Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

6.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57565

⸱

4 mei 2018

 ,  , 
1Department of Biology, Saint Louis University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is spectrophotometrically trans-plasma membraan elektronentransport met behulp van extracellulaire elektronen acceptoren controleren en analyseren van enzymatische interacties die bij deze extracellulaire elektronen acceptoren optreden kunnen.

Samenvatting

Trans-plasma membraan elektronentransport (tPMET) speelt een rol in de bescherming van de cellen van intracellulaire reductieve stress, alsmede bescherming tegen schade door extracellulaire oxidanten. Dit proces van het vervoer van elektronen van intracellulaire reductants naar extracellulaire oxidanten is niet goed gedefinieerd. Hier presenteren we spectrofotometrische tests door C2C12 myotubes om te controleren met behulp van de extracellulaire elektronen acceptoren tPMET: wateroplosbare tetrazolium zout-1 (WST-1) en 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP of DCIP). Door middel van vermindering van deze elektronen acceptoren kunnen we controleren dit proces in een real-time analyse. Met de toevoeging van enzymen zoals ascorbaat oxidase (AO) en superoxide dismutase (SOD) aan het testen, kunnen we bepalen welk gedeelte van de tPMET is te wijten aan ascorbaat export of superoxide productie, respectievelijk. Terwijl WST-1 werd getoond aan stabiele resultaten met lage achtergrond, kon DPIP worden opnieuw geoxideerde na toevoeging van AO en SOD, die werd aangetoond met spectrofotometrische analyse. Deze methode geeft aan een real-time, multi goed, snelle spectrofotometrische bepaling met voordelen ten opzichte van andere methoden gebruikt voor het controleren van tPMET, zoals Hexacyanoferraat (FeCN) en c vermindering van de ferricytochrome.

Inleiding

Het vermogen van gezuiverde plasma membranen te beperken van elektronen acceptoren heeft geleid tot de mening dat het plasma-membraan een inherente redox capaciteit1 heeft. Eerder gezien in schimmels, planten en dieren, is tPMET een proces voor meerdere organismen2,3,4,5. Specifiek, heeft dit proces aangetoond in Saccharomyces cerevisiae, wortel cellen, erytrocyten, lymfocyten, Osteosarcoom, melanoom, macrofagen, skeletspieren en neutrofielen2,3, 4 , 5 , 6 , 7. in een proces dat de elektronen in het plasma-membraan om extracellulaire oxidanten vervoert, tPMET is betrokken bij veel cellulaire functies waaronder:5,8van de groei van de cel, cel levensvatbaarheid9, ijzer metabolisme10, cel11,12,13, en bescherming van reactieve zuurstof soorten12,14,15-signalering. Als gevolg van de tPMET de betrokkenheid in veel cellulaire functies, een verstoring van de tPMET heeft zijn hypothetische om bij te dragen aan de ontwikkeling van sommige ernstige hygiënische omstandigheden, met inbegrip van kanker16, hart-en vaatziekten17, en metabole Syndroom van18.

Er zijn meerdere manieren om te controleren van de overdracht van elektronen in het plasma-membraan, maar de meest gebruikte techniek is om te beoordelen van de vermindering van de extracellulaire elektronen acceptoren via colorimetrische testen. Veelgebruikte extracellulaire elektronen acceptoren zijn tetrazolium zouten, DPIP en FeCN20c19,ferricytochrome. De meest gebruikte tetrazolium zout is een tweede generatie zout bekend als WST-119. Deze compound is makkelijker te gebruiken in de colorimetrische testen in vergelijking met eerste generatie tetrazolium zouten als gevolg van twee sulfonaat groepen, die haar water oplosbaarheid21te verhogen. WST-1, is in samenhang met de tussenliggende elektron acceptor 1-methoxy-fenazine methosulfate (mPMS), verminderd in twee single-electron transfer gebeurtenissen. Deze verlaging verandert de geoxideerde vorm van zwak-gekleurde van WST-1 tot en met een meer intense, gele formazan20,22. WST-1 heeft een hoge molaire extinctie coëfficiënt van 37 x 103 M-1cm-1, wat leidt tot een hoge assay gevoeligheid21,22. DPIP wordt ook gebruikt als een accepteerder extracellulaire elektron te controleren tPMET. Het is aangetoond dat DPIP extracellularly kan worden verminderd door tPMET zonder de hulp van tussenliggende elektronen acceptoren23,24. Als gevolg van het ontbreken van tussenliggende elektronen acceptoren, DPIP kan rechtstreeks pick-up elektronen uit het plasma-membraan, in tegenstelling tot WST-124. Gelijkaardig aan DPIP, FeCN heeft aangetoond dat op tPMET zonder de hulp van tussenliggende elektronen acceptoren19,24extracellularly tot ferrocyanide worden verminderd. In tegenstelling tot WST-1 en DPIP heeft FeCN een lage molaire extinctie coëfficiënt leidt tot een lagere assay gevoeligheid9. Een andere veelgebruikte extracellulaire elektron acceptor te controleren van de tPMET is ferricytochrome c. vergelijkbaar met WST-1, ferricytochrome c vermindering neemt toe met het gebruik van tussentijdse elektron acceptor, mPMS22. In tegenstelling tot WST-1 echter is de ferricytochrome c methode minder gevoelig als gevolg van een achtergrond van hoge en een lage molaire extinctie coëfficiënt22.

Hier presenteren we een methode voor real-time analyse van tPMET via spectrofotometrische testen. De methode gebruikt de extracellulaire elektronen acceptoren WST-1 en DPIP, zoals ze allebei een hoge molaire extinctie coëfficiënt hebben terwijl zijn minder duur in vergelijking met de andere vaak extracellulaire elektronen acceptoren zoals ferricytochrome c gebruikte. We fenazine methosulfate (PMS) gebruikt in plaats van mPMS hebben ze een vergelijkbare chemische make-up en PMS is veel minder duur. mPMS is een fotochemisch stabiel die is een belangrijk kenmerk voor een commerciële kit die een lange houdbaarheid moet. Echter maken we PMS vers voor elke assay, dus stabiliteit niet een probleem moet. Ook presenteren we een methode voor het evalueren van mogelijke enzymatische interacties (Zie Figuur 1) tussen de extracellulaire elektron acceptor en enzymen die kunnen worden gebruikt om verder het karakteriseren van het proces van tPMET. In het bijzonder bepalen de enzymen AO en SOD kunnen worden gebruikt welk gedeelte van de tPMET is te wijten aan ascorbaat vervoer of extracellulaire superoxide release, twee veelgebruikte methoden voor elektronen worden vervoerd over het plasma-membraan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Zie afbeelding 1 voor een schematisch overzicht van de belangrijkste stappen.

1. WST-1 vermindering Assay

  1. Groeien en differentiëren C2C12 Adherente cellen gebruik standaard cel cultuur procedures7 in een 96-wells-plaat met behulp van rijen A-F.
    1. Het gebruik van een medium van de differentiatie van de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 2% paard serum, 100 U/mL penicilline en 0,1 mg/mL streptomycine bestaande. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2.
    2. Bij het toezicht op ascorbaat betrokkenheid in tPMET, een aanvulling op differentiatie media met 100 µM ascorbinezuur. Toestaan dat cellen te broeden in differentiatie media voor ~ 24-48 h.
  2. Bereiden van stamoplossingen van WST-1 en PMS.
    1. Om een voorraad 10 mM van WST-1, Los 0.033 g WST-1 (formule gewicht (FW): 651.34 g/mol) in 5 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaren bij 4 ° C.
    2. Om een 5 mM voorraad van PMS, Los 0.0023 g van PMS (FW: 306.34 g/mol) in 1,5 mL gedeïoniseerd H2O (diH2van O). Bewaren bij-20 ° C en beschermen tegen licht.
  3. Toevoegen van 0.0108 g van glucose voor een eindconcentratie van 5 mM tot 11.4 mL PBS of HEPES zoutoplossing gebufferde (HBS; 20 mM HEPES natrium zout, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM MgSO4, 1 mM CaCl2). Voeg 480 µL van 10 mM WST-1 voor een eindconcentratie van 400 µM en 48 µL van 5 mM PMS voor een eindconcentratie van 20 µM.
  4. Bij het toezicht op ascorbaat betrokkenheid in tPMET, wordt de oplossing in twee 6 mL aliquots verdelen. Één aliquot, voeg 6 µL diH2O en het andere monster toevoegen 6 µL van 2 kU/mL AO voor een eindconcentratie van 2 U/mL.
  5. Bij het toezicht op superoxide betrokkenheid in tPMET, wordt de oplossing in twee 6 mL aliquots verdelen. Één aliquot, voeg 55 µL van 0,1 M KPO4 buffer en het andere monster toevoegen 55 µL van 6.5 kU/mL SOD voor een eindconcentratie van 60 U/mL.
  6. Wassen van de cellen met PBS. De media gecombineerd en voeg 150 µL PBS. Vervolgens gecombineerd de PBS.
    Opmerking: De test wordt gedaan met vergulde, gekoppelde cellen. Dus, is er geen centrifugeren of het gebruik van tripsine in het wasproces.
  7. Voeg 100 µL van WST-1 oplossing (-) SOD of (-) AO naar kolommen 1-6 en voeg 100 µL van WST-1 oplossing (+) SOD of AO (+) op 7-12 kolommen in de 96-wells-plaat. Gebruik rijen G en H als achtergrond controles (dat wil zeggen, om te controleren wijziging in absorptie in het reagens alleen in putten zonder cellen).
  8. Meten van de extinctie waarden met behulp van de spectrofotometer elke 10 min voor 1 h op 438 nm.
  9. Na lezing gecombineerd van de media en elk spoelen met 150 µL van PBS. Vervolgens gecombineerd de PBS.
  10. Bereken de verandering in absorptie voor elk putje door af te trekken van de aanvankelijke extinctie voor een goed van de extinctie op elk punt van de tijd voor dat goed. Het corrigeren van deze wijziging voor de verandering in de extinctie (indien aanwezig) in de achtergrond putten (d.i., putjes met assay oplossing, maar geen cellen) waargenomen.
  11. P.a., normaliseren van de gegevens van de extinctie aan de 60 min controle meting of was putjes met PBS of HBS en voer een bicinchoninic zuur (BCA) eiwit bepaling.
  12. Toevoegen van 2 mg/mL bovien serumalbumine (BSA) standaard (variëren van 0,5-2 µL voor de standaard curve, afhankelijk van de mate van de samenvloeiing van de cellen) de lege putjes (rijen G en H), voegt u de BCA reagens aan alle putjes.
  13. Kwantificeren van de gegevens via nmol van WST-1 vermindering per µg voor eiwit. 37 mM-1 cm-1 22 gebruiken als de coëfficiënt uitsterven voor verminderde WST-1 438 nm.

2. DPIP vermindering Assay

  1. Groeien en differentiëren C2C12 Adherente cellen met dezelfde procedure als stap 1.1.
  2. Voorraad 10 mM DPIP oplossing als volgt voorbereiden. Los 0.029 g DPIP (FW: 290.08 g/mol) in 10 mL diH2O. bevestigen de concentratie van DPIP door het meten van de absorptie bij 600 nm met een spectrofotometer. 1 mM-1 cm-1 23 gebruiken als de coëfficiënt uitsterven voor verminderde DPIP op 600 nm. Bewaren bij 4 ° C.
  3. Voeg 0.0108 g glucose aan 11.880 mL PBS voor een eindconcentratie van 5 mM. Voeg 120 µL van 10 mM DPIP voor een eindconcentratie van 100 µM.
  4. Bij het toezicht op ascorbaat betrokkenheid in tPMET, wordt de oplossing in twee 6 mL aliquots verdelen. Één aliquot, voeg 6 µL diH2O en het andere monster toevoegen 6 µL van 2 kU/mL AO voor een eindconcentratie van 2 U/mL.
  5. Bij het toezicht op superoxide betrokkenheid in tPMET, wordt de oplossing in twee 6 mL aliquots verdelen. Één aliquot, voeg 55 µL van 0,1 M KPO4 buffer en het andere monster toevoegen 55 µL van 6.5 kU/mL SOD voor een eindconcentratie van 60 U/mL.
  6. De media gecombineerd en wassen van cellen in 150 µL van PBS. De PBS gecombineerd en voeg 100 µL van DPIP oplossing (-) SOD of (-) AO naar kolommen 1-6 en voeg 100 µL van DPIP oplossing (+) SOD of AO (+) op 7-12 kolommen in de 96-wells-plaat. Rijen G en H wil gebruiken als achtergrond controles (dat wil zeggen, om te controleren wijziging in absorptie in het reagens alleen in putten zonder cellen).
  7. Meet de extinctie bij het gebruiken van 600 nm spectrofotometer elke 10 min voor 1 h. kwantificeren van de verandering in de extinctie ten opzichte van de controle op 60 min stappen 1.9-1.13 vergelijkbaar.

3. bepaling van of verminderde elektronen acceptoren substraten voor AO of SOD zijn

  1. Voeg aan 5.436 mL PBS of HBS, 240 µL van 10 mM WST-1 voor een eindconcentratie van 400 µM en 24 µL van 5 mM PMS voor een eindconcentratie van 20 µM.
    1. Meng voor DPIP, 60 µL van 10 mM DPIP, voor een eindconcentratie van 100 µM, 5.940 mL PBS of HBS.
  2. Voeg 100 µL van de oplossing voor elk goed in een flat-96-Wells bodemplaat bij gebrek aan cellen en meet de extinctie in een spectrofotometer op 438 nm, voor WST-1 of 600 nm, voor DPIP.
  3. Voeg 1 µL van 10 mM ascorbaat tot de helft van de putten voor een eindconcentratie van 100 μM. Volgen de extinctie totdat het stabiliseert.
  4. Na stabilisatie, voeg 1 µL van 200 U/mL AO voor een eindconcentratie van 2 U/mL aan elk putje of Voeg 1 µL van 6 kU/mL SOD voor een eindconcentratie van 60 U/mL tot elk goed en controleren van de extinctie gedurende 1 uur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Statistieken werden uitgevoerd met ANOVA met herhaalde maatregelen met behulp van RStudio statistische software25. Omvang van de steekproeven zijn aangegeven in de figuur legendes.

Voor het controleren van tPMET, werden C2C12 myotubes gebruikt samen met de extracellulaire elektronen acceptoren, WST-1 en DPIP. AO werd gebruikt om te bepalen welk gedeelte van WST-1 en DPIP vermindering was te wijten aan asc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben twee methoden voor het gebruik van extracellulaire elektronen acceptoren, WST-1 en DPIP, in spectrofotometrische testen om te controleren van de tPMET in C2C12 myotubes gepresenteerd. Met de groei van de cellijnen in standaard cultuur procedures en een afleesapparaat spectrofotometer is het mogelijk om te controleren tPMET met deze elektronen acceptoren in een eenvoudige microplate-assay. WST-1 vermindering van goed-te-goed binnen een bepaling reproduceerbaar is, maar er is dagelijkse variabiliteit. De dagelijk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij wil Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino en Neej Patel Dank voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door de Verenigde Staten Public Health Service award R15DK102122 van het nationale Instituut van Diabetes en de spijsverterings en ziekten van de nier (NIDDK) aan Jonathan Fisher. De inhoud van het manuscript is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIDDK of de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
C2C12 myoblastsAmerican Type Culture Collection CRL-1772
Dulbecco's aangepast arendsmedium - lage glucoseSigmaD6046
Fetal Plex dierenserumcomplexGemini Bio-Products 100-602
penicilline-streptomycineSigma516106
paardenserumGibco Technologies16050-130
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossingSigmaD8537
trypsine-EDTASigmaT4049
15 cm kweekschalenTPP93150
96-well kweekplatenTPP92096
2-(4-Iodofenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-(2,4-disulfofenyl)-2H-tetrazoliunatriumzout (WST-1)Accela ChemBio  IncSY016315
fenazinemethosulfaat SigmaP9625
L-ascorbinezuurSigmaA5960
ascorbaatoksidase SigmaA0157
superoxide dismutase SigmaS5395
2,6-dichioroindofenol natriumzout ICN Biomedicals215011825
D-(+)-glucoseSigmaG7528
HEPES natriumzoutSigmaH3784
natriumchlorideSigmaS7653
kaliumchlorideFisher Scientific BP366
magnesiumsulfaat heptahydraatSigmaM5921
calciumchloride dihydraatSigmaC7902
kaliumfosfaatFisher Scientific BP363
Pierce BCA Eiwit Assay KitThermo Scientific23225
Powerwave X-I spectrofotometerBiotek Insturmentsdiscontinued 
Spectronic Genesys 5 SpectrofotometerThermo Scientific336001
PureGrade 96-well microplate, F-bodem, helder, onbehandeld, niet-sterielMidSci781602
IJzer (II) chloride tetrahydraatSigma220299
IJzer (II) sulfaat heptahydraatSigma215422
hypoxanthineSigmaH9636
xanthine oxidaseSigmaX4500
ExcelMicrosoft
R StudioRstudiohttps://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4Biotek Insturmentsdiscontinued 

Referenties

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89(2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Spectrofotometrische assayWST 1 reductieDPIP reductieascorbaatoxidasesuperoxide dismutasereal time analysemulti wellplaatprote nenormalisatie
Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.