieke instrumenten en software voor meer informatie, Zie Tabel van de materialen.
3. Instellen van de stimulatie in bipolaire configuratie. Selecteer elektrode paren in contact met de piramidale cellaag van de CA1/proximale subiculum (cf.^24,25) onder de toegewezen met het script mapMEA (cf. punt 12). Gebruik een draad een van de geselecteerde elektroden op de negatieve stekker van de stimulator en de andere elektrode naar de positieve stekker van hetzelfde stimulator kanaal aansluiten. Gebruik een andere draad op de grond van de versterker aansluiten de grond van de stimulator.
4. Start de opnamesoftware. Verwerven van gegevens, drukt u op de knop afspelen in het hoofdpaneel van de opname-software. Record ten minste 4 Ictale lozingen.
   Opmerking: Een sampling-frequentie van 2 kHz kunt verwerven veld potentials met eerlijke resolutie terwijl het minimaliseren van de harde schijf ruimtegebruik. Een 5-min opnamebestand duurt ~ 80 MB. Hogere samplingfrequenties kunnen worden verlangd, bijvoorbeeldaan record stimulans artefacten of multi-unit activiteit. Gebruik om te observeren veld potentieel alleen, een levende low-pass filter bij 300 Hz te snijden uit meerdere territoriale eenheden activiteit.
5. Het bepalen van de intensiteit van de stimulus.
   1. In de software van de controle van de stimulus, kunt het hoofdpaneel ontwerpen een vierkante tweefase positief-negatief huidige impulstijd van 100 µs/fase.
      Opmerking: Let op! Gelijkstroom stimulatie vereist een evenwichtige gratis puls om te voorkomen beschadiging van de apparatuur.
   2. Een snelle invoer/uitvoer (I/O)-test om te identificeren van de beste stimulans intensiteit worden uitgevoerd. Leveren van de pols van de stimulatie ontworpen bij stap 13.5.1 op 0.2 Hz of lager door het toevoegen van een inter pulsinterval voor 5 s of langer in de juiste vorm van de prikkel besturingssoftware. Voer in het tabblad pulse amplitude de amplitude van een eerste impuls van 100 µA/fase en verhogen met 50-100 µA stappen bij elke proef tot stimulatie betrouwbaar the-achtige gebeurtenissen in de parahippocampal cortices oproepen kan (Controleer de signalen gevisualiseerd door de opname-software).
6. Elektrische modulatie van limbische ictogenesis
7. Programma de eenheid van de stimulans om te leveren van het protocol van de stimulatie van belang. Gebruik de amplitude van de stimulus vastgesteld tijdens de I/O-test.
   Opmerking: Het percentage mislukkingen van evoked reacties moet ≤20%.
8. Na stimulatie stopt, Controleer of netwerk herstel pre stimulans voorwaarde door het opnemen van ten minste 4 Ictale lozingen (zoals in stap 13.4).

Resultaten

Vlakke MEAs met 500 µm elektrode afstand van 6 x 10 indelen en zijn de ideale opname-apparaat voor de experimentele protocol beschreven hier, aangezien hun opname gebied in het segment van de hersenen in zijn geheel omvat (figuur 3A, zie ook¹⁷). Hoewel geperforeerde MEAs (pMEAs) zou wenselijk zijn om weefsel oxygenatie, hun opname gebied is te klein (~ 2 mm doorsnede). Dit laat niet de gelijktijdige visualisatie van elektrische signalen gegenereerd door de hippocampus en de parahippocampal cortices (gegevens niet worden weergegeven; Zie¹⁸).

Getrouwe weergave van de waargenomen 4AP-geïnduceerde epileptiform patroon (figuur 3A) wat wordt meestal waargenomen in deze in vitro -model met behulp van conventionele veld potentiële opname en omvat drie soorten activiteit^{7, 26}: (ik) Ictale-achtige evenementen (figuur 3B, pijlpunten) zijn robuuste langdurig (> 20 s, bereik: 20-60 s) evenementen die lijkt op de electrographic kenmerken van inbeslagneming activiteit met tonic en klonische onderdelen (Figuur 3 c); ze zijn gegenereerd binnen de cortices van de parahippocampal elke 3-5 min en voer opnieuw in de hippocampal formatie via de getand gyrus (3D figuur, pijl); (ii) langzaam the-achtige lozingen (figuur 3B, EG trace, zwarte balk; uitgebreide in de 3E figuur) zijn kort (< 1 s) bevolking gebeurtenissen gegenereerd tussen Ictale gebeurtenissen overal binnen de hippocampus-EG hersenen segment voorbereiding en optreden bij een traag tempo (bereik 10-30 s); (iii) snelThe-achtige lozingen (figuur 3B, CA3 traceren, zwarte balk; uitgebreid in de 3E figuur) zijn terugkerende korte (< 1 s) bevolking gebeurtenissen die worden gegenereerd door de CA3 hippocampal subveld; Wanneer de Collaterals Schaffer worden bewaard, snel CA3-gedreven interictale gebeurtenissen verspreiden langs de hippocampal lus en oefenen van een anti-ictogenic effect²⁴ (gegevens niet worden weergegeven); om te voorkomen dat Ictale activiteit vervallen, met het oog op de beschreven protocol, CA3 uitvoer wordt verstoord (vgl. figuur 3B, E). Het moet worden opgemerkt dat de opgenomen met behulp van multilaterale milieu-akkoorden snel CA3-gedreven interictale activiteit in een langzamer tempo plaatsvindt (~ 0.4 Hz) dan wat is waargenomen met behulp van conventionele veld potentieel opname met glas pipetten (~ 1 Hz, bereik: 0,5 - 2,0 Hz, gegevens niet worden weergegeven).

Het welslagen van elektrische neuromodulatie in knaagdier hersenen plakjes hangt af van de activering van bepaalde neuronale trajecten²⁷ samen met de intrinsieke connectiviteit tussen de regio's opgenomen in de voorbereiding²⁴. We hebben getest segmenten verkregen volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten en CD1 muizen en we hebben die muis gevonden in plaats van de rat hersenen segmenten bieden de beste trade-off tussen grootte, dikte en intrinsieke connectiviteit. Eerst, dankzij hun kleiner grootte, passen zij het kleine opname-gebied van verkrijgbare MEAs beter (figuur 4A, links: rat, rechts: muis); Ten tweede, ze zijn veerkrachtiger te nadelig voorwaarde dat inherent is aan MEA opnemen (Zie Inleiding): Hoewel Ictale-achtige lozingen gegenereerd door deze twee weefsels (figuur 4B) zijn van vergelijkbare duur ()4C van de afbeelding links), hun tarief van voorkomen is aanzienlijk korter in muis hersenen plakjes (n = 10 segmenten elke soort; 2-tailed ongepaarde t-test, p < 0.001; 4C van de figuur rechts). De laatste laat versnelling de experimentele protocollen, waardoor het mogelijk is om te testen van een groter aantal segmenten van de hersenen tijdens een experimentele dag: voor deze set van representatieve resultaten, kunnen we een vergelijkbaar aantal hersenen segmenten van de twee soorten testen (rat: n = 58; muis: n = 52), maar het aantal muizen (n = 18) 2-fold kleiner was dan het aantal ratten (n = 42).

Bovendien, muis hersenen segmenten lijken te presenteren met dichtere verbindingen en zijn daarom meer waarschijnlijk beter te reageren op de aanhoudende elektrische neuromodulatie (Figuur 4 d). Dus, in deze in vitro model van ictogenesis, de levensvatbaarheid voor elektrische stimulatie gericht op het beheersen van Ictale activiteit is aanzienlijk groter voor muis dan voor rat hersenweefsel. Dit aspect komt ook tot uiting door het aanzienlijk hoger slagingspercentage van stimulatie experimenten uitgevoerd met behulp van de muis ten opzichte van de rat hersenen segmenten zelfs bij het nastreven van verschillende protocollen van de aanhoudende stimulatie ()figuur 4E). In feite, lijkt muis hersenweefsel beter weerstaan duurzame elektrische stimulatie zoals voorgesteld door de hogere overlevingskans binnen de geteste experimentele-tijdsbestek van 4 h (figuur 4F). Dus, het kleinere formaat samen met het beter behoud van de intrinsieke connectiviteit maakt muis hersenen segmenten de beste kandidaat voor het uitvoeren van MEA opname gericht op hippocampal-parahippocampal netwerk interacties te bestuderen en te evalueren elektrische Neuromodulatie protocollen die relevant voor TLE zijn.

Periodieke pacing geleverd in de CA1/subiculum is bekend dat de controle van limbische ictogenesis in de 4AP behandelde hippocampus-EG segment voorbereiding^24,25,27, met 1 Hz als de meest effectieve frequentie²⁷. Dus, het is ook nuttig als positieve controle om te evalueren van de doeltreffendheid en de doelmatigheid van het beleid van andere neuromodulatie (zie bijvoorbeeld²⁵). Zoals hierboven vermeld, elektrische pulsen geleverd rechtstreeks via de MEA (dat wil zeggen, zonder de noodzaak van een externe stimulerende elektrode) bevolking reacties in knaagdier hersenweefsel kunnen oproepen (Zie ook²⁸). Voldoende behoud van neuronale netwerkconnectiviteit binnen het segment van de hersenen, nauwkeurige positionering van het segment van de hersenen naar de MEA, en de juiste keuze van de stimulerende elektrode paren kunnen nastreven van elektrische neuromodulatie experimenten die effectieve controle over ictogenesis. Zoals aangetoond in figuur 5A, is het mogelijk om te reproduceren de canonieke 1 Hz periodieke pacing protocol gebruikt vlakke multilaterale milieu-akkoorden als een opname én als een stimulerende apparaat, met het extra voordeel dat het effect van elektrische stimulatie kan worden gevisualiseerd in de hersenen weefselsectie met een groter aantal gelijkelijk verdeelde waarnemingspunten in vergelijking tot de conventionele veld potentiële opname. Figuur 5B toont de kwantificering van de resultaten voor n = 9 segmenten van de hersenen, die een aanzienlijke vermindering van de totale tijd (totale Ictale activiteit duur/observatie tijd²⁵) tijdens de stimulatie inbeslagneming aangeeft (één manier-ANOVA, F(df): 6.84(2), p < 0,01, Fisher's LSD post hoc test, beschermd). De resultaten zijn in overeenstemming met de literatuur voor externe stimulerende elektroden^24,25.

Voor het berekenen van het totaal voor het overnemen van tijd, de tijd van de waarneming is afhankelijk van het interval tussen Ictale gebeurtenissen, en bepaalt tevens de minimale duur van de stimulatie-protocol moet de effecten van neuromodulatie vol vertrouwen te evalueren. Wij vinden dat het opnemen van ten minste 4 Ictale lozingen (en vandaar ten minste 3 intervallen tussen Ictale gebeurtenissen) een goede wisselwerking tussen verzamelde monsters en vereiste afhaaltijd is. In de toestand van het besturingselement (dat wil zeggen, geen stimulatie) is de tijd van de waarneming de lag tussen het begin van de eerste gemeten Ictale gebeurtenis en de beëindiging van de laatste. Tijdens neuromodulatie, de waarnemingsperiode gelijk aan de duur van de prikkel-protocol, aangezien het doel van de meting is te kwantificeren van de verschijnselen die zich voordoen gedurende de tijd waarin de verstoring in het systeem is ingevoerd. Computing en vergelijking van de totale inbeslagneming van tijd in plaats van de duur en het interval van Ictale gebeurtenissen is de meest geschikte parameter te voorkomen van type II fout. In feite, samen met volledige onderdrukking van Ictale activiteit is het ook mogelijk dat slechts één Ictale gebeurtenis wordt gegenereerd tijdens de elektrische stimulatie in tegenstelling tot de diverse gebeurtenissen in de voorwaarde van controle waargenomen. In dit geval, overwegende dat niet mogelijk de interval tussen gebeurtenissen te meten is, vertegenwoordigt meten Ictale duur als een schatter van stimulatie werkzaamheid niet het werkelijke resultaat van neuromodulatie (dat wil zeggen, de vermindering van de Ictale activiteit).

Over het algemeen geven de resultaten die hier gepresenteerd dat muis hersenen segmenten gekoppeld aan multilaterale milieuovereenkomsten waardevolle hulpmiddelen voor epilepsie onderzoek en betrouwbare neuromodulatie studies die relevant zijn zijn voor het gebied van DBS voor epilepsie behandeling verder te verrichten. Bovendien, het protocol hier beschreven verbetert de hersenen segment levensvatbaarheid en kunt nastreven van experimentele sessies voor enkele uren (Figuur 6), die kunnen worden geëist, bijvoorbeeld om te vergelijken de effecten van verschillende elektrische stimulatie paradigma's.

Figuur 3 : Typische 4AP-geïnduceerde epileptiform patroon gevisualiseerd met vlakke tijdseenheid (A) muis brain slice gepositioneerd op een vlakke 6 x 10 MEA (elektrode afstand: 500 µm) en side-by-side-overzicht van het patroon van de 4AP-geïnduceerde epileptiform gevisualiseerd met MEA opname. Elk vierkant in het raster herbergt de activiteit opgenomen bij de overeenkomstige locatie in het segment van de hersenen. Blauwe stippellijnen verwijzen naar de elektrode rijen voor meer duidelijkheid. Het nummer van de opname-elektrode wordt aangeduid in blauw op de linkerbovenhoek van elk vierkant. De grijze vierkante gekruist vertegenwoordigt de referentie-elektrode. (B) vertegenwoordiger trace segmenten van de EG en CA3 patronen gevisualiseerd op een snellere tijd-schaal. Pijlpunten geven Ictale gebeurtenissen. In het spoor van de EG is het mogelijk te waarderen het vóórkomen van trage the lozingen (zwarte bar), dat de CA3 subveld leidt tot de typische aanhoudende fastinterictal patroon (zwarte balk). (C) uitgebreid opname van een Ictale kwijting tonen de typische tonic-klonische patroon. (D) Fast-schaal visualisatie van de pre-ictal-naar-Ictale overgang overeenkomt met de EG (rood) en CA3 (zwart) trace segmenten gekenmerkt door de rode balk in (B). De pijl geeft het begin van de Ictale kwijting. De bovenliggende sporen Leg uit dat de Ictale gebeurtenis die afkomstig zijn van de EG en vervolgens aan de CA3 subveld doorgegeven. (E) de uitgebreide weergave van de interictale periodes, gekenmerkt door de zwarte balken in (B) legt de nadruk op het ontbreken van een correlatie tussen de trage en fastinterictal patronen gegenereerd door de EG (rood) en CA3 (zwart), respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Muis hersenen segmenten bieden een hogere experimentele output dan de rat hersenen segmenten. (A) hersenen van een rat (links) en een muis (rechts) van gecompenseerde leeftijden slice. De rat hersenen segment veel groter is dan de opname van MEA gebied en zijn elektrische activiteit kan niet volledig worden gevisualiseerd. (B) directe visuele vergelijking van terugkerende Ictale activiteiten die worden gegenereerd door de muis en rat enthorinal cortex (EG). (C) Muis en rat hersenen segmenten genereren Ictale lozingen van vergelijkbare duur, maar het interval tussen deze gebeurtenissen is bijna 2-fold in rat hersenweefsel. * p < 0.05. (D) in vergelijking met ratten, muizen aanbieding een 2-fold hoger rendement van hersenen segmenten levensvatbaar is voor elektrische stimulatie experimenten gericht op het beheersen van ictogenesis. Elektrische stimulatie van de subiculum bevolking reacties in de cortices van de parahippocampal in slechts 20 van 58 (34%) rat hersenen segmenten, in tegenstelling tot 33 van 52 (63%) muis hersenen segmenten kan oproepen (Chi²: 9.22; p = 0.002). p < 0.05. (E) onder levensvatbare segmenten, het slagingspercentage bij het beheersen van Ictale activiteit is 2-fold met muis tegenover rat hersenen segmenten (muis: 20 van 33 segmenten van de hersenen, 60%: rat: 6 van de 20 hersenen segmenten, 30%; Chi²: 4,67; p = 0,03). p < 0.05. (F) muis hersenen segmenten kunnen weerstaan herhaald langdurige tijdperken van de aanhoudende elektrische stimulatie (grijs-gearceerde gebieden). Bij stimulans geldopname, muis hersenweefsel vertoont volledig herstel van de epileptiform-patroon, overwegende dat de taak van de rat hersenen weefsel levensvatbaarheid dramatisch op 3 h. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : Representatief experiment elektrische modulatie van ictogenesis met behulp van hersenen segmenten gekoppeld aan tijdseenheid (A) opnames van de 4AP-geïnduceerde Ictale activiteit in de EG en de PC tijdens de voorwaarde van controle (geen stimulatie), periodieke pacing (PP) 1 Hz (stimulans artefact is afgekapt), en tijdens het herstel bij stimulans geldopname. (B) kwantificering van het effect van PP 1 Hz op de totale tijd overnemen. p < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6 : Representatief langdurige opname van 4AP-geïnduceerde Ictale activiteit. (A) Trace segmenten opgenomen 8 h na de hersenen snijden procedure en volgende 2 h van 4AP toepassing. (B) Expanded traceren segmenten die overeenkomt met de boxed Ictale lozingen aangeduid met de letters een, ben c in deelvenster (A) Toon de consistentie van de gegenereerde Ictale activiteit gedurende de langdurige waarneming tijd-weduwe. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Voorraad A	Chemische stof	Moleculair gewicht	Concentratie (mM)
	NaCl	58.44	1150
Oplosmiddel: gedestilleerd water	KCl	74.55	20
Concentraat: 10 x	KH2PO4	136.1	12,5
Opslagtemperatuur: 4 ° C	CaCl2* 2 H2O	147.02	20
Maximale opslagtijd: 1 wk	D-Glucose	180.2	250
Opmerking: filteren met behulp van een membraanfilter van 50 mm
Voorraad B	Chemische stof	Moleculair gewicht	Concentratie (mM)
	NaHCO3	84.01	260
Oplosmiddel: gedestilleerd water
Concentraat: 10 x
Opslagtemperatuur: 4 ° C
Maximale opslagtijd: 1 wk
Opmerking: filteren met behulp van een membraanfilter van 50 mm
Voorraad C	Chemische stof	Moleculair gewicht	Concentratie (mM)
	KCl	74.55	20
Oplosmiddel: gedestilleerd water	KH2PO4	136.1	12,5
Concentraat: 10 x	MgCl2* 6 H2O	203,3	50
Opslagtemperatuur: 4 ° C	MgSO4* 6 H2O	246.47	20
Maximale opslagtijd: 2 weken	CaCl2* 2 H2O	147.02	5
Opmerking: filteren met behulp van een membraanfilter van 50 mm
Voorraad M	Chemische stof	Moleculair gewicht	Concentratie (mM)
	MgSO4* 6 H2O	246.47	100
Oplosmiddel: gedestilleerd water
Concentraat: 100 x
Opslagtemperatuur: 4 ° C
Maximale opslagtijd: 4 weken
4AP voorraad	Chemische stof	Moleculair gewicht	Concentratie (mM)
	4-aminopyridine	94.11	250
Oplosmiddel: gedestilleerd water
Concentraat: 1000 x
Opslagtemperatuur: 4 ° C
Maximale opslagtijd: 2 weken
Opmerking: vortex voor 2-3 minuten of roer voor 30-60 min
Opmerking: Let op! 4-AP is giftig en cinvulsant. Gebruik van handschoenen en Vermijd verspreiden of morsen.

Tabel 1: Voorraad oplossingen.

BEDRIJF ACSF			OPNAME ACSF			SNIJDEN ACSF
Chemische stof	C [mM]		Chemische stof	C [mM]		Chemische stof	C [mM]
NaCl	115		NaCl	115		Sacharose	208
KCl	2		KCl	2		KCl	2
KH2PO4	1,25		KH2PO4	1,25		KH2PO4	1,25
MgSO4	1.3		MgSO4	1		MgCl2	5
CaCl2	2		CaCl2	2		MgSO4	2
D-glucose	25		D-glucose	25		CaCl2	0,5
NaHCO3	26		NaHCO3	26		D-glucose	10
L-ascorbinezuur	1		L-ascorbinezuur	1		NaHCO3	26
						L-ascorbinezuur	1
pH	7.4		pH	7.4		Pyrodruivenzuur	3
Osmolaliteit	300 mOsm/Kg		Osmolaliteit	300 mOsm/Kg
						pH	7.4
						Osmolaliteit	300 mOsm/Kg

Tabel 2: Oplossingen samenstelling.

Probleemoplossing
PROBLEEM			TEGENMAATREGELEN
Ictale lozingen kijken 'chunked'			Het tarief perfusie verminderen en/of verlagen van het volume van de ACSF boven het segment van de hersenen door het aanpassen van de positie van de zuiging naald.
Geen Ictale activiteit			(1) Controleer of CA3-gedreven snel the gebeurtenissen niet aan de cortex doorgeven doen. Gebruik een mes van de kleine scalpel (bijvoorbeeld n.10) of een naald te verbreken van de Collaterals Schaffer als moet worden, maar wees voorzichtig niet te snijden de nylon draden van het segment hold-down anker. Een stereo- of rechtop Microscoop zijn geschikt, terwijl het omgekeerde Microscoop deze taak zeer moeilijk maakt.
			(2) check de segment-levensvatbaarheid: kan sterke elektrische stimulatie veroorzaken Ictale activiteit? Wachten tot ongeveer 2 h van toepassing van de 4AP, dan veranderen hersenen segment als Ictale activiteit niet optreedt.
Het segment van de hersenen wordt verplaatst bij het plaatsen van het hold-down-anker			(1) voorzichtig het segment anker verwijderen en verplaatsen van het segment van de hersenen.
			(2) Controleer of het segment anker gelijkmatig natte van 4AP-ACSF.
			(3) Verwijder de 4AP-ACSF uit de zaal opnemen om de gunst van de hersenen segment hechting op de MEA.
			(4) verplaatsen het segment hold-down anker.
Het segment van de hersenen drijft op de chip MEA na worden overgebracht			(1) gecombineerd voorzichtig de overtollige ACSF met een pipet van Pasteur.
			(2) de MEA chip moet mogelijk worden opnieuw bekleed.
Elektrische stimulatie doet niet netwerk reacties uitlokken			Verhogen van de intensiteit van de stimulus, elektrode paren wijzigen.
Elektrische stimulatie kan uitlokken bevolking reacties in de proximale maar niet distale corticale gebieden			De kwestie is ikely als gevolg van slechte connectiviteit of te laag stimulans intensiteit. Elektrische stimulatie kunnen ineffectief of effectief in sommige corticale gebieden alleen. Het is aanbevolen om de hersenen segment wijzigen.
Signaal is luidruchtig			(1) Controleer de referentie-elektrode: lawaaierige basislijn kan soms worden veroorzaakt door de onvolledige opvulling van het reservoir van de inlaat zodanig dat de referentie-elektroden doet niet helemaal diep in de ACSF.
			(2) check de algehele aarding van apparatuur.
			(3) Wijzig de positie van de zuiging naald om een constante, zachte zuigkracht geluid horen. Grond de zuig naald.
			(4) schoon de MEA externe contacten met ethanol met behulp van een wattenstaafje.
			(5) de MEA chip beschadigd: MEA chip wijzigen en controleren van artefacten en de signal-to-noise verhouding.

Tabel 3: oplossen van problemen.

Discussie

Multilaterale milieu-akkoorden zijn een instrument van onschatbare waarde voor neurofysiologie onderzoeken en rijpheid hebben bereikt in de afgelopen jaren dankzij tientallen exploratie en ontwikkeling. MEA's bieden in vergelijking met conventionele veld potentiële opname, het grote voordeel van een hoger aantal waarnemingspunten en bekende tussen elektrode afstand, die cruciaal zijn voor het nauwkeurig lokaliseren neuronale netwerk interacties.

De MEA opname-techniek kan ook worden gekoppeld aan andere electrofysiologie benaderingen, zoals patch-clamp opname¹⁵, om te onderzoeken de relatie tussen enkel neuron en neuronale netwerkactiviteit. Bovendien kan de mogelijkheid van het visualiseren van veld potentials en multi-unit activiteit tegelijkertijd bieden waardevolle inzichten in de correlatie tussen de activiteit van kleine neuronale ensembles en collectieve neuronale netwerken. De combinatie met spanning-gevoelige kleurstoffen, calcium beeldvorming, en optogenetics²⁹ kan afgeleid neurofysiologie fenomenen met behulp van polyedrale benaderingen. Naast farmacologische studies, de mogelijkheid van het uitvoeren van zowel opname en stimulatie met hetzelfde systeem maakt de MEA opname techniek zeer krachtig en veelzijdig: bijvoorbeeld, is het mogelijk om te bestuderen van de Synaptische plasticiteit fenomenen op de de kern van geheugen vorming³⁰, met behulp van de protocollen van de neuromodulatie gepresenteerde, die relevant zijn voor DBS voor de behandeling van epilepsie en een breed scala aan aandoeningen van de hersenen. De recente bewijs dat de MEA opname-techniek met succes kan worden toegepast op de hersenen met epileptische weefsel¹⁶ toont zijn onschatbare waarde nut in epilepsie onderzoek, zowel om te begrijpen van de fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen aan deze verwoestende ziekte en te fine-tunen DBS algoritmen te verbeteren het.

Echter MEAs het nastreven van electrofysiologie experimenten onder 'limit' voorwaarden voor segmenten van de hersenen, als gevolg van de eis van een verzonken opname-kamer en de noodzaak om de hersenen te laten dwingen snijd rust op het stevige substraat waar de micro-elektroden zijn geïntegreerd. Hersenweefsel wordt dus geen voldoende zuurstoftoevoer, die op zijn beurt kan invloed hebben op de kwaliteit van de opnamen.

Het protocol hier beschreven kan betrouwbaar opnemen en bestuderen van de ictogenesis in knaagdieren limbische netwerken gekoppeld aan multilaterale milieu-akkoorden met behulp van het model van de acute in vitro 4AP en voeren van langdurige tijdperken van de elektrische stimulatie, waarmee relevante informatie voor de evaluatie van DBS beleid.

Eerdere studies over elektrische neuromodulatie van epileptische limbische netwerken gebaseerd op het gebruik van conventionele veld potentiële opname hebt gebruikt muis of rat hersenen segmenten met soortgelijke resultaten^24,-²⁵; maar het gebruik van rat hersenweefsel bleek meer uitdagend, redelijkerwijs als gevolg van de zwakkere connectiviteit ten opzichte van hersenweefsel verkregen muizen⁷. Met betrekking tot de MEA techniek zijn muis hersenen segmenten geschikt op grond van hun kleiner. Bovendien, gezien het hogere tarief van voorkomen van Ictale-achtige lozingen in muis tegenover rat hersenweefsel, is het mogelijk om te testen aanzienlijk meer segmenten van de hersenen gedurende een experimentele dag, waardoor op zijn beurt verzamelen van de gegevens sneller en efficiënter, en kan het aantal gebruikte dieren te verminderen.

Betekenis ten opzichte van bestaande methoden:

Ictale lozingen opgenomen met behulp van de aangepaste kamer beschreven hier lijken te zijn vergelijkbaar in duur en tarief van voorkomen die waargenomen met behulp van de conventionele MEA ring kamer en hetzelfde MEA type (planar micro-elektroden, vgl. ¹⁷). Het moet echter worden benadrukt dat hersenen segment dikte aanzienlijk moet worden verlaagd wanneer met behulp van de conventionele ronde opname kamer samen met een lage perfusie-tarief (1 mL/min), die een belemmering voor de succesvolle voortzetting van neuromodulatie vormen kan verschuldigde experimenten om slechte verbindingen.

In dit protocol biedt een laag-volume aangepaste opname kamer geïnspireerd door patch-clamp opname kamer ontwerp stabiele en betrouwbare laminaire flow die is van cruciaal belang voor de succesvolle uitoefening van MEA opnamen; het laat ook de hersenen segment dikte 400 µm verhogen met het oog op een eerlijke trade-off tussen weefsel levensvatbaarheid en intrinsieke connectiviteit. Het wordt immers erkend dat laminaire flow van de oplossing voor het opnemen in de kamer is wenselijk voor hersenen segment electrofysiologie, omdat het niet is beïnvloed door de temperatuur, zuurstof, en pH verlopen die worden waargenomen in de circulaire-flow opname ronde kamers^19,20,31 (zoals degene voorzien van verkrijgbare MEA). Dergelijke verlopen voeren experimentele bias en ook schadelijk zijn voor het segment van de hersenen. Opname kamers van een relatief klein volume (~1.5 mL) samen met een hoge perfusie tarief (5-6 mL/min)^16,31 toestaan voor passende uitwisseling van de perfusie-medium (≥3 tijden / min). De aangepaste kamer gemakkelijk kan worden verkregen uit commerciële bronnen tegen een betaalbare prijs of geproduceerd in eigen huis met behulp van 3D-printing technologie. Andere studies hebben gemeld MEA opnames van 400 µm dik menselijk brein segmenten¹⁶ -met behulp van de conventionele MEA ring kamer, terwijl het volume van de ACSF tot 1 mL en handhaving van een hoge perfusie tarief (5-6 mL/min) met behulp van een geluidsarme peristaltische pomp. Echter, de auteurs hebben gebruikt een ander model van ictogenesis, dat wil zeggen, de lage Mg^{2 +}, die is waarschijnlijk dat minder beïnvloed dan het 4AP-model door ephaptic mechanismen met betrekking tot aanzienlijke stijging van de concentratie van extracellulaire K^{+ 11 , 22}. Wij hebben gevonden dat een hoog perfusie-tarief is niet wenselijk in het 4AP-model, mogelijk als gevolg van de snelle wash out van geaccumuleerde extracellulaire K⁺, die wellicht aanzienlijk worden verhoogd in de opname ACSF¹⁶. In feite Ictale gebeurtenissen te zien meer 'gedeelde' wanneer ASCF perfusie snelheid werd verhoogd tot 2-3 mL/min en de hersenen-segment was ondergedompeld door een dikke laag van de ACSF, overwegende dat volwaardige lozingen exposeren robuuste tonic-klonische onderdelen kon worden hersteld bij de terugkeer naar een lager tarief voor perfusie (1 mL/min) en een dunner ACSF laag rechts op het weefsel oppervlakte niveau (gegevens niet worden weergegeven). De zaal van de aangepaste opname in dit protocol omschreven kunt uitwisselen van het medium perfusie 3 - 5 keer / min bij een debiet van 1 mL/min. Zo is de algehele zuurstoftoevoer naar de hersenen segmenten sterk verbeterd zelfs bij relatief lage perfusie tarieven, terwijl nog het waarborgen van een stabiele temperatuur en hoge signaal-/ ruisverhouding opnemen. Bovenal is het mogelijk om te houden van de concentratie van de extracellulaire K⁺ op een fysiologische waarde.

Het 4AP model van ictogenesis vereist geen elke wezenlijke verandering van de Ionische samenstelling van ACSF, zoals verlaging Mg^{2 +} of toenemende K⁺, en biedt het unieke voordeel om zowel de excitatory als de remmende overbrengingen intact te houden ¹², een aspect dat zeer relevant is in epilepsie onderzoek in het licht van de cruciale rol van glutamaterge zowel GABAergic netwerken in epileptiform synchronisatie (Zie ⁷). De 4AP-ACSF gebruikt in dit protocol bevat een fysiologische K⁺ -concentratie (3,25 mM) en een iets lagere Mg^{2 +} concentratie dan het bedrijf ACSF (1 mM versus 1.3 mM). Deze concentratie valt nog steeds binnen de gerapporteerde fysiologische waarden van Mg^{2 +} concentratie in het CSF van knaagdier en het wordt gebruikt in veel laboratoria (zie bijvoorbeeld^17,,¹⁸). Het doel van het protocol beschreven, hebben we gevonden dat deze lichte daling heeft de voorkeur om te helpen bij het effect van 4AP.

In vorige werk, is 4AP toegepast op het segment van de hersenen wanneer het al binnen de opname kamer^{17,18 geplaatst was}. Tenzij de experimentator observeren van de latentie van de tijd tussen de toepassing van de 4AP en het begin van de epileptiform patronen moet, vinden wij dat deze aanpak nogal tijdrovend is en niet geschikt is om de langdurige opname en stimulatie sessies in dit protocol beschreven. Pre-incubatie van hersenen segmenten in 4AP bij 32 ° C kunt sparen veel experimentele tijd, omdat de hersenen segmenten kunnen worden vooraf behandeld in serie terwijl het nastreven van het experiment met behulp van andere weefselsecties.

De langdurige levensvatbaarheid van hersenen segmenten wellicht handig om te analyseren netwerkfuncties op de lange termijn. Bovendien is hun verbeterde veerkracht aan repetitieve elektrische stimulatie van groot voordeel als de experimentator wil vergelijken verschillende stimulatie-protocollen, die moeten worden uitgevoerd in hetzelfde segment hersenen voor statistische robuustheid. In onze handen, wanneer testprotocollen 3 stimulatie, elk voorafgegaan door een fase van de controle en gevolgd door een herstelfase, het experiment kan duren 3-5 h. In dit verband is live MEA toewijzing cruciaal om te activeren het juiste traject en onderdrukken in plaats van het voordeel van ictogenesis via elektrische stimulatie. Onze gebruikersvriendelijke GUI is een snel, eenvoudig en flexibel instrument toewijzen van de elektroden van verschillende breinstructuur. In tegenstelling tot de commerciële software kan het toevoegen van aangepaste MEA lay-outs zelfs met elementaire programmering vaardigheden. Afbeeldingen kunnen worden verworven op heldere gebied; Dus, is een algemene doel-camera die goede resolutie heeft en past op een Microscoop geschikt. Een omgekeerde Microscoop is essentieel voor het visualiseren van de microelectrodes positie ten opzichte van het segment van de hersenen, aangezien dit worden onder het weefsel verborgen zou als met behulp van een rechtop Microscoop. Een stereomicroscoop wordt echter aanbevolen naast het omgekeerde type als de experimentator uitvoeren van mes-snijdt moet verstoort of specifieke neuronale studierichtingen.

Ten slotte, een ander voordeel van de voorgestelde aanpak is de vergadering van de goedkope en relatief gemakkelijk van de meeste van de vereiste hulpmiddelen, zoals de kamer aangepaste opname en de kamers van het bedrijf, het warme bad en het segment anker, evenals het onnodige gebruik van een dure Geluidsarme peristaltische pomp.

Beperkingen van de techniek:

MEA opname niet mogelijk visualiseren van zeer langzame golven, dat wil zeggen, DC verschuivingen in het signaal. Dergelijke verleggingen basislijn kunnen helpen asymptotische meting van Ictale kwijting duur en, meest belangrijk, ze zijn fundamenteel voor het bestuderen van corticale verspreiden depressie (een verschijnsel dat betrekking heeft op plotselinge onverwachte dood in epilepsie³² en wordt gedeeld tussen epilepsie en migraine³³).

Met betrekking tot elektrische neuromodulatie kunt het protocol hier beschreven verschillende stimulatie sessies uitvoeren zonder hersenen segment levensvatbaarheid. We kunnen maximaal 3 sessies van de stimulatie van 20-45 min, vergelijkbaar met wat in eerdere werk²⁵gemeld uitvoeren. Hoewel de hersenen segmenten kunnen waarschijnlijk weerstaan een hoger aantal sessies van de stimulatie of langer stimulatie protocollen, testte wij niet hersenen segmenten in dit opzicht. Het is raadzaam om de beperking van het aantal stimulatie protocollen tot en met 3 en het vermijden van langdurige (≥60 min) stimulatie sessies, die hersenweefsel gehandhaafd onder deze limiet omstandigheden, tot het uitblijven van herstel bij stimulans geldopname aanzienlijk kunnen benadrukken.

Kritische stappen binnen het Protocol:

Verschillende kritieke factoren kunnen een belemmering vormen de succesvolle uitoefening van opname en modulatie van de epileptiform-activiteit in de hersenen segmenten gekoppeld aan MEA. Naast de knaagdiersoort gebruikt en de kwaliteit van de segmenten van de hersenen, het percentage van de perfusie tijdens opname en de dynamiek van de stroom van de ACSF (dwz., laminaire versus circulaire) binnen de opname kamer, we hebben geconstateerd dat de voorwaarden voor herstel en lange termijn onderhoud van segmenten van de hersenen alsook de wijze van toepassing van de 4AP zijn de meest kritische stappen.

Bij het gebruik van een verzonken bedrijf kamer is het van cruciaal belang voor het opslaan van de segmenten van de hersenen bij kamertemperatuur te behouden weefsel netwerk hersenactiviteit en het voordeel van de inductie van Ictale-achtige lozingen door toepassing van de 4AP. In onze handen verslechterd herstel en onderhoud bij 32 ° C het hersenweefsel binnen 3-4 uur van het snijden.

Incubatie van hersenen plakjes in 4AP-ACSF bij kamertemperatuur en opname bij 32 ° C is, echter niet wenselijk. We hebben veel problemen in het observeren van robuuste terugkerende Ictale lozingen in deze voorwaarde gevonden. Inderdaad, lage temperaturen in het bereik van 20-24 ° C hebben gemeld te temperen of zelfs te voorkomen 4AP-geïnduceerde ictogenesis beide in vitro³⁴ en in vivo³⁵. Dus, de 4AP-incubatie en opname-temperaturen moeten vallen binnen de 30-34 ° C en gepaard moeten gaan. Om te voorkomen dat het hersenweefsel onder teveel stress als gevolg van de gelijktijdige inductie van hyperexcitability door de 4AP en de plotselinge blootstelling van hersenen segmenten van kamertemperatuur aan de warme (32 ° C) 4AP-ACSF, is het van fundamenteel belang voor het uitvoeren van een tussenliggende vooraf opwarming van de aarde stap en laat die de hersenen segmenten koeien op het bedrijf ACSF bij 32 ° C gedurende 20-30 min. deze stap overslaan invloed kunnen zijn op de inductie ictogenesis door 4AP.

Een ander aspect dat moet worden genoemd is het belang van D-glucose-concentratie in de ACSF na het snijden. Een concentratie van 25 mM behoudt de hersenen segmenten beter dan de concentratie van de 10 mM gebruikt in veel laboratoria en het verbetert ook het tarief van voorkomen van Ictale activiteit, die 2-fold sneller (, waardoor het makkelijker om te zetten van een lange reeks van experimentele protocollen in verschillende segmenten van de hersenen elke dag).

Tot slot moeten enkele belangrijke fijne details tijdens de segmenteringshulplijnen procedure worden genoemd. Ten eerste, sta niet toe de de hersenen intact en de segmenten van de hersenen te bevriezen in de kou snijden ACSF. Koeling van de hersenen voor < 2 min volstaat gezien de kleine omvang van de hersenen van de muis. Weefselsecties moeten onmiddellijk uit de buffer lade worden overgedragen aan de spoeldouche bekers bij kamertemperatuur. Spoelen van het snijden is ACSF heel belangrijk dat anders de hoge sacharose concentratie zal maken de hersenen segmenten aan de nylon gaas van de kamer van het bedrijf vasthouden. Om effectief spoelen het weefsel, is het belangrijk om te minimaliseren van de snijden ACSF inhoud van de Pipet van de overdracht om niet vervuilen het bedrijf ACSF overdreven. De 2-traps spoelen helpt bij het minimaliseren van verontreiniging. Na voltooiing van de segmenteringshulplijnen procedure, moeten weefselsecties worden overgedragen onmiddellijk uit de spoeldouche bekers in de vergaderzaal van bedrijf, waar de zachte nylon mesh geschorste halverwege in het bedrijf ACSF weefsel oxygenatie kan aan beide zijden. Hetzelfde principe moet worden toegepast in alle stadia na de segmenteringshulplijnen procedure: hersenen segmenten moeten nooit zitten aan de onderkant van het bekerglas, ze mag niet in contact met de zijkanten van de kamers van het bedrijf, en ze moeten nooit met elkaar in contact, noch overlappen.

Wijzigingen en probleemoplossing:

ACSF samenstelling kan worden aangepast van de experimentator. Bijvoorbeeld kunnen drugs worden toegevoegd aan het ontleden van de bijdrage van bepaalde neurotransmitters of ionenkanalen om de werkzaamheid van elektrische neuromodulatie. Bovendien, pyrodruivenzuur en ascorbinezuur (Zie tabel 2) mag achterwege blijven, hoewel wij vinden dat zij een krachtige neuroprotectieve rol uitoefenen. In tabel 3 rapporteren we de meest voorkomende problemen die kunnen worden aangetroffen in dit protocol en hoe om te gaan met hen.

Conclusies:

MEA opname is ongetwijfeld een waardevolle techniek inspelen op de interactie van neuronale netwerken in gezondheid en ziekte. Naast farmacologische studies is het ook mogelijk om elektrische neuromodulatie protocollen die relevant voor DBS toegepast op epilepsie en andere neurologische aandoeningen zijn. In dit protocol, hebben we aangetoond dat het mogelijk om te reproduceren van typische periodieke stimulatie experimenten met vergelijkbare resultaten verkregen met de conventionele extracellulaire veld potentiële opname en externe elektroden te stimuleren. De toenemende beschikbaarheid van commerciële gebruiksvriendelijke apparaten en geavanceerde software-instrumenten maken de MEA opname techniek ook geschikt voor gesloten-lus stimulatie experimenten, zodat ad hoc stimulatie aan het hersenweefsel en onderzoeken van de bijdrage van de feedbackmechanismen neuronale netwerk antwoorden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Poly-D-Lysine	Sigma-Adrich	P7886	Benodigd voor MEA coating
NaCl	Sigma-Adrich	S9888	Chemische stof
KCl	Sigma-Adrich	P9541	Chemische stof
KH2PO4	Sigma-Adrich	795488	Chemische stof
CaCl2*2 H2O	Sigma-Adrich	C3306	Chemische stof
D-Glucose	Sigma-Adrich	RDD016	Chemische stof
NaHCO3	Sigma-Adrich	S5761	Chemische stof
MgCl2*6 H2O	Sigma-Adrich	M2670	Chemische stof
MgSO4*6 H2O	Sigma-Adrich	M5921	Chemische stof
Sucrose	Sigma-Adrich	RDD023	Chemische stof
Pyruvic Acid, 98%	Sigma-Adrich	107360	Chemische stof
4-aminopyridine	Sigma-Adrich	A78403	Krampenverwekkend medicijn
STG-2004	Multichannel System	STG4004-1.6mA	4-kanaals stimulusgenerator met spanning (±8 V) en stroomuitgang (±1.6 mA)
MEA1060	Multichannel System	N/A	MEA versterker
planar MEA	Multichannel System	60MEA500/30iR-Ti w/o ring	Moet zonder ring zijn om het gebruik van de aangepaste opnamekamer mogelijk te maken
McRack	Multichannel System		Opnamesoftware
McStimulus II	Multichannel System		STG4004 controlesoftware
TC02	Multichannel System	TC02	2-kanaals thermostaat
PH01	Multichannel System	PH01	Verwarmde perfusiekaan
MPH	Multichannel System	MPH	Magneethouder voor PH01 en zuignaald
Elastostil E43	Wacker	E43	Elastomere afdichting gebruikt om de aangepaste opnamekamer op de MEA te monteren
MEA Custom Chamber	Crisel Instrument	SKE-chamber MEA	Aangepaste opnamekamer
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm	Crisel Instrument	64-1309	Referentie-elektrode voor de aangepaste opnamekamer
Tergazyme	Sigma-Adrich	Z273287-1EA	Enzymatische reiniger
MATLAB	The Mathworks		Programmaomgeving voor elektrodekaartlegging
VT1000S	Leica Biosystems	VT1000S	Vibratoom
	Warner Instruments	64-1309	Ag-AgCl elektrodepellet 1,0 mm (E205). Referentie-elektrode.