Intracerebroventriculaire behandeling met resiniferatoxine en pijntests bij muizen

Samenvatting

De voorbijgaande receptor potentieel vanilloid type 1 (TRPV1) in de supraspinale regio is voorgesteld om een aantal rollen te spelen in de hersenfunctie. Hier beschreven is een protocol voor intracerebroventriculaire injectie van harsatoxine voor supraspinale TRPV1 desensibilisatie bij muizen. Procedures voor sommige pijntests worden ook gepresenteerd.

Samenvatting

De voorbijgaande receptor potentieel vanilloid type 1 (TRPV1), een thermogevoelig kation kanaal, is bekend dat pijn in de perifere zenuwen trigger. Naast de perifere functie, zijn betrokkenheid bij hersenfuncties is ook gesuggereerd. Resiniferatoxine (RTX), een ultrapotente TRPV1 agonist, is bekend dat langdurige desensibilisatie van TRPV1 induceren, en deze desensibilisatie is een alternatieve aanpak geweest voor het onderzoeken van de fysiologische relevantie van TRPV1-uitdrukkende cellen. Hier beschrijven we een protocol voor intracerebroventriculaire (i.c.v.) behandeling met RTX in muizen. Procedures worden beschreven voor het testen van nociception aan perifere TRPV1 stimulatie (RTX test) en mechanische stimulatie (staart druk test) dan volgen. Hoewel de nociceptieve reacties van muizen die RTX i.c.v. toegediend waren vergelijkbaar waren met die van de controlegroepen, waren RTX-i.c.v.-toegediende muizen ongevoelig voor het pijnstillende effect van paracetamol, wat suggereert dat i.c.v. RTX-behandeling supraspinale selectieve TRPV1-desensibilisatie kan veroorzaken. Dit muismodel kan worden gebruikt als een handig experimenteel systeem voor het bestuderen van de rol van TRPV1 in de hersenen / supraspinale functie. Deze technieken kunnen ook worden toegepast op studies van de centrale acties van andere geneesmiddelen.

Inleiding

Dieren krijgen verschillende fysieke en chemische stimuli uit hun omgeving via sensoren op de perifere zenuwen. De voorbijgaande receptor potentieel vanilloid type 1 (TRPV1) is een van de thermogevoelige, niet-reflecterende kanalen die fungeren als warmtesensoren^1,2, en activering en / of modulatie van TRPV1 staat bekend als een belangrijke stap voor nociception in zowel normale als inflammatoire contexten³. Hoewel het algemene expressiepatroon controversieel is, is ook de expressie van TRPV1 voorgesteld in suprachirurgische regio's, waarbij het betrokken is bij verschillende hersenactiviteiten (waaronder nociception⁴, thermoregulatie⁵, angst⁶, attention deficit hyperactivity disorder⁷en epilepsie⁸). Bovendien is onlangs gesuggereerd dat paracetamol, een veelgebruikte pijnstiller, bemiddelt de activering van centrale TRPV1 om zijn pijnstillende werking^9,10uit te lokken .

Toediening van overtollige TRPV1 agonist met inbegrip van capsaïcine en harsiferatoxine (RTX) aan dieren leidt tot de dood van TRPV1-positieve neuronen en langdurige desensibilisatie van TRPV1 agonisten^11,12. In combinatie met de lokale toepassing (intrathecal^13,14, intracisternal^15,16,17, en intraganglional¹⁸⁾heeft deze chemische ablatiebenadering een alternatieve manier geboden om de fysiologische functies van TRPV1 te onderzoeken. We hebben onlangs gemeld dat intracerebroventriculaire (i.c.v.) injectie van RTX het pijnstillende effect van paracetamol bij muizen remt, wat suggereert supraspinal-selectieve TRPV1 desensibilisatie¹⁹. In dit manuscript presenteren we het precieze protocol voor i.c.v. injectie en daaropvolgende pijntests.

Directe injectie van drugs in de ventrikels van de hersenen maakt het mogelijk om hun centrale effecten te bestuderen terwijl het minimaliseren van eventuele perifere effecten. De i.c.v. injectieprocedure die hier wordt gepresenteerd is een wijziging van de methode die door Haley en McCormick²⁰wordt gerapporteerd. Deze methode is eenvoudig met het inbrengen van een injectienaald in de laterale ventrikels door de coronale hechting en vereist geen speciale apparatuur of chirurgische ingrepen voor cannulation.

Perifere lokale toepassing van TRPV1 agonisten roept een brandend pijngevoel en neurogene ontsteking op. Muizen die systemisch worden behandeld met RTX en TRPV1-KO muizen, zijn ongevoelig voor deze stimulatie¹³. We hebben intraplantar injectie van RTX (RTX test) uitgevoerd om het behoud van de perifere TRPV1 in RTX-i.c.v. te bevestigen. Muizen. Deze methode is een wijziging van de conventionele formaline test²¹.

Er is gemeld dat muizen systemisch behandeld met RTX en TRPV1-KO muizen een normale drempel tonen voor mechanische stimuli^11,13,22. Hier presenteren we een procedure voor de staartdruktest voor het testen van veranderingen in het pijnstillende effect van paracetamol.

Al deze procedures zijn orthodox en veelzijdig, en kan worden toegepast op studies van andere drugs.

Protocol

Alle experimentele protocollen die hier werden gebruikt werden goedgekeurd door het Comité voor dierverzorging en gebruik van de Musashino Universiteit. Mannelijke ddY muizen (SLC, Shizuoka, Japan) werden bewaard voor ten minste 7 dagen onder een 12-h licht / donker cyclus voor experimenten met water en voedsel ad libitum. Voor de experimenten werden 5- of 6 weken oude muizen gebruikt.

1. Bereiding van drugs

1. RTX
   OPMERKING: De alcoholische RTX-oplossing kan ernstige brandwonden en oogletsel veroorzaken. Zorg ervoor dat u rubberen handschoenen en glazen te gebruiken voor bescherming bij het hanteren. Deze voorraadoplossing kan 6 maanden gebruikt worden.
   1. Voeg 500 μL ethanol toe aan 1 mg RTX.
   2. Voeg 500 μL polyoxyethyleen (20) sorbitan monooleaat toe aan de oplossing boven en vortex goed.
   3. Voeg 4 mL fysiologische zoutoplossing toe aan het mengsel en de vortex.
   4. Aliquot 40 μL van de oplossing in 1,5 mL schroefdopbuizen en bewaar ze op -40 °C.
2. Acetaminophen
   1. Voeg 20% w/v propyleneglycoloplossing toe aan paracetamol bij een concentratie van 30 mg/mL en los op met een sonicator. Aangezien paracetamol kan neerslaan bij kamertemperatuur enkele uren na de ontbinding, bereid je vlak voor gebruik of houd de oplossing warm tot gebruik.

2. Onderhuidse of Intracerebroventriculaire injectie van RTX

1. Ontdooi de gevulde oplossing bereid in 1.1. boven en verdun het tot 20 μg/mL in zout- of kunstmatige hersenvocht (ACSF) bestaande uit (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃, 11 glucose, 1,3 MgSO₄, 2,5 CaCl₂ in evenwicht met 95% O₂ en 5% CO₂ (pH 7.2).
2. Verdoven muizen met pentobarbitaal natriumzout (60 mg/kg, intraperitoneally), en controleer op verlies van de rechterreflex.
3. Voor s.c. behandeling injecteer u DE RTX (20 μg/mL) in de achterkant van de nek bij een volume van 0,1 mL/10 g lichaamsgewicht. Voor de controlegroep injecteer u het voertuig (10% ethanol, 10% polyoxyethyleen (20) sorbitan monooleaat en 80% zoutoplossing) op dezelfde manier.
4. Voor i.c.v. behandeling injecteer u 5 μL RTX (20 μg/mL) in de rechter zijkamer. Voor de controlegroep injecteer u het voertuig (10% ethanol, 10% polyoxyethyleen (20) sorbitan monooleaat en 80% ACSF) op dezelfde manier.
   1. Geef een wegwerpnaald van 27 G door een metalen buis (0,8 mm I.D.) om de 3,0-3,5 mm punt van de naald bloot te leggen(figuur 1A).
   2. Desinfecteer het hoofd van de muis met 70% alcohol en houd de squamosale botten van de muis stevig vast met de vingers(figuur 1B).
      OPMERKING: Let op de posities van de squamosale uitsteeksels, omdat deze uitsteeksels zullen dienen als oriëntatiepunten voor injectie.
   3. Beweeg de naald lateraal op de hoofdhuid, en vind de sagittale hechting als de naald tip is verslaafd aan de hechting.
   4. Beweeg de tip ongeveer 1 mm naar rechts, beweeg de tip rostrally, en vind de coronale hechting als met 2.4.3. (Figuur 1B).
   5. Steek de naald langzaam en verticaal, injecteer de RTX-oplossing in ongeveer 10 seconden en houd deze ongeveer 10 seconden vast.
   6. Trek de naald langzaam, en de muis terug te keren naar zijn huis kooi. Bloeden is meestal minimaal of afwezig. Als er ernstige bloedingen optreden, moet het gebruik van een andere muis worden overwogen.
5. Wijs de voorbehandelde muizen toe als proefpersoon voor de RTX-test of de staartdruktest (respectievelijk stap 3 en 4).

3. RTX-test

LET OP: De tests worden uitgevoerd tussen 10:00 en 17:00 uur. De testruimte wordt onderhouden op 200 lux en 24-26 °C.

1. Een week na voorbehandelingen met RTX (Stap 2.) breng je muizen minstens 60 minuten voor aanvang van de test naar de testruimte.
2. Weeg en plaats elke muis afzonderlijk in een plexiglas kooi (29,5 × 17,5 × 13,5 cm³ hoogte) ten minste 30 minuten voorafgaand aan het starten van de test om het mogelijk te maken om te acclimatiseren aan het milieu.
   OPMERKING: De volgorde van de tests moet worden gecompenseerd tussen voorbehandelingsgroepen.
3. 20 minuten voor de test paracetamol (300 mg/kg) toe te dienen aan de muis.
4. Houd de muis losjes in een kleine doek zak, en steek een 30-gauge naald in de hiel van de rechter achterpoot. Breng de naald onderhuids naar de buurt van de looppads en injecteer 20 μL RTX-oplossing (0,05 μg/mL).
5. Meet de periode van likken / bijten gedrag in theglabrous regio van de getroffen poot in elk 5-min blok.

4. Staartdruktest

OPMERKING: Een Randall-Selitto-type drukmeter wordt gebruikt om de drempel voor acute mechanische nociception te beoordelen. De tests worden uitgevoerd tussen 10:00 en 17:00 uur. De testruimte wordt onderhouden op 200 lux en 24-26 °C.

1. Een week na voorbehandelingen met RTX (Stap 2.), breng je muizen naar de testruimte en weeg en plaats je elke muis individueel in een plexiglas kooi.
2. Markeer de vlekken op 1,5 en 2,5 cm van de voet van de staart.
3. Houd de muis losjes in een kleine doek zak, en druk uitoefenen op de vlekken met een stompe sonde.
   OPMERKING: Er wordt een cutoff-druk van 250 g opgelegd om weefselschade te voorkomen.
4. Bepaal de druk die nodig is om ontsnappen gedrag uit te lokken (staart kloppen, draaien, en piepen), en bereken de nociceptive drempel door het gemiddelde van de druk bepaald op de twee plekken.
5. Herhaal stap 4.3. tot 4.4. elke 15 minuten.
6. Na het verkrijgen van de basislijn, toedien paracetamol (300 mg/kg) aan de muis intraperitoneally. Herhaal na toediening stap 4.3. en 4,4 per 15 minuten.

Resultaten

De i.c.v.-behandelde muizen vertonen geen zichtbare afwijkingen in hun uiterlijk, spontane activiteiten, lichaamsgewicht¹⁹ en kernlichaamstemperatuur (met voertuigen behandelde groep, 38,4 ± 0,3 °C, n = 6; MET RTX behandelde groep, 38,7 ± 0,2 °C, n = 6).

Figuur 2A-B toont de responsiviteit van s.c.- of i.c.v.-behandelde muizen op de intraplantar-injectie van ...

Discussie

De meest kritische stap in deze experimenten is het succes van de i.c.v. injectie. De i.c.v. injectietechniek die hier wordt gebruikt is vrij eenvoudig maar vereist wat oefening. Voorafgaand aan experimenten wordt de praktijk met kleurstoffen (bijvoorbeeld 0,5% trypanblauw in zoutoplossing) aanbevolen. Als de injectie correct wordt uitgevoerd, moet een naaldteken zichtbaar zijn op de coronale hechting en moet de geïnjecteerde kleurstof aanwezig zijn in de contralaterale ventrikel en de derde ventrikel. Bovendien moet het...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Resiniferatoxin	LKT Laboratories	R1774	gebruikt voor s.c./i.c.v. voorbehandelingen en de RTX-test
Acetaminophen	IWAKI SEIYAKU		geschonken door IWAKI SEIYAKU
Pentobarbital sodium salt	Tokyo Chemical Industry	P0776	gebruikt voor anesthesie
Ethanol (99,5)	Wako Pure Chemical Industries	057-00456	gebruikt voor het oplossen van RTX
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate	Wako Pure Chemical Industries	161-21621	gebruikt voor het oplossen van RTX
25 μL microsyringe	Hamilton	1702LT	gebruikt voor i.c.v. injectie
100 μL microsyringe	Hamilton	1710LT	gebruikt voor intraplantaire injectie
26-gauge wegwerpnaald	TERUMO	NN-2613S	gebruikt voor i.c.v. injectie
30-gauge wegwerpnaald	NIPRO	01134	gebruikt voor intraplantaire injectie
Drukmeter	Ugo Basile	Analgesy-Meter Type 7200	gebruikt voor staartdruktest