Method Article

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

DOI:

10.3791/57561

⸱

May 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol om amplicon reeks gegevens van bodem, rhizosfeer en wortel endosphere microbiomes te verkrijgen. Deze informatie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling en de diversiteit van de plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen, en is geschikt voor het gebruik met een breed scala van plantensoorten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De intieme interactie tussen plant host en geassocieerde micro-organismen is cruciaal bij het bepalen van de geschiktheid van de plant, en verbeterde tolerantie voor abiotische stress en ziekten kan stimuleren. Als de plant microbiome zeer complexe, goedkope kunnen, zijn high-throughput methoden zoals amplicon gebaseerde sequentiebepaling van het 16S rRNA gen vaak voorkeur voor het karakteriseren van de microbiële samenstelling en diversiteit. De selectie van geschikte methode bij het uitvoeren van dergelijke experimenten is echter cruciaal voor vermindering van de vooroordelen die analyse en vergelijking tussen monsters en studies moeilijk kunnen maken. Dit protocol beschrijft in detail een gestandaardiseerde methode voor het verzamelen en de extractie van DNA van bodem, rhizosfeer en wortel monsters. Bovendien, we markeren een gevestigde 16S rRNA amplicon sequencing pijpleiding, waarmee voor de verkenning van de samenstelling van bacteriële gemeenschappen in deze monsters, en kan gemakkelijk worden aangepast voor andere markers. Deze pijpleiding is gevalideerd voor allerlei soorten van planten, met inbegrip van sorghum, maïs, tarwe, aardbei en agave, en kan helpen bij het overwinnen van kwesties in verband met de besmetting van plant organellen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plant-geassocieerde microbiomes bestaan van dynamische en complexe microbiële gemeenschappen bestaat uit bacteriën, archaea, virussen, schimmels en andere eukaryote micro-organismen. Naast hun goed bestudeerde rol bij het ontstaan van plantenziekten, kunnen plant-geassocieerde microben ook positief beïnvloeden gezondheid van planten door verbetering van tolerantie-doorbraak tot biotische en abiotische stress, bevordering van de beschikbaarheid van nutriënten en verbetering van de groei van de planten door middel van de productie van fytohormonen. Om deze reden bestaat bijzondere belangstelling in het karakteriseren van de taxa die met plant wortel endospheres, rhizospheres en de omliggende grond associëren. Terwijl sommige microben gekweekt in isolatie op laboratorium gegenereerde media worden kunnen, kunnen niet, velen voor een deel omdat ze op symbiotische relaties met andere microben vertrouwen kunnen, zeer langzaam groeien of verplichten de voorwaarden die niet kunnen worden gerepliceerd in een testomgeving. Omdat het de noodzaak voor teelt omzeilt en relatief goedkoop en high-throughput is, reeks gebaseerde fylogenetische profilering van milieu- en host-geassocieerde microbiële monsters geworden een methode voor het analyseren van de microbiële Gemeenschap voorkeur samenstelling.

De selectie van geschikte sequencing technologieën geboden door diverse volgende generatie sequencing (NGS) platformen1 is afhankelijk van de behoeften van de gebruikers, met belangrijke factoren waaronder: gewenste dekking, amplicon lengte, verwacht Gemeenschap diversiteit, evenals sequencing foutenpercentage, lees-lengte, en de kosten-per-run/megabase. Een andere variabele die moet worden beschouwd in amplicon gebaseerde sequencing experimenten is wat gen zal worden versterkt en wat inleidingen worden gebruikt. Bij het ontwerpen of kiezen inleidingen, worden onderzoekers vaak gedwongen om compromissen tussen de universaliteit van de versterking en de taxonomische resolutie haalbare uit de resulterende waarbij. Om deze reden koos deze soorten studies vaak inleidingen en markeringen die selectief gericht zijn op specifieke deelverzamelingen van de microbiome. Evaluatie van de samenstelling van bacteriële Gemeenschappen wordt vaak bereikt door sequentiebepaling één of meer van de hypervariable regio's van de bacteriële 16S rRNA gen2,3. In deze studie, beschrijven we een amplicon gebaseerd sequencing protocol ontwikkeld voor een NGS-platform dat doelstellingen de 500 bp V3-V4-regio van de bacteriële 16S rRNA gen, waarmee een brede versterking van bacteriële taxa terwijl ook het verstrekken van voldoende variabiliteit te onderscheid maken tussen verschillende taxa. Bovendien, kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast voor het gebruik met andere primer sets, zoals degenen die de ITS2 markering van schimmels of de 18S rRNA subeenheid van eukaryoten targeten.

Terwijl andere benaderingen zoals shotgun metagenomics, metatranscriptomics en eencellige sequencing, bieden andere voordelen, waaronder opgelost microbiële genomen en meer directe meting van de functie van de Gemeenschap, zijn deze technieken meestal meer duur en computationeel intensief dan de fylogenetische profilering hier4 beschreven. Bovendien, een groot percentage van leest die behoren tot het genoom van de plant host uitvoeren van shotgun metagenomics en metatranscriptomics op wortel monsters opbrengsten, en methoden om deze beperking ondervangen worden nog steeds ontwikkelde5,6.

Net als bij een experimenteel platform, kan amplicon gebaseerde profiling leiden tot een aantal potentiële vooroordelen die moeten worden onderzocht tijdens de experimentele design en data-analyse. Het gaat hierbij om de methoden van sample collectie, DNA extractie, selectie van PCR inleidingen en hoe de voorbereiding van de bibliotheek wordt uitgevoerd. Verschillende methoden kunnen beduidend beïnvloeden de hoeveelheid bruikbare gegevens gegenereerd, en kunnen ook een belemmering vormen voor de inspanningen om resultaten tussen studies te vergelijken. Bijvoorbeeld, de methode van het verwijderen van de rhizosfeer bacteriën7 en het gebruik van verschillende extractie technieken of keuze van DNA extractie kits8,9 is aangetoond dat ze beduidend beïnvloeden downstream analyse, die leidt tot verschillende conclusies met betrekking tot die microben heden en hun relatieve abundanties zijn. Aangezien amplicon gebaseerde profielen kan worden aangepast, kan waardoor vergelijkingen over studies worden uitdagende. De aarde Microbiome Project heeft voorgesteld dat de onderzoekers bestuderen van complexe systemen, zoals de plant-geassocieerde microbiome van de ontwikkeling van gestandaardiseerde protocollen als een middel profiteren zou voor het minimaliseren van de variabiliteit veroorzaakt door de toepassing van verschillende methoden tussen studies10,11. Hier bespreken we veel van de bovengenoemde onderwerpen en bieden suggesties over beste praktijken waar nodig.

Het protocol toont het proces van verzamelen bodem, rhizosfeer en wortel monsters van Sorghum bicolor en uitgepakt DNA met een gevestigde DNA isolatie kit11. Daarnaast is ons protocol bevat een gedetailleerde amplicon sequencing workflow, met behulp van een algemeen gebruikte NGS-platform, om te bepalen van de structuur van de bacteriële gemeenschappen12,13,14. Dit protocol is gevalideerd voor het gebruik in een brede waaier van plant hosts in een recent gepubliceerde studie van de wortels, rhizosfeer en bijbehorende-bodems van 18 monocot-soorten, met inbegrip van Sorghum bicolor, Zea mays, en Triticum aestivum15. Deze methode is ook gevalideerd voor gebruik met andere markers, zoals blijkt uit de succesvolle toepassing aan het bestuderen van de schimmel ITS2 marker-gen in studies van de agave microbiome16,17 en aardbei microbiome 18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. verzameling en afscheiding van de wortel Endosphere, rhizosfeer en bodemmonsters

  1. Vóór het binnenrijden van het veld, autoclaaf ultrazuiver water (minstens 90 mL water per monster) om te steriliseren. Bereiden epifyt verwijdering buffer (ten minste 25 mL per monster) door toevoeging van 6.75 g van KH2PO4, 8.75 g K2HPO4, en Triton X-100, 1 mL tot 1 L van steriel water. Het steriliseren van de buffer met behulp van een vacuüm filter met 0,2 µm poriegrootte.
    1. Stappen 1,2 tot 1,5, draag schone handschoenen gesteriliseerd met ethanol helemaal keer en vervang de handschoenen tussen elk monster om verontreiniging te voorkomen. Steriliseren van alle apparatuur met 70% ethanol en veeg schoon alle apparatuur tussen de monsters. Vóór de bemonstering, bepalen van de optimale bemonsteringsdiepte voor uw experiment, en in overeenstemming met alle collecties van de bodem en wortel.
  2. Het verzamelen van bulk bodemmonsters, gebruiken een ethanol-gesteriliseerde bodem kern verzamelaar te verkrijgen van de grond die vrij is van plantenwortels door het verzamelen van een kern ongeveer 23 tot 30 cm vanaf de voet van de plant.
  3. De bodem overbrengen in een plastic zak, meng de bodem door zacht schudden en Pipetteer een aliquoot deel van het bodemmonster (ongeveer 600 mg) in te vullen van een tube van 2 mL. Onmiddellijk plaats van de 2 mL-buis op droog ijs of flash bevriezen de buis in de vloeistof N2 tot klaar om te gaan met DNA-extractie (stap 2).
    1. In sommige omgevingen kan de omliggende grond plantaardig materiaal bevatten. In dit geval gebruik een zeef gesteriliseerde 2 mm te scheiden van het puin van de plant uit de grond vóór het plaatsen van het in de plastic zak.
  4. Het verzamelen van de wortel en de rhizosfeer, kunt een schop ethanol-gesteriliseerde graven de plant, om zoveel mogelijk van de wortel mogelijk verzorgen. Diepte is afhankelijk van de plant. Terwijl kleine planten zoals tarwe kunnen worden verwijderd door het graven van meerdere centimeters, grotere planten zoals sorgho voorschrijven 30 cm of meer. Zachtjes afschudden overtollige grond uit de wortels tot er ongeveer 2 mm van de bodem vast te houden aan het oppervlak van de wortel.
    Opmerking: Wees voorzichtig bij het werken met kleine plantjes, met kwetsbare wortels, of in droge, hoge-klei inhoud gronden. In het ideale geval moet alleen er een dun laagje van de bodem op de wortels overblijven na het schudden. Als grote aggregaten van de bodem blijven, kan een rubber hamer te verjagen van de bodem door zachtjes op de basis van de shoot worden gebruikt. Als de hoeveelheid bodem overblijft na dit proces overschrijdt of achterblijft bij 2 mm, moet de geschatte dikte worden opgemerkt.
  5. Voor grote planten, steriele schaar en/of schaar te snijden een representatieve onderafdeling van de wortels en plaatsen van een minimum van 500 mg van wortel weefsel in een 50 mL conische flacon te gebruiken. Voor kleinere grassen, plaatst u de gehele root systeem in de flacon. Voeg genoeg epifyt verwijdering buffer om de wortels te dekken, dan plaatst u onmiddellijk het monster op droog ijs of flash bevriezen het monster in vloeistof N2.
    Opmerking: Wees voorzichtig niet te overvulling van de conische flacon 50 mL, zoals het wassen stap moeilijk zal maken. Er moet voldoende lege ruimte zodanig dat de buffer epifyt vermag stromen naar de bodem rondom de wortels in de flacon en betrekking hebben op de top. Omdat sommige grassen meer wortel biomassa hebben dan in een conische flacon van 50 mL past, moet een subsectie van de wortels worden verzameld. Het dient echter te worden opgemerkt dat het snijden van de wortels kan leiden tot endophytic bacteriën worden gewassen in de rhizosfeer breuk, dus breken wortels moet worden geminimaliseerd. Als monsters niet verwerkt worden onmiddellijk na zijn terugkeer naar lab, kunnen ze worden opgeslagen bij-80 ° C.
  6. Als u wilt scheiden de rizosfeer van de wortels, het monster van de wortel op ijs ontdooien, dan bewerk ultrasone trillingen ten de wortel monsters bij 4 ° C gedurende 10 min met pulsen van 160 W voor 30 s, gescheiden door 30 s. overdracht de wortels in een gekoeld (4 ° C), 50 mL tube met steriel pincet schoon. Gooi niet de originele buis met buffer en de bodem, die de rhizosfeer breuk (Figuur 1).
  7. Centrifugeer de buis met buffer en rhizosfeer voor 10 min bij 4 ° C, 4000 x g. Decant het supernatant, flash bevriezen van de buis met de rhizosfeer breuk in vloeistof N2en bewaren van de rhizosfeer breuk bij-80 ° C tot klaar om te gaan met DNA extractie (stap 2).
  8. Toevoegen om te wassen de wortels, ongeveer 20 mL steriel water gekoeld (4 ° C) tot de Fractie van de wortel. Wassen van de hoofdmap door schudden krachtig (met de hand of mixer, voor 15-30-s), en vervolgens de afvoer van het water.
  9. Herhaal deze stap ten minste tweemaal, totdat er geen bodem overblijft op het oppervlak van de wortel. Als de DNA-extractie (stap 2) niet onmiddellijk wordt uitgevoerd, de wortels in steriele aluminiumfolie wikkelen, flash bevriezen de wortels in vloeistof N2, en winkel de monsters bij-80 ° C tot klaar om verder te gaan met DNA-extractie.

2. DNA-extractie

Opmerking: In stap 2 en 3, schone handschoenen, gesteriliseerd met ethanol moeten worden gedragen te allen tijde en alle werkzaamheden moet worden uitgevoerd op een oppervlak gesteriliseerd met ethanol.

  1. Pak DNA uit de bodem en de rhizosfeer monsters.
    1. Gebruik een steriele spatel snel overbrengen van 250 mg van de bodem en de rhizosfeer van stap 1.3 en 1,7 in gescheiden inzameling buizen waarin een commerciële DNA isolatie kit ontworpen voor extractie uit bodem, dan gaat u verder met DNA-isolatie met behulp van de leverancier van de kit Protocol.
    2. Na eluerende bewaren het DNA in de buffer van de elutie kopen van de DNA isolatie kit, het DNA bij-20 ° C tot klaar om te gaan met stap 3.
  2. Pak DNA uit de wortel monsters.
    1. Chill een gesteriliseerde mortier en een stamper vloeistof N2gebruikt. Afmeten van 600 tot 700 mg wortel weefsel en plaats het weefsel in de mortel. Voeg voorzichtig, genoeg vloeistof N2 ter dekking van de wortels.
    2. Het malen van de wortels in kleine stukjes. Voortzetting van het proces van het toevoegen van de vloeistof N2 en slijpen (minstens twee maal, zijn consistente tussen monsters), totdat de wortels een fijn poeder zijn. Zorg ervoor dat het weefsel van de wortel niet tijdens deze stap doet ontdooien.
      Let op: Gebruik adequate persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en cryogene handschoenen) wanneer werken met vloeistof N2.
      Opmerking: Voor een DNA-extractie van lage kwaliteit, het nuttig kan zijn om overtollige wortels tot poeder vermalen en op te slaan van het poeder bij-80 ° C.
    3. Snel, voordat de wortel begint poeder te ontdooien, een steriele spatel gebruiken voor het overbrengen van de wortel poeder in de vooraf gewogen 1,5 mL buizen op ijs. Record van het gewicht van de buis en poeder. Typisch, 300-400 mg poeder wordt overgedragen.
    4. Gebruik een steriele spatel snel overbrengen wortel poeder 150 mg naar de collectie buis waarin een commerciële DNA isolatie kit ontworpen voor extractie uit bodem, dan doorgaan met DNA-isolatie met behulp van de leverancier van de kit-protocol.
      Opmerking: Voor sommige monsters van root, kan er een hoge concentratie van organische stoffen blijven in de pellet van DNA, waardoor de versterking van DNA tijdens PCR, vooral wanneer een protocol voor extractie van verschillende DNA (bv., CTAB extractie) wordt gebruikt. Indien nodig Reinig het DNA door het volgen van de instructies in het milieu DNA opschonen kit.
  3. Het meten van de concentratie van alle DNA-monsters met behulp van een hoog-gevoeligheids benchtop fluorescentiespectroscopie.
    1. Voeg 1-20 µL van elk eluted DNA-monster in buizen waarin de dsDNA ultragevoelige assay kit. Fluorescentiespectroscopie werkoplossing (1:200 kleurstof: buffer) tot 200 µL toevoegen.
    2. Twee extra buizen met 10 µL van DNA standard 1 (0 ng/µL DNA) of 10 µL van standaard 2 (100 ng/µL) voor te bereiden, en 190 µL van de werkoplossing Fluorescentiespectroscopie toevoegen aan elke standaard.
    3. Het meten van de concentratie van de normen en elk monster. Als het niet automatisch wordt gedaan, berekenen de DNA-concentratie van de output van de extinctie door een lineaire regressie van de twee normen.

3. Amplicon bibliotheek Preparation and Submission

  1. Materialen voor de versterking-reactie instellen.
    1. Ontdooien van DNA-monsters bij 4 ° C en houd ze op het ijs tijdens stap 3. Randomize de volgorde van de DNA-monsters om te minimaliseren van vooringenomenheid als gevolg van de locatie op de plaat van de PCR (tabel 2).
    2. In een 96-Wells PCR plaat, Verdun DNA van elk monster in moleculaire-grade water tot 5 ng/µL in een totaal volume van 20 µL. toevoegen 20 µL van moleculaire-grade water aan de vier hoek putjes als negatieve controles voor versterking (leeg) (tabel 2).
    3. Regelen de barcoded inleidingen (10 µM) in PCR strip buizen of een 96-wells-plaat, zodat ze kunnen worden toegevoegd met een meerkanaals-Pipet (Figuur 2).
    4. Bereiden voldoende PCR master mix te versterken van elk DNA-monster in drievoud. Bereiden van 1,5 µL van BSA (20 mg/mL), 37.5 µL van pre-en-klare 2 x master mix (samengesteld uit PCR buffer MgCl2, dNTPs, en Taq polymerase van DNA), 0,57 µL van chloroplast PNA (100 µM), 0,57 µL van mitochondriale PNA (100 µM), en 25.86 µL van moleculaire rang water.
    5. Giet de master mix in een steriele 25 mL van meerkanaalspipet reservoir en distribueren van 66 µL van master mix in ieder putje van een nieuwe 96-Wells PCR plaat met behulp van een meerkanaalspipet.
      Opmerking: Bij de berekening van de omvang van de reagens van de master mix, zorg ervoor dat ook de 4 lege putten per plaat.
    6. Voeg met behulp van een meerkanaals-pipet 6 µL van 5 ng/µL DNA (van de genormaliseerde DNA-plaat) de plaat master mix. Vervolgens toevoegen aan de basispagina plaat 1.5 µL van 10 µM voorwaartse primer zodat elke kolom heeft een verschillende voorwaartse barcode en 1,5 µL van 10 µM primer omkeren zodat elke rij heeft een verschillende omgekeerde barcode (Figuur 2).
      Opmerking: Voorafgaand aan het toevoegen van inleidingen, de gerandomiseerde platen en master mix kunnen worden gebruikt om de ITS of ITS2 schimmel genen te versterken als verschillende inleidingen werden toegevoegd. Als dit het geval is, kan een gelijksoortige vormgeving van de primer worden gebruikt.
    7. Spin down de plaat kort op 3000 x g. gebruik een meerkanaals-pipet te mengen zachtjes, dan verdelen in drie platen met 25 µL van het reactiemengsel.
      Opmerking: Hoewel drie replicaat-organismen niet strikt noodzakelijk zijn, het vermindert de impact van technische variabiliteit.
  2. Versterken van het DNA in elke plaat met behulp van een thermocycler ingesteld op de volgende voorwaarden: 180 s bij 98 ° C, 30 cycli van: 98 ° C voor 45 s (denaturering), 78 ° C gedurende 10 s (PNA gloeien), 55 ° C gedurende 60 s (primer gloeien), en 72 ° C gedurende 90 s (extensie) , dan 600 bij 72 ° C, gevolgd door een 4 ° C s houd stap. Na de versterking, de drie repliceren platen te bundelen in één enkele 96-wells-plaat.
  3. Kwantificeren van het DNA met ultragevoelige Fluorimeter reagentia in een 96-Wells-afleesapparaat.
    1. 2 µL van elke PCR product toevoegen aan een 96-Wells-microplate, samen met 98 µL van fluorescentiespectroscopie werkoplossing (1:200 kleurstof: buffer). 4 wells als normen omvatten: 5 µL van DNA standaard 1 (0 ng/µL DNA), 1 µL van standaard 2 (10 ng/µL), 2 µL van standaard 2 (20 ng/µL) en 5 µL van standaard 2 (50 ng/µL). Voeg vervolgens Fluorimeter werkende oplossing voor een eindvolume van 100 µL.
      Opmerking: Elk monster kan worden gemeten met behulp van een benchtop Fluorimeter zoals beschreven in stap 2.3 als een afleesapparaat niet beschikbaar is.
    2. Bereken de concentratie van de DNA uit de uitvoer van de extinctie door een lineaire regressie van de vier normen.
    3. Voor het succesvol versterkte barcoded producten (die een gehalte van meer dan 15 ng/µL hebben), zwembad 100 ng van elk monster in de buis van een enkele 1,5 mL (tabel 2).
    4. Bereken de gemiddelde omvang van de monsters die zijn toegevoegd aan de groep met behulp van de functie van de =AVERAGE() in een spreadsheet-programma. Het volume van de "lege" PCR producten toevoegen aan de samengevoegde monsters.
      Opmerking: Aangezien de "lege" PCR producten hun eigen unieke barcode-combinaties hebben, kunnen zij worden sequenced om te controleren op eventuele verontreinigingen laboratorium.
  4. Meten van de concentratie van de gebundelde product met behulp van een benchtop Fluorimeter zoals beschreven in stap 2.3, en neem 600 ng van DNA en Verdun in moleculaire-grade water tot een eindvolume van 100 µL in een 1,5 mL-buis. Opslaan van de resterende gepoolde product bij-20 ° C.
  5. De 600 ng DNA aliquoot wassen door het volgen van de gevestigde PCR zuiveringsproces met paramagnetisch zuivering kralen in een 96-Wells-formaat met een paar uitzonderingen na.
    1. Maak een verse 600 µL aliquoot van 70% ethanol. Schud de fles van magnetische kralen aan resuspendeer kralen dat naar de bodem regelen.
    2. 1 x volume (100 µL) van de oplossing van de parel aan de 600 ng hoeveelheid DNA toevoegen. Meng door pipetteren 10 keer. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Plaats de buis op de magnetische stand gedurende 2 minuten (of totdat de oplossing is duidelijk) te scheiden van de parels van de oplossing. Terwijl de buis is nog steeds in de magnetische staan, gecombineerd het duidelijke supernatant zorgvuldig zonder het aanraken van de magnetische kralen en de duidelijke vloeistof wordt weggeworpen.
      Opmerking: op dit punt, de amplicon-producten zijn afhankelijk van de magnetische kralen. Alle kralen die verstoord of verloren tijdens aspiratie zal resulteren in een verlies van DNA.
    4. Laat de buis in de magnetische standaard en 300 µL van 70% ethanol toe te voegen aan de buis; Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 s. Aspirate uit de ethanol en negeren. Herhaal dit proces, en verwijder alle ethanol na de tweede wash. Verwijderen van de buis van de magnetische stand, en lucht droog voor 5 min.
    5. Voeg toe 30 µL van moleculaire-grade water aan de gedroogde kralen en meng door pipetteren 10 keer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten terugkeer de buis gedurende 1 min de magnetische staan om te scheiden van de parels van de oplossing. Het eluaat overbrengen in een nieuwe buis.
      Opmerking: Magnetische kralen zal geen invloed op downstream reacties.
  6. Meet de eindconcentratie van gereinigd, gebundelde DNA met behulp van een benchtop Fluorimeter zoals beschreven in stap 2.3. Verdun een hoeveelheid tot en met 10 nM in een eindvolume van 30 µL, of om de concentratie en het volume de voorkeur van de sequencing-faciliteit.
  7. Gebruik maken van de diensten van een sequencing faciliteit om het volgnummer van het DNA op een NGS-platform, 2 x 300 bp gekoppeld-einde sequencing.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uitvoeren van het aanbevolen protocol zou moeten resulteren in een dataset van geïndexeerde gekoppeld-einde luidt dat kan worden geëvenaard terug naar elk monster en toegewezen aan ofwel een bacteriële operationele taxonomische eenheden (OTU) of exacte volgorde variant (ESV, ook wel aangeduid als amplicon reeks variant (ASV) en sub-operational taxonomische eenheid (sOTU)), zijn afhankelijk van de downstream-analyse. Kwalitatief hoogwaardige volgorde om gegevens te verkrijgen, moet worden ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol toont een gevestigde pijpleiding voor het verkennen van de wortel endosphere, rhizosfeer en bodem microbiële Gemeenschap composities, uit veld bemonstering monster verwerking en downstream sequencing. Studeren wortel-geassocieerde microbiomes presenteert unieke uitdagingen, wijten gedeeltelijk de inherente moeilijkheden bij steekproeven uit bodem. Bodems zijn zeer variabel in termen van fysische en chemische eigenschappen en verschillende bodemgesteldheid kunnen worden gescheiden door zo weinig als een paar ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS wordt ondersteund door de NSF Graduate Research Fellowship Program.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10/20 µL gefilterde micropipet tipsUSA Scientific1120-3810Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
1.5 mL microcentrifugebuisjesUSA Scientific1615-5510Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
10 µL multi-kanaals pipetEppendorf3122000027Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
10 µL, 100 µL en 1000 µL micropipettenEppendorf3120000909Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
100 µL multi-kanaals pipetEppendorf3122000043Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
1000 µL gefilterde micropipet tipsUSA Scientific1122-1830Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
2 mL microcentrifugebuisjesUSA Scientific1620-2700Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
2 mm bodemzeefForestry Suppliers60141009Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
200 µL gefilterde micropipet tipsUSA Scientific1120-8810Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
25 mL reservoirsVWR International LLC89094-664Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
50 mL conische flesjesThermo Fisher Scientific352098Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
500 mL vacuümfilters (0,2 µm poriegrootte)VWR International LLC156-4020
96-wells microplatesUSA Scientific655900
96-wells PCR platenBioRadHSP9631
Agencourt AMPure XP beadsThermo Fisher ScientificNC9933872Gebruiksaanwijzing:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
AluminiumfolieBoardwalk7124Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
Analytische weegschaal met 0,001 g resolutieOhaus PioneerPA323Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
Bioruptor Plus ultrasoon apparaatDiagenodeB01020001
Bovien Serum Albumine (BSA) 20 mg/mLNew England BiolabsB9000S
CentrifugeEppendorf5811000908Inclusief 50mL en 96-wells plaat bucket adapters
Cryogene handschoenenMillipore SigmaZ183490Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
DNeasy PowerClean kit (optioneel)Qiagen Inc.12877-50Voorheen MoBio
DNeasy PowerSoil kitQiagen Inc.12888-100Voorheen MoBio
Droge ijsAlleNA
DynaMag-2 magneetThermo Fisher Scientific12321DNiet vervangen
EthanolVWR International LLC89125-188Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
Gallon grootte vrieszakjesZiplocNAKan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
Gemini EM Microplate ReaderMolecular DevicesEMKan een andere fluorometer gebruiken die 96-wells platen vanaf de bovenkant kan lezen.
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LabjasWorkriteJ1367Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
Vloeibare N2AlleNAKan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
Vloeibare N2 dewarThermo Fisher Scientific4150-9000Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
Milli-Q ultrapuur waterzuiveringssysteemMillipore SigmaSYNS0R0WW
Mini-centrifugeEppendorf5404000014
Moleculaire kwaliteits waterThermo Fisher Scientific4387937Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
MortarsVWR International LLC89038-150Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
Nitrile handschoenenThermo Fisher Scientific19167032BKan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
Papier handdoekenVWR International LLCBWK6212Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
PCR plaat sealing filmThermo Fisher ScientificNC9684493
PCR stripbuisjesUSA Scientific1402-2700
PestelsVWR International LLC89038-166Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
Kunststof spatelLevGo, Inc.17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000014
PNAs - chloroplast en mitochondriaalPNA BioNAZorg ervoor dat u de sequentie bioinformatico verifieert
Beschermende oogbeschermingMillipore SigmaZ759015Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
Qubit 3.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA HS assay kitThermo Fisher ScientificQ32854
Rubberen hamer (optioneel)Ace Hardware2258622Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
Schaar of schaarVWR International LLC89259-936Kan worden vervangen door equivalent van andere leveranciers.
SchopHome Depot2597400

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592(2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827(2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209(2014).
  6. Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773(2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793(2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062(2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  21. O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047(2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257(2016).
  25. Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004(2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564(2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804(2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258(2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051(2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360(2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Root Microbiome16S rRNA SequencingSoil DNA ExtractionRhizosphere IsolationRoot EndosphereAmplicon Library PreparationPCR PurificationBacterial Community AnalysisPlant Microbiome ProfilingDNA Isolation Kit

Related Articles