Twee methoden voor Decellularization van plantaardige weefsels voor Tissue Engineering toepassingen

Summary

Hier presenteren we en contrast twee protocollen gebruikt om te decellularize van plantaardige weefsels: een wasmiddel gebaseerde aanpak en een wasmiddel-vrije benadering. Beide methoden zijn achterlaten van de extracellulaire matrix van de weefsels van de plant gebruikt, die vervolgens kan worden gebruikt als steigers voor weefsel waterbouwkundige toepassingen.

Abstract

De transplantaties van het autologe, synthetische en dierlijke momenteel gebruikt als steigers voor weefsel vervanging hebben beperkingen als gevolg van lage beschikbaarheid, arme biocompatibiliteit en kosten. Plantaardige weefsels hebben gunstige kenmerken die ze uniek geschikt voor gebruik als steigers, zoals hoge oppervlakte, uitstekende water transport en retentie, onderling verbonden porositeit, vasculaire netwerken, en een breed scala van mechanische kader van onderzoekopleiding Eigenschappen. Twee succesvolle methoden van plant decellularization voor weefsel waterbouwkundige toepassingen worden hier beschreven. De eerste methode is gebaseerd op wasmiddel baden om cellulaire kwestie, die vergelijkbaar met de eerder vastgestelde methoden gebruikt is om duidelijk zoogdieren weefsels. De tweede is een wasmiddel-vrije methode aangepast van een protocol dat isoleert blad therapieën en impliceert het gebruik van een verwarmde bleekmiddel en zout bad om te wissen van de bladeren en stengels. Beide methoden leveren steigers met vergelijkbare mechanische eigenschappen en de lage cellulaire metabole effecten waardoor de gebruiker kan het protocol dat beter aansluit bij hun beoogde toepassing selecteren.

Introduction

Weefselengineering ontstaan in de jaren 1980 maken levend weefsel substituten, en potentieel adres belangrijke orgaan- en weefsel tekorten¹. Een strategie hanteert steigers te stimuleren en begeleiden van het lichaam om te regenereren ontbrekende weefsels of organen. Hoewel geavanceerde productie benaderingen zoals 3D-printen steigers met unieke fysieke eigenschappen hebben geproduceerd, blijft de mogelijkheid voor de vervaardiging van steigers met een breed scala van haalbare fysische en biologische eigenschappen een uitdaging^{2 , 3}. Bovendien, als gevolg van een gebrek aan een functionele vasculaire netwerk, deze technieken hebben beperkt gebleven in het regenereren van 3-dimensionale weefsels. Het gebruik van decellularized dierlijke en menselijke weefsels als steigers heeft geholpen in het omzeilen van dit probleem^4,5,6,7. Echter hoge kosten-charges-variabiliteit en beperkte beschikbaarheid kunnen het beperken van wijdverbreide gebruik van decellularized dier steigers⁸. Er bestaat ook bezorgdheid over mogelijke overdracht van de ziekte aan patiënten en immunologische reactie op sommige decellularized zoogdieren weefsels⁹.

Cellulose, afgeleid van plant en bacteriële bronnen, is uitgebreid gebruikt voor het genereren van biomaterialen voor een brede waaier van toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Enkele voorbeelden zijn: bot, kraakbeen^12,13,14 ,^10,11en wond genezing van¹⁵. Steigers die bestaan van cellulose hebben een bijkomend voordeel dat ze zijn duurzaam en resistent tegen cellen van zoogdieren wordt uitgesplitst. Dit is vanwege het feit dat zoogdiercellen geen produceren de enzymen die nodig is voor het uitsplitsen van cellulose moleculen. Ter vergelijking, steigers geproduceerd met behulp van macromoleculen uit de extracellulaire matrix, zoals collageen, worden gemakkelijk afgebroken¹⁶ en mogelijk niet geschikt zijn voor langdurige toepassingen. Collageen steigers kunnen worden gestabiliseerd door chemische dwarsbinding. Er is echter een trade-off als gevolg van de inherente toxiciteit van de cross-linkers die invloed hebben op de biocompatibiliteit van de steigers¹⁷. Omgekeerd, cellulose heeft het potentieel om te blijven aanwezig op de plaats van implantatie voor langdurig van tijd, want het is ongevoelig voor enzymatische afbraak door zoogdiercellen^18,19,20. Dit kan worden gewijzigd door het afstemmen van het tarief van aantasting door middel van hydrolyse voorbehandeling en co levering van de steigers met cellulases²¹. De biocompatibiliteit van decellularized plantgerelateerde cellulose steigers in vivo is ook aangetoond in een studie gedaan op muizen²².

Door honderden miljoenen jaren van evolutie, hebben planten hun structuur en samenstelling te verhogen van de efficiëntie van vloeibare vervoer en bewaring verfijnd. Plant vasculaire vaartuigen minimaliseren hydraulische weerstand door vertakking naar kleinere schepen, vergelijkbaar met de zoogdieren therapieën volgens Murray's wet²³. Na decellularization, wordt van de plant complex netwerk van vaartuigen en onderling verbonden poriën onderhouden. Gezien het grote aantal verschillende plantensoorten beschikbaar hebben plantgerelateerde steigers het potentieel om te overwinnen ontwerpbeperkingen, beïnvloeden momenteel steigers in weefsel engineering^24,25. Bijvoorbeeld, Modulevsky et al. aangetoond dat angiogenese en cel migratie gebeurde toen decellularized apple weefsel subcutaan werd ingeplant op de achterkant van een muis-²². Ook Gershlak et al. toonde aan dat endotheliale cellen kunnen volwassen binnen de therapieën van decellularized bladeren²⁴. In een afzonderlijk experiment waren Gershlak et al. ook kunnen laten zien dat cardiomyocytes kon worden gekweekt op het oppervlak van bladeren en waren in staat om een contract van²⁴.

Planten bevatten ook complexe organisatie van de cellulaire naar de macroscopische schaal, die moeilijk is te bereiken zelfs met de meest geavanceerde productie-technieken ontwikkeld tot nu toe. De complexe hiërarchische ontwerp van plantaardige weefsels maakt hen sterker is dan de som van hun kiezers²⁶. Planten bezitten een overvloed aan verschillende mechanische eigenschappen, variërend van stijve en taai componenten zoals stengels, bladeren aan veel meer flexibel en plooibaar degenen zoals²⁷. Bladeren variëren, afhankelijk van de soorten in termen van grootte, vorm, sterkte, de mate van vascularisatie, breken en kunnen verschillende graden van hydrophilicity. Over het geheel genomen, suggereren de eigenschappen van deze plant dat decellularized planten als unieke en zeer functionele medische hulpmiddelen dienen kunnen, met inbegrip van als weefsel engineering van steigers.

Dit protocol richt zich op twee methoden om te decellularize van plantaardige weefsels, zoals bladeren en stengels, voor gebruik als steigers in weefselengineering. De eerste methode is een wasmiddel gebaseerde techniek die maakt gebruik van een reeks van Baden om DNA en cellulaire kwestie, die werd aangepast van een veel gebruikte techniek om decellularize zoogdieren en plantaardige weefsels^{6,22,25 te verwijderen ,28,29,30}. De tweede methode is wasmiddel-vrij en is aangepast van een protocol van de "skeletonization" gewoonlijk gebruikt voor het verwijderen van de zachte weefsels van bladeren³¹. Voorafgaande werk bleek dat scheiding van de therapieën van de omliggende weke delen³¹sudderen bladeren in een bleekmiddel, en natriumbicarbonaat oplossing vergemakkelijkt. Deze techniek kan worden aangehaald terug naar experimenten uitgevoerd in de 17^th en^th 18 eeuwen, zoals het werk van Albertus Seba³² en Edward Parrish³³. Deze experimenten gecentreerd rond het verlaten van plantaardig materiaal, zoals bladeren en vruchten, ondergedompeld in water voor langere tijd (weken tot maanden) en waardoor de zachtere tissues aan verval weg natuurlijk. Hier is de "skeletonization"-benadering aangepast voor het gebruik van mildere omstandigheden, zoals langere incubatietijd tijden bij lagere temperaturen, cellulaire resten te verwijderen en om te voorkomen dat aanzienlijk verstoren de weke delen structuur. Voor de experimenten hierin gedetailleerd, drie installatie types werden gebruikt: Ficus hispida, Pachira aquatica en een soort Garcinia. Resultaten van DNA kwantificering, mechanische tests en impact op de cellulaire metabole activiteit van beide methoden worden beschreven.

Protocol

1. decellularization van weefsel van de Plant met behulp van het wasmiddel gebaseerde benadering

1. Gebruik verse of bevroren F. hispida, blad monsters. Bevriezen van ongebruikte verse monsters in een vriezer van-20 ° C en een winkel voor toekomstig gebruik (tot een jaar).
   Opmerking: Gebruik stengel of blad weefsel van bijna alle gewenste planten. Uitgebreide opslag tijden kunnen leiden tot schade aan de weefsels.
   1. Bepalen van de grootte en vorm van de monsters worden verwerkt op basis van het gebruiksdoel van het monster (d.w.z. monsters in reepjes gesneden zijn goed geschikt voor mechanische testen toepassingen, ondertussen 8 mm schijf monsters zijn nuttig in multi goed kweken toepassingen ). Snijd het blad in 8 mm schijven met een scherpe, schone biopsy punch terwijl ondergedompeld onder kamertemperatuur (20-25 ° C) gedeïoniseerd H₂O.
      Opmerking: Dit protocol kan worden gebruikt op hele bladeren en stengels. Kleinere monsters zal echter sneller decellularize.
   2. Incubeer de monsters gedurende 5-10 minuten op kamertemperatuur (20-25 ° C) gedeïoniseerd H₂O in een shake plaat ingesteld op een lage snelheid-instelling om te wassen en/of ze ontdooien. Gebruik genoeg gedeïoniseerd H₂O om ervoor te zorgen alle monsters grondig wordt bevochtigd.
2. Bereiden van een oplossing van 10% (m/v) natrium dodecyl sulfaat (SDS) in gedeïoniseerd H₂O. plaats de monsters in een geschikte container (een glas of kunststof schotel is ideaal) en het toevoegen van SDS oplossing voor het volledig bedekt de monsters. Incubeer monsters gedurende 5 dagen bij kamertemperatuur (20-25 ° C) op een shake plaat ingesteld op een lage snelheid ter voorkoming van schade aan de monsters.
   Opmerking: De container niet overcrowd als dit kan het proces van decellularization vertragen en tot ongelijke behandeling van de SDS leiden. Tijdens deze stap monsters moeten het verwerven van een bruine tint.
   1. Na 5 dagen, vervangen door de oplossing van de SDS gedeïoniseerd H₂O. Incubate de monsters voor een extra 10-15 minuten op de plaat van de shake te grondig afspoelen elke resterende SDS-oplossing.
3. Voorbereiden van een 1% (v/v) niet-ionogene oppervlakteactieve stof in 10% (v/v) bleekwater oplossing. Om een oplossing van 500 mL, Meng 5 mL van de niet-ionogene oppervlakteactieve stof met 50 mL bleekwater dan Voeg 445 mL gedeïoniseerd H₂O. Submerge monsters in de vers bereide oplossing.
   Opmerking: De niet-ionogene oppervlakteactieve stof/bleekwater oplossing hoeft niet een lange houdbaarheid, dus, binnen de 48u van voorbereiding moet worden ingezet.
4. Vervang de niet-ionogene oppervlakteactieve stof/bleekwater oplossing elke 24 h totdat de monsters worden volledig gewist (Zie figuur 1A voor visuele vergelijking). Vervolgens Incubeer het monster in gedeïoniseerd water op een plaat schud gedurende 2 minuten om te spoelen uit de overmaat niet-ionogene oppervlakteactieve stof/bleekwater oplossing. De shake plaat ingesteld op een lage instelling Voorkom beschadiging van de monsters.
   Opmerking: De tijd die nodig is om duidelijk de gebruikte monsters varieert, afhankelijk van het type en de soorten van de plant. De volledige verkleuring van de monsters is een indicatie van de volledige decellularization (uitvoeren DNA kwantificering zodat grondige clearing).
   1. Lyophilize van de monsters voor het opslaan van hen tot een jaar (flitser bevriezing met behulp van vloeibare stikstof is voorkeur, bevriezing van de monsters in-80 ° C is eveneens aanvaardbaar) en bewaar ze bij kamertemperatuur (20-25 ° C) in de lage luchtvochtigheid.
   2. Reconstrueren van monsters in Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) met genoeg om jas monsters. Spoel monsters 2 - 3 keer in serumvrij media voorzichtig met behulp van een micropipet vóór gebruik (dat wil zeggen gebruik 150-300 µL per spoelen, in een standaard 24 goed bord).
      Opmerking: Tris-HCl buffer en serumvrij media (dat wil zeggen DMEM, maar elke fundamentele celkweek media kan worden vervangen) zijn effectiever in het verminderen van de impact op de levensvatbaarheid van de cellen van SDS behandeld monsters dan die met gedeïoniseerd H₂O alleen behandeld.

2. bereiding van de monsters met behulp van de aanpak van het wasmiddel-vrije Decellularization

Opmerking: De eerste stappen van deze procedure overeen met stap 1.1-1.1.2 (zie hierboven).

1. Bereid een 5% (v/v) bleekmiddel (NaClO) en 3% (m/v) natriumbicarbonaat (NaHCO₃) oplossing. Verwarm de oplossing in een zuurkast tot 60-70 ° C voor F. hispida blad monsters gesneden in 8 mm schijven al roerend op een hete plaat.
   Opmerking: De natriumbicarbonaat kan worden vervangen door natrium carbonaat (nb₂CO₃), of natriumhydroxide (NaOH). De gewenste temperatuur verschilt sterk (kamertemperatuur tot 90 ° C) en moet worden aangepast volgens de eigenschappen van de gebruikte monsters.
2. Zodra de oplossing de gewenste temperatuurbereik bereikt, onderdompelen van de monsters en de opzwepende snelheid om te voorkomen beschadiging van hen te verminderen. Nadat de monsters zichtbaar zijn uitgeschakeld (Zie figuur 1B voor visuele vergelijking), zorgvuldig uit het bad te verwijderen. Incubeer monsters eenmaal in gedeïoniseerd H₂O voor 1-2 min voor het verwijderen van overtollige bleekwater oplossing.
   Opmerking: De tijd die nodig is om duidelijk de monsters sterk kan verschillen. Gesneden peterselie kan bijvoorbeeld worden gewist in 10-15 min, terwijl dikkere en/of grotere monsters, zoals hele bladeren of stengels uren in hoge-temperatuur Baden duren kunnen om volledig duidelijk.
3. Lyophilize van de monsters en bewaar ze bij kamertemperatuur (20-25 ° C) in de lage luchtvochtigheid.

Results

Beide methoden leverde steigers die waren geschikt voor celkweek en weefsel technische toepassingen. Figuur 1 toont de algemene workflow voor het proces van de decellularization met behulp van een intact blad voor het wasmiddel gebaseerde methode en gesneden monsters (8 mm doorsnede) voor de wasmiddel-vrije methode. Succesvolle decellularization van Ficus hispida weefsels na beide methoden leverde duidelijke en intact monsters (f...

Discussion

Hierin worden twee methoden om te decellularize van plantaardige weefsels beschreven. De resultaten die hier gepresenteerd in combinatie met de resultaten van voorafgaande studies²⁵, suggereren dat de protocollen uitwaardigen waarschijnlijk zijn die van toepassing zijn op een breed spectrum van plantensoorten en kunnen worden uitgevoerd op zowel de stengels en de bladeren. Deze procedures zijn eenvoudig en vereisen geen speciale apparatuur, zodat plant decellularization in de meeste laboratoria ka...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Life Science	75746-1KG
Triton X-100	MP Biomedicals, LLC	807426	Non-ionogene oppervlakteactieve stof waarnaar in het artikel wordt verwezen. Zeer stroperige reagentia, kan helpen om het uiteinde van de pipettenpunt af te snijden bij het opzuigen.
Geconcentreerd bleekmiddel (8,25% natriumhypochloriet)	Clorox	Artikelnr.: 31009	Standaard geconcentreerd bleekmiddel.
Natriumbicarbonaat	Acros Organics	217120010	Kan worden vervangen door natriumhydroxide of natriumcarbonaat.
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	Snijdt monsters die goed passen in een 24-wells plaat
Belly Dancer-schudtafel	Stovall Life Sciences	BDRAA115S	Gebruik lage snelheden om weefsels niet te beschadigen. Kan elk model/merk schudtafel gebruiken.
Isotemp hot/stir plate	Fisher Scientific		Kan elk type/merk hot/stir plate gebruiken.
Kolf	Willekeurig		Kan elke maat kolf gebruiken zolang deze bij uw monsters past en deze niet overbelast.
Tris Hydrochloride	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM	Corning	MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay	Life Technologies	P11496	Kan elke dsDNA kwantificeringsmethode gebruiken die beschikbaar is.