Methodenartikel

Een zuig Blister-Protocol om menselijke T-cel Recall reacties In Vivo te studeren

DOI:

10.3791/57554

⸱

11 augustus 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Infectious Disease Immunology, Center for Vaccine Research, Statens Serum Institut, 2Department of Infectious Diseases, Hvidovre Hospital, 3Institute of Clinical Medicine, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 4Division of Infection and Immunity, University College London

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier bieden we een demonstratie van het model van de cutane terugroepen zuig blister. Het model biedt een eenvoudige toegang tot het bestuderen van de menselijke in vivo adaptieve immuunresponsen, bijvoorbeeld in het kader van de ontwikkeling van een vaccin.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cutane antigeen-recall modellen toestaan voor studies van het menselijk geheugen reacties- in vivo. Wanneer gecombineerd met huid zuig blister (SB) inductie, biedt dit model de toegankelijkheid aan zeldzame bevolking van antigeen-specifieke T-cellen vertegenwoordiger van de reactie van de cellulaire geheugen, alsmede de cytokine communicatie in situ.

Dit verslag beschrijft de praktische procedure van een cutane recall, een SB-inductie en een oogst van antigeen-specifieke T-cellen. Om te illustreren de methode, de tuberculine huidtest wordt gebruikt voor antigene terugroepen in individuen die, voorafgaand aan deze studie, onderging een Bacillus Calmette-Guérin vaccinatie tegen een infectie met Mycobacterium tuberculosis. Ten slotte, voorbeelden van multiplex en stroom cytometrische analyses van SB specimens zijn voorzien, ter illustratie van hoge breuken van antigeen-specifieke multifunctionele CD4 + T-cellen beschikbaar door deze bemonsteringsmethode in vergelijking met cellen van het bloed werd geïsoleerd.

De hier beschreven methode is veilig en minimaal invasieve, biedt een unieke gelegenheid om te studeren zowel aangeboren en adaptieve immuunresponsen in vivo, en wellicht gunstig zijn voor een brede gemeenschap van onderzoekers die werken met cel-gemedieerde immuniteit en mens geheugen reacties, in het kader van de ontwikkeling van een vaccin.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een huid-SB is een kunstmatig opgewekte blister, die het mogelijk voor de oogst van cellen en vloeistof rechtstreeks uit de huid maakt. De techniek van het verhogen van SBs door vacuüm is een bekende tool op het gebied van Dermatologie gebruikt voor de studie van huid immunologie in gezondheid en ziekte1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. dit verslag toont aan hoe de SB-techniek gecombineerd met cutane antigene terugroepen (SB cutane recall methode) direct inzicht in adaptieve immuunresponsen in vivokan bieden.

Het principe achter de SB-inductie is eenvoudig: een licht vacuüm wordt toegepast op een klein gebied van de huid. De negatieve druk zal uiteindelijk dwingen de epidermis te scheiden van de dermis, het maken van een lokale blister gevuld met vloeistof en cellen1,2,9. De blister vloeistof kan worden geoogst door een fijne naald aspiratie en de inhoud kan worden gebruikt voor verdere studie in vitro.

In de afgelopen jaren is er een groeiende interesse in de SB-methode voor de studie van in vivo immuunresponsen dan ziekten beperkt tot de huid10,11. De studie van de adaptieve immuniteit bij de mens wordt beperkt door het feit dat de cellen en cytokines van belang worden bemonsterd uit perifeer bloed omdat een invasieve bemonstering van de lymfeklier of gastro-intestinale mucosal weefsels onaanvaardbaar en onethisch zijn kan. Een voorbeeld is de studie langlevende menselijk geheugen T-cel-respons na vaccinatie12. De bemonstering van relevante T-cellen kan een grote uitdaging, omdat de betrokken bevolking van cellen die immuniteit bemiddelen in het lymfoïde weefsel woont in dergelijke proeven, en slechts een zeer beperkt aantal specifieke T-cellen in het perifere bloed circuleren.

De SB-techniek biedt een unieke gelegenheid om de studie van geheugen T-cellen en andere specifieke cel populaties. Naar aanleiding van de cutane inoculatie van antigeen, T-cellen specifiek voor het antigeen worden gerekruteerd uit hun lymfoïde hideaways voor de huid en kan gemakkelijk worden bemonsterd uit de SB. De methodologie en onderzoek toepassingen van dit model voor cutane recall werden beschreven door Akbar et al. in 20132. Een veel gebruikte antigeen op hun huid rappel is de verkrijgbare gezuiverde eiwit afgeleide (PPD) van mycobacteriën gebruikt voor het uitvoeren van een tuberculine huidtest (TST)13, waar de PPD wordt geïnjecteerd in de dermale laag van de huid. Bij personen met een bestaande immunologisch geheugen naar PPD [bijvoorbeeld, personen met een infectie van het Mycobacterium tuberculosis (Mtb) of een eerdere vaccinatie van Bacillus Calmette-Guérin (BCG)], de antigeen-afzetting resulteert in een herinner me de reactie met migratie op de huid en een in vivo klonale uitbreiding van PPD-specifieke CD4 + T-cellen2,11,14,15. Dientengevolge, hoge breuken van PPD-specifieke multifunctionele CD4 + T-cellen zich ophopen in de huid klaar voor SB bemonstering. T-cellen die door deze methode verzameld hebben bewezen als robuust en zijn voldoende overvloedig te worden gekenmerkt door een aantal immunoassay en door een lange termijn in vitro cultuur15. Dus, de cutane recall-model en de SB-inductie blijken een waardevolle methode om te bestuderen in vivo T-cel reacties door ex vivo analyses en toegenomen kennis van deze aanpak in aanmerking voor onderzoekers met belangen in cellulaire immunologie en vaccintechnologie.

Dit rapport bevat de eerste stapsgewijze gids op hoe te zuiging blaren van de menselijke huid in PPD-geïnjecteerd huid veroorzaken. De cutane antigeen terugroepen model wordt aangetoond door middel van de TST bij BCG-gevaccineerde vrijwilligers. Ten slotte, de relevante ex vivo -analyse van de cellen en cytokines geïsoleerd door SB is blijkt. Phenotypical en functionele kenmerken van PPD-specifieke T-cellen verkregen door de SB-methode zijn grondig elders beschreven2,10,11,16,17, 18 , 19. dit verslag heeft tot doel de praktische en immunologische aspecten van de methodologie te vergemakkelijken van de toepassing van deze techniek door andere onderzoeksgroepen te bespreken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die hieronder beschreven, met inbegrip van het gebruik van menselijke vrijwilligers, zijn goedgekeurd door de Deense Commissie gezondheid onderzoek ethiek (H-15002988) en de Deense Bureau voor gegevensbescherming (jr.nr. 2015-57-0102). PPD moet een gecertificeerd product goedgekeurd voor menselijk gebruik en in de juiste dosering geleverd door de fabrikant uitgevoerd. Elke afwijking in de dosering of het beheer kan verlangen ethische aanvullingen en vrijwilligers geïnformeerde toestemming moeten geven.

1. de tuberculine huidtest

  1. Mondelinge en schriftelijke geïnformeerde toestemming verkrijgen van de vrijwilliger. Voorafgaand aan de injectie, ervoor zorgen dat de vrijwilliger begrijpt en accepteert de procedure met inbegrip van de mogelijke bijwerkingen.
    Opmerking: Inclusie criteria specifiek voor dit protocol zijn leeftijd > 18 jaar en een gedocumenteerde BCG-vaccinatie. Inclusie criteria kunnen variëren afhankelijk van de onderzoeksvraag (dat wil zeggen, een extra opname criterium zou bewijs van positieve TST).
  2. Gebruik een kant en klare oplossing van PPD voor menselijk gebruik [20 tuberculine-eenheden (TU) /mL]. Desinfecteer de rubberen dop van een flesje met behulp van een alcohol doekje.
  3. Voorbereiden van de injectieplaats
    1. Ga naar de site van de injectie aan de ventrale zijde van de onderarm van de vrijwilliger.
    2. Plaats de arm palm-up op een platte ondergrond en kies een gebied in het bovenste derde van de onderarm, ongeveer 5-10 cm van het ellebooggewricht. Verblijf duidelijk van littekens, aders of beschadigde huid.
    3. Desinfecteer het gebied met behulp van een alcohol doekje.
  4. Bereid de PPD-oplossing
    1. Gebruik een 1 mL steriele injectiespuit met een 27-30G/korte (b.v., 12 mm) vaste naald.
    2. Voorzichtig mengen en 0,1 mL PPD-oplossing streven. Zorg ervoor dat er geen zichtbare bellen.
  5. Intradermale injectie van PPD
    Opmerking: Deze stap wordt beschreven hoe u van een enkele PPD depositie, maar meerdere afzettingen van PPD in de dezelfde arm is mogelijk. Dit kan echter specifieke ethische goedkeuring vereisen.
    1. Rekken van de huid en wijs de naald onder een hoek van 5-15° de huid met de schuine kant naar boven.
    2. Breng de tip van de naald in de dermale laag van de huid en zorg ervoor dat de tip is bijna zichtbaar via de opperhuid.
    3. Langzaam injecteren 0,1 mL PPD-oplossing.
      Opmerking: Indien correct toegediend, een bleke papule van 6-10 mm onmiddellijk weergegeven. De papule verdwijnt na ongeveer 10 min.
    4. Bij het maken van twee of meer depositie, streven naar een maximale scheiding (5-10 cm) van de injectie sites terwijl op een goede afstand van de elleboog en pols gebied.
      Opmerking: Dit verhindert een potentiële samenvloeiing van de huidtest reactie en staat de ononderbroken positionering van twee zuig kamers.

2. evaluatie van de reactie van de huid - dag 3

  1. Opmerking de grootte van de reactie van de huid na 48-72 uur. Meten van de verharding (de zwelling) en niet het erytheem (de roodheid) van de reactie.
  2. Palperen de harde zwelling met behulp van vingers en vervolgens markeert de randen van de verharding met behulp van een balpen. Een liniaal gebruiken om te meten van de diameter van de verharding en noteer het resultaat in mm.
    Opmerking: Een lezing van de grootte van de verharding kan de keuze van de diameter van de opening voor de zuig kamer begeleiden.

3. zuig Blister inductie - dag 7

  1. Monteer het toestel zuig-apparaat.
    Opmerking: Zuig-apparaat eenheden zijn vacuüm pompen met bijgevoegde chambers voor zuig blister inductie. Het apparaat gebruikt in deze demonstratie is op maat gemaakt, maar zuig-apparaat units zijn ook verkrijgbaar. De pomp moet worden binnen het bereik van -20 tot-40 kPa verstelbaar en zorgen voor een stabiele en betrouwbare onderdruk. Regionale ethische goedkeuring moet vóór het uitvoeren van experimenten met behulp van deze methode worden verkregen.
    1. Eerst, het voorbereiden van de zuiging kamer door het monteren van de bodemplaat van de opening en de plaat van het venster met de zaal en de aansluitende slang. Bevestig de slang kamer-aansluiten strak aan de vacuümpomp.
      Opmerking: De kamers moeten een bodemplaat met een gat voor de inductie van de blister, die geschikt zijn voor contact met de menselijke huid moet, en een top plaat met een raam, waardoor voor de visuele controle van de blister bevatten.
  2. Bepalen van de optimale opening diameter van de afsluitplaat ten opzichte van de grootte van de reactie van de huid; Hoe groter de grootte van de opening, hoe groter de blister.
  3. Desinfecteren van de huid van de vrijwilliger en de afsluitplaat met behulp van alcohol swabs.
  4. De zuiging zaal hechten aan de huid.
    1. Zorg ervoor dat de vrijwilliger de arm, comfortabel rust.
    2. Zorg ervoor dat het gat in de bodemplaat van de zuiging kamer bevindt zich op de PPD-reactie, zodat het centrum van de reactie van de huid zichtbaar is.
    3. Veilig de kamer losjes met behulp van riemen: wanneer negatieve druk wordt toegepast, de zaal zal houden aan de huid en haar positie handhaven.
  5. De zuig-apparaat inschakelen en aanpassen van de druk-20 kPa.
  6. Na 30 min, door de onderdruk naar-25 kPa te verhogen.
  7. Na 60 min, verdere verhoging van de onderdruk tot-30 kPa.
  8. Druk bij-30 kPa blijven tot er een blaar is volledig gevormd. Ervoor zorgen dat de negatieve druk in dit protocol bedoelde specifiek voor een aangepaste instrument zijn. Het kan nodig om de druk enigszins bij de toepassing van het protocol in andere instellingen zijn.
    Opmerking: De blister inductie fase varieert van 60 tot 180 min (1-3 h) met de vorming van de werkelijke blister die zich voordoen binnen de laatste 30 min. dat verschroeien wordt vaak geassocieerd met een jeukende gevoel. De blaren kunnen optreden als een of meerdere fuserende blaren. Als blister uiteenspringen of breken bloeding optreedt, wordt aangeraden om het beëindigen van de blister inductie door het langzaam de druk vrijgeven.
  9. Nadat de blister is volledig gevormd, laat de druk en verwijder voorzichtig de zuig zaal uit de huid zonder het bezwijken van de blister.
  10. Een zachte dressing van toepassing op de omgeving van de huid en plaatst u een harde dop (bvuit een plastic buis van 50 mL) op de blister.
  11. Beveilig het GLB met non-allergeen chirurgische tape, gevolgd door een zachte, elastische bandage.
  12. Instrueer de vrijwilliger om te voorkomen dat buitensporige fysieke belasting op het gebied van de blister voor de komende 12-24 uur.

4. de oogst van Blister Fluid - dag 8

  1. Op de 8e dag, zachtjes verwijderen van de beschermende dressing en Desinfecteer de blister met huid desinfectie spray.
  2. Gebruik een 2 mL steriele injectiespuit met een naald 23G te oogsten van de inhoud van de blister. Plaats de naald in de top/laterale kant van het dak van de blister en langzaam gecombineerd de vloeistof. Raak de verdieping van de holte, maar zorg ervoor om te oogsten van alle van de vloeistof.
  3. Breng een dressing op de samengevouwen blister.
  4. De blister vloeistof overbrengen in een steriele buis. Opmerking het volume.
  5. Draai de blister vloeistof naar beneden bij 600 x g met behulp van een tafelblad centrifuge voor 4 min.
  6. Overbrengen in een andere buis het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 500 µL van cel medium.
    Opmerking: De cellen zijn nu klaar voor tellen en verdere analyse. Supernatant kunnen worden achtergelaten bij -20 tot-80 ° C tot gebruik.

5. analyses van zuigkracht Blister cellen en vloeistoffen

Opmerking: Instructies voor de analyse van cellen en vloeistof verkregen huid zuig blaren is niet binnen de werkingssfeer van dit protocol. Echter, teneinde representatieve resultaten voor dit verslag, intracellulaire vlek stroom cytometry en multiplex analyses werden uitgevoerd. De methode is in het kort hieronder beschreven.

  1. Stroom cytometry
    1. Stimuleren van suspensies van 1 x 105 verse cellen geïsoleerd van zuiging blaren van 1 BCG-gevaccineerde vrijwilliger met 10 µg/mL PPD en Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2. Voorzien van ongestimuleerde cellen waar een parallelle incubatie.
    2. Stimuleren van suspensies 1 x 106 PBMCs 1 BCG-gevaccineerde vrijwilliger met 10 µg/mL PPD verkregen en Incubeer het mengsel bij 37 ° C en 5% CO2. Voorzien van ongestimuleerde cellen waar een parallelle incubatie.
    3. Na 2 uur, alle cellen met de Brefaldin A en monensine behandelen en hen Incubeer gedurende 6 uur bij 37° C.
    4. Vlek van de cellen met een panel van Live/Dead-vlek-BV510, anti-CD4-AF780, anti-CD3-BV421, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, anti-CCR7-PE, anti-CD45RA-BV786, anti-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 en anti-IL-2-FITC.
    5. FMO besturingselementen opnemen in het deelvenster PBMC.
    6. Een stroom cytometrische analyses uitvoeren met een cytometer van de stroom en analyseren de resultaten met behulp van relevante software.
    7. Gate op de cytokine-producerende CD3 + CD4 + CD8-subsets kunt weergeven met behulp van de volgende gating strategie: onderhemden - > levensvatbare CD3 + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + of IL-2 +.
    8. Poort op effector geheugen cel populaties met behulp van de volgende gating strategie: onderhemden - > levensvatbare CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.
    9. Individuele cytokine profielen met behulp van Booleaanse gating te berekenen.
  2. Cytokine release demonstraties
    1. Voor een demonstratie van een cytokine release in vivo, een multiplex analyse gebruiken voor het kwantificeren van de niveaus van IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10, en IL-13 in ontdooide zuig blister vloeistof verkregen 4 vrijwilligers.
    2. Voor een demonstratie van een cytokine release door cellen verkregen zuig blaren ex vivo, gebruik verse zuig blister cellen en PBMCs verkregen 1 BCG-gevaccineerde vrijwilliger.
    3. Infecteren de PBMC en zuig blister cellen met 100 kolonie-vormende eenheden (kve) van Mtb H37Rv en incubeer hen voor 4 dagen.
    4. Een multiplex analyse gebruiken voor het kwantificeren van de niveaus van IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10, en IL-13 in alle supernatant van cultuur.
    5. Pas de afmetingen boven het assay berekening bereik voor de berekening van de bovenste grens.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Acht gezonde volwassen vrijwilligers (gemiddelde leeftijd: 30 jaar variëren: 26-43 jaar) met een gedocumenteerde vorige BCG-vaccinatie (mediane tijd van BCG-vaccinatie: 5,5 jaar variëren: 1-30 jaar) waren opgenomen. De deelnemers waren intradermaal uitgedaagd met 2 TU van PPD gevolgd door een evaluatie van de TST op dag 3. SBs waren geïnduceerde op dag 7 en op dag 8 geoogst, en alle blaren werden opgeheven met behulp van zuiging blister kamers met een diameter van 10 mm opening. Zeven personen kregen 2 aparte PPD inentingen gelijktijdig in de dezelfde arm gevolgd door 2 parallelle SB inducties (Zie de opmerking met betrekking tot meerdere PPD afzettingen hieronder stap 1.4 in het Protocol). Perifeer bloed werd getrokken op dag 7 voor plasma en een PBMCs isolement door dichtheid kleurovergang centrifugeren. Plasma en vloeistof supernatant van SBs werden opgeslagen bij-20 ° C. Verse SB cellen (SBCs) werden geteld met behulp van nigrosine-vlek en microscopie.

De klinische TST reacties en SBC opbrengst worden gepresenteerd in Figuur 1. De gemiddelde grootte van de TST-indurations was 10.25 mm (bereik: 0 - 20 mm) en de mediane celaantal per blister was 50.000 (bereik: 15.000-210.000 cellen, aantal blaren: 15). Twee van de vrijwilligers had geen klinische respons in een van de 2 TSTs en een bijbehorende lage cel Totaal rendement van 15.000 cellen/blister. De opbrengst van de cel werd geassocieerd met de gemiddelde klinische respons van TST (Spearman van r = 0.643, p = 0.094).

figure-results-1
Figuur 1 : Zuig blister cel opbrengst. (een) dit paneel toont een vertegenwoordiger microscopie van nigrosine gebeitste cellen geïsoleerd van SBs verhoogd 7 dagen post-TST. (b) dit paneel geeft de relaties weer tussen de gemiddelde TST verharding (mm) en de gemiddelde cel-opbrengst (n-/blister) in 8 BCG-gevaccineerde vrijwilligers (aantal blaren = 15). De puntjes vertegenwoordigen afzonderlijke gemiddelde metingen. Houd er rekening mee dat 2 puntjes als beide 2 vrijwilligers had een TST verharding van 0 mm en een rendement van de cel van 15.000 elkaar overlappen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Om aan te tonen de stroom cytometrische SB karakterisering, SBC zijn verkregen van een 43-jarige vrijwilliger die BCG-gevaccineerde 30 jaar eerder was geweest en had geen bekende blootstelling aan Mtb. de SBC's werden geïsoleerd na de inductie van een (één blister verharding: 1.4 mm/100.000 SBC). Figuur 2 toont representatieve percelen van de intracellulaire cytokine kleuring van de SBC's versus PBMCs.

In deze vrijwilliger, de Fractie van CD3 + CD4 + CD8-SBC verhoogd van 67% in ongestimuleerde cellen tot > 90% op een PPD in vitro restimulation, terwijl de breuk van CD3 + CD4 + CD8-PBMCs bleef constant (~ 51%, Figuur 2). Meer dan 92% van de in vitro PPD-, evenals de ongestimuleerde CD3 + CD4 + CD8-SBC, waren van het geheugentype effector (CCR7 - CD45RA-, gegevens niet worden weergegeven). De algehele breuken van specifieke CD3 + CD4 + CD8-cellen geïnduceerd door PPD-stimulatie waren hoger in de SBC's in vergelijking met de PBMCs (33.1 vs. 0,2%, ongestimuleerde monsters afgetrokken). In de PBMCs waren de fracties van multifunctionele PPD-specifieke CD3 + CD4 + CD8-cellen alle < 0,05%.

figure-results-2
Figuur 2 : Representatief stroom cytometry percelen van SBC versus PBMCs. Panelen een en b Toon representatieve dichtheid ongestimuleerde percelen van CD8 + en CD4 + populaties in (een) vs. PPD-gestimuleerd PBMCs en (c) SBC. panelen b en d traag percelen van intracellulaire cytokine kleuring in PPD-gestimuleerd CD3 + CD4 + CD8-cellen voor (b) PBMCs en (d) SBC. gelieve Klik hier om een grotere versie van dit cijfer.

Zoals verwacht, waren de CD3 + CD4 + CD8-SBC geactiveerd in vivo, geïllustreerd door een groot deel van de cellen kleuring voor upregulated cytokines (12%), met de overheersende cytokines TNF-α en IFN-γ. Echter bij PPD-stimulatie, de cytokine afscheidende cellen verschoven naar een triple - of double-positieve IFN-γ, TNF-α + IL-2 + (17%) en IFN-γ + TNF-α + (15%) Profiel (Figuur 3b, PBMC profielen van dezelfde donor zijn opgenomen voor vergelijking in Figuur 3a). De cytokine expressieprofielen voor PPD-gestimuleerd effector geheugen CD4 + T cel subsets (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) vergelijkbaar waren met de CD3 + CD4 + CD8-bevolking gepresenteerd in de figuren 2 en 3 (gegevens niet worden weergegeven).

figure-results-3
Figuur 3: Cytokine profielen voor CD4 + PPD-gestimuleerd en ongestimuleerde SBC versus PBMCs.  Deze panelen Toon afzonderlijke profielen voor de cytokine productie (een) CD3 + CD4 + CD8-PBMCs cellen en (b) CD3 + CD4 + CD8-SBC. De staven breuken van antigeen-specifieke cytokine profielen in ongestimuleerde cellen (witte balken) en op een in vitro -stimulatie met PPD (gekleurde balken).

Om te ontdekken de SB vloeistof als een bron van informatie over de communicatie van de cytokine op de site van het testen van de huid, werden de cytokine niveaus gemeten in vloeistof geoogst van SBs geïnduceerde 7 dagen post-TST (figuur 4a). De gemiddelde niveaus van IFN-γ, TNF-α en IL-2 waren 339 pg/mL, 19 pg/mL en 1 pg/mL, respectievelijk (n = 6). De plasma-niveaus waren over het algemeen zeer laag. Cellen van SBs geïsoleerd geproduceerd hoge niveaus van pro-ontsteking cytokinen ex vivo (figuur 4b). Titraties van de SBC's van 1 vrijwilliger werden gekweekt voor 4 dagen in het bijzijn van virulente M. tuberculosis ± autologe PBMCs. De IFN-γ niveaus waren > 30-fold hoger in culturen met SBC, ongeacht de aanwezigheid van PBMCs.

figure-results-4
Figuur 4 : Cytokine niveaus in SB vloeistof, plasma, en MTB -besmet cultuur supernatant. (een) dit paneel toont cytokine niveaus in SB vloeibare supernatant en plasma uit 6 BCG-gevaccineerde vrijwilligers. De staven van de mediane cytokine niveaus; de foutbalken vertegenwoordigen het bereik. (b) dit paneel toont de cytokine niveaus in supernatant van 4 parallelle 600 µl ex vivo 4-daagse culturen van 1 x 106 PBMCs (zwarte balken), 1.75 x 105 SBC (witte balken), en 1 x 106 PBMCs verrijkt met 0,5 of 1.75 x 10 5 SBC (grijze balken) besmet met Mtb. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript wordt een praktische procedure voor de studie van menselijk immuun geheugen reacties in vivo, cutane antigeen terugroepen en cel oogst via zuig blister inductie beschreven. TST werd gebruikt als een voorbeeld van intradermale antigeen afzetting en terugroepen van het BCG-vaccin. Tot slot was een voorbeeld van SB specimen karakterisering door flow cytometrische en multiplex cytokine analyse verstrekt, waaruit blijkt dat ongeveer een derde van de SB-cellen werden antigeen-specifieke polyfunctional T-cellen van het effector geheugen fenotype.

De kritische stappen van dit protocol zijn de intradermale injectietechniek, de zuig blister inductie en de punctie van de blister. In de eerste plaats vereist een juiste intradermale depositie opgeleid personeel. Een onjuiste afzetting kan leiden tot suboptimaal resultaten. PPD is over het algemeen een bekende en veilige cutane antigeen, maar de samenstelling kan variëren tussen de fabrikanten, vergelijkbaarheid13,20te beperken. Dit verslag bevat instructies voor een enkelvoudige intradermale afzetting van 2 TU, en eventueel twee parallelle depositie (2 x 2 TU), waarvoor aanvullende ethische goedkeuring kunnen. Echter, andere studies hebben gebruikt 10 TU, die de kans op een sterke huid reactie10,21 verhogen. Tijdens de SB inductie stap, zal kleine stapsgewijze verhogingen in de negatieve druk verminderen het risico op bloeding en blister breuk. De kans op besmetting met rode bloedcellen of leukocyten uit de bloedbaan zijn over het algemeen laag2. De aseptische punctie techniek voorkomt bacteriële besmetting en vermijden van contact tussen de naald punctie en de dermale blister vloer vermindert onzuiverheden van puin of ingezetene huidcellen. Sommige onderzoekers geven er echter de voorkeur om te oogsten SB vloeistof door een rollende druk uit te oefenen op de geperforeerde blister10. Mogelijk moet het doorprikken van de septa binnen de blister. De SB-techniek zelf is minimaal invasieve; samengevouwen SBs genezen zonder littekens en infecties zijn zeer zeldzaam. 2 echter een zekere mate van hypo-pigmentatie kan optreden en SB inductie moet waarschijnlijk worden vermeden bij mensen met een geschiedenis van colloïdale littekens.

Technische beperkingen omvatten lage cel Totaal opbrengsten en bijgevolg beperkte opties voor opslag op lange termijn. Relaties tussen het rendement van de leukocyten, klinische TST reacties, de blister grootte en erytrocyt besmetting geweest grondig beschreven elders2,10. In de BCG-recall experimenten hier gepresenteerd (Figuur 1) was de gemiddelde totale opbrengst van iedere blister 50.000, impliceert een kleinschalige experimentele opstelling met behulp van deze cellen, vooral als de SBC's hebben de bestudeerde alleen15. Echter de specifieke T-cel-bevolking in een steekproef van SB meestal groter is dan wat wordt gevonden in PBMC monsters in beide vlakken relatieve en absolute cel. In het voorbeeld in Figuur 2gepresenteerd, waren het aantal triple-positieve PPD-specifieke T-cellen in een steekproef van 100.000 SB cellen meer dan 2 x groter is dan het aantal gevonden in 1 x 106 PBMCs van dezelfde donor (gegevens niet worden weergegeven). Een visuele scoring van de TST-reactie is de meest voorkomende klinische methode voor de beoordeling van M. tuberculosis geheugen. Van de nota, de onderliggende adaptieve immunologische reactie niet een hoogtepunt bereikt op hetzelfde moment als de klinische huid reactie2,21. Niet alle BCG-ingeënt of Mtb-blootgestelde personen zal ontwikkelen sterke TST reacties en strategieën voor classificatie, en een behandeling van monsters van TST non-responders, evenals een bestaande mycobacteriële overgevoeligheid in de studie bevolking, moeten worden overwogen vóór het initiëren van een recall-proces met behulp van deze methode. Ook, in zowel SB bemonsterings- en visuele scoren, er is een potentieel voor een theoretische vooroordeel bij personen met verminderde huid reacties als gevolg van mondiale of huid-gerelateerde verminderde immuniteit zoals gezien, bijvoorbeeld in de HIV-infectie en bepaalde leeftijdsgroepen2, 13,18,20. Bovendien, is de TST reactie met herhaalde testen in een immunologische systeembeveiliging bekend20,22. Echter blijven de SB cel fenotypen vrij constant wanneer TSTs herhaalde10 zijn. Deze observatie ondersteunt de rol van SB rappel in longitudinale studies van de cellulaire immuunresponsen.

Voor T-cel immunologen zorgt SB terughalen voor de oogst van hoge gehalten van antigeen-specifieke cellen. De timing van SB voor een steekproef uit een PPD-afzetting is echter kritiek als zowel de cellulaire samenstelling als de cytokine communicatie na verloop van tijd veranderen. In dit protocol, blaren waren geïnduceerde 7-day post challenge en de geïsoleerde cellen voornamelijk effector geheugen CD4 + T-cellen met inbegrip van hoge breuken van cellen met een co expressie van IL-2, IFN-gamma en TNF-α. Deze opmerkingen zijn in overeenstemming met eerdere studies beschrijven hoe T-cel activatie, proliferatie en differentiatie plaatsvindt in PPD-primer huid2,15,21. Kinetische SB studies in PPD-gesensibiliseerde personen suggereren dat de zeer vroege reactie van de huid aspecifieke is; echter al binnen de eerste dagen na de PPD-challenge, de reactie wordt gedomineerd door CD4 + T-cellen (beide centrale geheugen en effector geheugen fenotypen is beschreven), en na 3 dagen, de reactie wordt gedomineerd door hoge breuken van PPD-specifieke cytokine productie van CD4 + T-cellen2,8,10,15,21. Deze reactie van adaptieve cytokine nog waarneembaar voor meer dan 2 weken2,8,10,23. Dag 7 post-TST lijkt de meest optimale tijdstip voor het verzamelen van cytokine productie van geheugen CD4 + T-cellen2. Echter, andere tijdstippen, natuurlijk relevant kunnen zijn afhankelijk van het antigeen en de reactie van belang. Van de nota, in een studie, is de adaptieve PPD-reactie gemeld om een beetje eerder met een daling in de afscheiding van pro-inflammatoire cytokine reeds op 5 dagen post-TST10hoogtepunt te bereiken.

SB vloeistof bevat hoge niveaus van zowel pro-inflammatoire cytokines en andere eiwitten aangetoond dat ze representatief zijn voor de huid communicatie15,24. Kinetiek studies hebben aangetoond dat TNF-α en IFN-γ niveaus bij SB vloeistof piek na 3 dagen terwijl IL-2 niveaus piek na 7 dagen2,10, waarschijnlijk als gevolg van de dominantie van adaptieve reacties in dit latere stadium. Omdat SB cellen geactiveerd in vivo geweest, vertonen ze een hoge spontane cytokine release evenals een potentieel voor een specifieke uitgavekwesties op restimulation (Figuur 3 en 4).

Dit verslag concentreert zich op CD4 + T-cel-immuniteit. Zoals aangetoond in Figuur 2, de meerderheid van de geïsoleerde T-cellen waren inderdaad CD4 +, terwijl er bijna geen CD8 + T-cellen in de zuigkracht blister vloeistof. Dit komt overeen met andere studies van de SB PPD-recall rapportage lage proporties en een inferieur trekkende capaciteit van CD8 + T-cellen ten opzichte van CD4 + T cellen2,8,10,23. Een verdere karakterisering van de CD8 + bijdrage zou wenselijk zijn; Dit is echter buiten het bestek van dit verslag.

T-cellen worden beschouwd als essentieel voor de immuun controle van Mtb; het is echter moeilijk vast te stellen een betrouwbare correlaat van bescherming tot uiting in de adaptieve immuunrespons van het bloed25,26. Deze wegversperring belemmert ernstig de ontwikkeling van nieuwe TB vaccins, zoals op dit moment er geen alternatief voor grote en zeer kostbaar werkzaamheid proeven27 is. TB-vaccin ontwikkelaars bepalen vaccin immunogeniciteit door kleine en tijdelijke veranderingen in de vaccin-specifieke T-cel populaties in de bloed28,29te bepalen. Het is echter twijfelachtig of de kleine fractie van antigeen-specifieke T-cellen in het bloed circulerende relevant is (dat wil zeggen, kan migreren naar de site van een infectie en de vertegenwoordiger van de beheersing van de communicatie van de T-cel-rijk Mtb) 27 , 30 , 31 .

Gebaseerd op eerdere studies en de hierin gepresenteerde gegevens, vertegenwoordigt de SB cutane terugroepen model een onbenut potentieel voor de studie van de vaccin-specifieke T-cellen. Niet alleen laat het model een terugroepen van een vaccin antwoord gegenereerd decennia geleden, het staat ook de evaluatie van het ware geheugen potentieel in een weefsel-specifieke context15,18,19,21. Roman, specifieke tests van de huid, waaronder antigenen ook samengesteld van kandidaat-subeenheid TB vaccins, suggereren nieuwe mogelijkheden voor vaccin evaluatie met behulp van dit model28,32. Bovendien transcriptomic analyses suggereren dat een cell - mediated immune reactie gegenereerd in PPD-uitgedaagd huid vergelijkbaar met het antwoord gevonden in de Mtb is-Long18besmet.

Terwijl huid punch biopsieën ook voor de oogst van een cel uit de huid verlenen en ruimtelijke informatie, vergeleken met SB de bemonstering, de methode is meer invasief en enzymatische of mechanische verwerking te bereiden eencellige schorsingen33vereist. Metingen van cytokines en cel markers zijn vergelijkbaar tussen de twee methoden2,10.

De zuiging blister methode is al toegepast in vele gebieden van medisch onderzoek naast Dermatologie, hetzij alleen of in combinatie met een systemische of lokale huid uitdaging. Voorbeelden zijn studies van sepsis, Epstein - Barr virus-geassocieerde proliferatieve ziekten, diabetische neuropathie, glucocorticoide inname effecten en menselijke proeven, testen van therapeutische antistoffen of modellen voor T-cel-gerichte therapieën10 ,34,35,,36,,37,38.

Van een therapeutisch oogpunt, de SB cutane recall methode biedt unieke voordelen bestuderen van de centrale T-cel-geheugen potentiële en -vanuit zowel een biologische en technisch oogpunt-de huid lijkt te bieden een relevante bemonstering compartiment2, 15,18,19,21. Vergeleken met traditionele, passieve bemonstering van circulerende PBMCs, in het bijzonder de SB cutane recall methode geschikt is voor de studie van T-cellen, die hebben bewezen de mogelijkheid om te migreren van de lymfeklier in reactie op hun relevante antigeen en vult u de lokale uitbreiding en differentiatie in een weefsel-specifieke in vivo kader15,18,19,21.

Kortom, het model aangetoond hier relevant voor onderzoekers op het gebied van menselijke adaptieve immuniteit en T-cel targeting agenten (dat wil zeggen, besmettelijke ziekte vaccintechnologie of kanker onderzoek) zou kunnen zijn. Het TST-model toegepast in dit protocol is, natuurlijk, van bijzonder belang op het gebied van TB vaccintechnologie. Het basisconcept van dit model is echter zeer toepassing in andere gebieden van onderzoek.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij willen Mads Radmer Jensen danken voor zijn praktisch en academische advies; Lau Lindqvist en Kaare Svejstrup voor het verschaffen van technische deskundigheid; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov Signe T. Schmidt en Solveig W. Harpøth voor hun technische bijstand; het personeel op de polikliniek Gentofte TB voor hun opleiding in PPD administratie; en alle vrijwilligers voor hun deelname aan de studie. Dit project wordt gefinancierd door de Europese Commissie H2020 programma [subsidie nummer TBVAC2020 643381], en bedank we de partners van het consortium voor de vruchtbare discussies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Handschoenen voor laboratoriumgebruikImtex, Denemarken1013
Desinfectiespray Apotek, Denemarken82% alcohol, met glycerine, voor menselijke huid 
Alcohol doekjesMediq, Denemarken1131892
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml)AJ Vaccines
 Myjector-spuit met vaste naald TerumoA2361 ml/29G/12mm
Linialniet relevant voor evaluatie van huidreactie
Balpenniet relevant voor evaluatie van huidreactie
Draagbare longzuigingseenheidLaerdal Medical, Denemarken78000011OPMERKING.  Gewijzigd voor bereiken onder -40kPa en geleverd met manometer  (ref. 1031107) door de technische afdeling, Hvidovre Ziekenhuis
Onderdeel voor negatieve drukkamer, onverwarmd met aansluitbuisElectronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Gaatjesplaat, 47mm, 10mm gatElectronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Versluitset voor instrumenten voor negatieve drukElectronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Band voor negatieve drukkamer Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA12 inches
Micropore chirurgische tape 3M1533-12,5cm x 9,1m
Dop van 15ml plastic buisSarstedt, Duitsland62.547.254
Tubigrip-verbandMölnlycke Health Care, Zweden1443
Cosmopor steriele zelfklevende dressingHartmann90083377,2 x 5 cm
2ml-spuit Concentric Luer Slip Becton Dickinson 300185
Microlance 23G/30mm naaldBecton Dickinson300700
Safe-Lock microcentrifugebuisjes (geautoclaveerd)Eppendorf 0030120086Geautoclaveerd
Minispin plus centrifugeEppendorf5453000011
Gibco AIM V MediumLife Technologies12055-091

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kiistala, U. Suction blister device for separation of viable epidermis from dermis. Journal of Investigative Dermatology. 50 (2), 129-137 (1968).
  2. Akbar, A. N., et al. Investigation of the cutaneous response to recall antigen in humans in vivo. Clinical & Experimental Immunology. 173 (2), 163-172 (2013).
  3. Hatje, L. K., Richter, C., Blume-Peytavi, U., Kottner, J. Blistering time as a parameter for the strength of dermoepidermal adhesion: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Dermatology. 172 (2), 323-330 (2015).
  4. Smith, T. J., Wilson, M. A., Young, A. J., Montain, S. J. A suction blister model reliably assesses skin barrier restoration and immune response. Journal of Immunological Methods. 417, 124-130 (2015).
  5. Maranda, E. L., et al. Surgical management of leukoderma after burn: A review. Burns: Journal of the International Society of Burn Injuries. 44 (2), 256-262 (2017).
  6. Wilhelm, K. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studiea. Skin Research and Technology: Official Journal of the International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) and the International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) and the International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
  7. Maini, A. A., et al. A Comparison of Human Neutrophils Acquired from Four Experimental Models of Inflammation. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  8. Kenney, R. T., Rangdaeng, S., Scollard, D. M. Skin blister immunocytology. A new method to quantify cellular kinetics in vivo. Journal of Immunological Methods. 97 (1), 101-110 (1987).
  9. Carvalho, J. C. O., Palero, J. A., Jurna, M. Real-time imaging of suction blistering in human skin using optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4790-4795 (2015).
  10. Belson, A., et al. Characterisation of the clinical and activated T cell response to repeat delayed-type hypersensitivity skin challenges in human subjects, with KLH and PPD, as a potential model to test T cell-targeted therapies. Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society ... [et al.]. 65 (5), 389-404 (2016).
  11. Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).
  12. Thakur, A., Pedersen, L. E., Jungersen, G. Immune markers and correlates of protection for vaccine induced immune responses. Vaccine. 30 (33), 4907-4920 (2012).
  13. CDC. TB | Fact Sheets - Tuberculin Skin Testing for TB. , https://www.cdc.gov/tb/publications/factsheets/testing/skintesting.htm (2018).
  14. Vukmanovic-Stejic, M., et al. Varicella Zoster-Specific CD4+Foxp3+ T Cells Accumulate after Cutaneous Antigen Challenge in Humans. The Journal of Immunology. 190 (3), 977-986 (2013).
  15. Reed, J. R., et al. Telomere erosion in memory T cells induced by telomerase inhibition at the site of antigenic challenge in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 199 (10), 1433-1443 (2004).
  16. Tatovic, D., Young, P., Kochba, E., Levin, Y., Wong, F. S., Dayan, C. M. Fine-Needle Aspiration Biopsy of the Lymph Node: A Novel Tool for the Monitoring of Immune Responses after Skin Antigen Delivery. The Journal of Immunology. 195 (1), 386-392 (2015).
  17. Bond, E., et al. Plasmacytoid dendritic cells infiltrate the skin in positive tuberculin skin test indurations. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 114-123 (2012).
  18. Bell, L. C. K., et al. In Vivo Molecular Dissection of the Effects of HIV-1 in Active Tuberculosis. PLoS Pathogens. 12 (3), e1005469(2016).
  19. Tomlinson, G. S., et al. Transcriptional profiling of innate and adaptive human immune responses to mycobacteria in the tuberculin skin test. European Journal of Immunology. 41 (11), 3253-3260 (2011).
  20. Nayak, S., Acharjya, B. Mantoux test and its interpretation. Indian Dermatology Online Journal. 3 (1), 2-6 (2012).
  21. Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).
  22. Menzies, D. Interpretation of Repeated Tuberculin Tests. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (1), 15-21 (1999).
  23. Pitzalis, C., et al. Selective migration of the human helper-inducer memory T cell subset: confirmation by in vivo cellular kinetic studies. European Journal of Immunology. 21 (2), 369-376 (1991).
  24. Kool, J., et al. Suction blister fluid as potential body fluid for biomarker proteins. Proteomics. 7 (20), 3638-3650 (2007).
  25. Flynn, J. L., Chan, J. Immunology of tuberculosis. Annual Review of Immunology. 19, 93-129 (2001).
  26. Kagina, B. M. N., et al. Specific T cell frequency and cytokine expression profile do not correlate with protection against tuberculosis after bacillus Calmette-Guérin vaccination of newborns. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (8), 1073-1079 (2010).
  27. García-Basteiro, A. L., Ruhwald, M., Lange, C. Design of tuberculosis vaccine trials under financial constraints. Expert Review of Vaccines. 15 (7), 799-801 (2016).
  28. Luabeya, A. K. K., et al. First-in-human trial of the post-exposure tuberculosis vaccine H56:IC31 in Mycobacterium tuberculosis infected and non-infected healthy adults. Vaccine. 33 (33), 4130-4140 (2015).
  29. Tameris, M., et al. The candidate TB vaccine, MVA85A, induces highly durable Th1 responses. PloS One. 9 (2), e87340(2014).
  30. Woodworth, J. S., et al. Subunit vaccine H56/CAF01 induces a population of circulating CD4 T cells that traffic into the Mycobacterium tuberculosis-infected lung. Mucosal Immunology. 10 (2), 555-564 (2016).
  31. Gideon, H. P., et al. Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization. PLoS Pathogens. 11 (1), e1004603(2015).
  32. Ruhwald, M., et al. Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon γ release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (4), 259-268 (2017).
  33. He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. P. N. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (110), e52564(2016).
  34. Koskela, M., et al. Blister fluid and serum cytokine levels in severe sepsis in humans reflect skin dysfunction. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 61 (1), 53-61 (2017).
  35. Wada, T., et al. Characterization of skin blister fluids from children with Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease. The Journal of Dermatology. 45 (4), 444-449 (2018).
  36. Andersson, C., Rajala, T., Särkkä, A. Hierarchical models for epidermal nerve fiber data. Statistics in Medicine. 37 (3), 357-374 (2018).
  37. Ramshanker, N., et al. Effects of Prednisolone on Serum and Tissue Fluid IGF-I Receptor Activation and Post-Receptor Signaling in Humans. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 102 (11), 4031-4040 (2017).
  38. Bouma, G., et al. CCL20 neutralization by a monoclonal antibody in healthy subjects selectively inhibits recruitment of CCR6+ cells in an experimental suction blister. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (9), 1976-1990 (2017).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Antigeenspecifieke T cellenflowcytometriecytokinea analysePPD injectieBCG vaccinatiehuidinductieoogsten van blaasjesin vivo analyse

Gerelateerde artikelen