Kwantitatieve analyse van de Micro-CT van Aortopathy in een muismodel van β-aminopropionitrile-geïnduceerde aorta aneurysma en dissectie

Summary

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie van het gebruik van een radiopaak loodhoudende silicone rubber te perfuse de lymfkliertest therapieën voor de diameter van de aorta kwantificering in een muismodel van aorta aneurysma en dissectie.

Abstract

Aneurysma van de aorta dissectie is geassocieerd met significante morbiditeit en sterfte in de bevolking en zeer dodelijk kunnen zijn. Hoewel diermodellen van aorta ziekte bestaan, in vivo beeldvorming van de therapieën beperkt gebleven. In de afgelopen jaren, micro-gecomputeriseerde tomografie (micro-CT) heeft ontpopt als een voorkeur modaliteit voor zowel grote als kleine vaartuigen imaging zowel in vivo als ex vivo. In combinatie met een methode van vasculaire gieten, hebben we met succes gebruikt micro-CT te karakteriseren de frequentie en de verdeling van de aorta pathologie in β-aminopropionitrile-testgroep C57/Bl6 muizen. Technische beperkingen van deze methode zijn variaties in de kwaliteit van de perfusie geïntroduceerd door slechte voorbereiding van de dieren, de toepassing van de juiste methodologieën voor vaartuig grootte kwantificering, en het niet-overlevingsvermogen van deze procedure. In dit artikel een overzicht van een methodologie voor de intravasculaire perfusie van een loodhoudende radiopaak siliconen rubber voor de kwantitatieve karakterisering van aortopathy in een muismodel van aneurysma en dissectie. Naast het visualiseren van aorta pathologie, kan deze methode worden gebruikt voor de behandeling van andere vasculaire bedden in vivo of post-mortem-vasculaire bedden verwijderd.

Introduction

De incidentie van Aortadissectie is 3 gevallen per 100.000 per jaar¹. Aortadissectie en aneurysmal ziekten goed voor meer dan 10.000 doden in de Verenigde Staten elk jaar, goed voor 1-2% van alle sterfgevallen in westerse landen². Aortadissectie wordt geïnitieerd door een scheur in de intima laag van het schip met de verspreiding van bloed door de lagen van de aorta muur onder fysiologische druk. Verhoogde patiënt pulse druk worden geassocieerd met een verhoogde incidentie van dissectie en complicaties. Verhoogde muur schuifspanning wordt geassocieerd met de uitbreiding van de aorta muur leidt tot een aneurysma vorming^3,4. Gevolgen van Aortadissectie omvatten de occlusie van de bloedtoevoer naar verre organen, inclusief de hersenen, nieren, darmen, en ledematen, de vorming van chronische aneurysmata, breuk of dood^5,6,7.

Op dit moment worden de biochemische en cellulaire processen die betrokken zijn bij de inleiding en de progressie van de aorta aneurysma en dissecties nog slecht begrepen. Reproduceerbaar diermodellen van aorta aneurysma en dissectie worden sleutel tot het begrijpen van hun pathofysiologie. Β-aminopropionitrile (BAPN) is een lysyl oxidase remmers, die voorkomt dat de cross-linking van elastine en collageen en is aangetoond dat aanzienlijk veranderen de structuur van de muur van de extracellulaire matrix van schip en de biomechanische integriteit^{6, 8}. Knaagdieren die zijn behandeld met BAPN hebben gebruikt als een gemeenschappelijke diermodel van aorta aneurysma en dissectie^9,10.

Vasculaire beeldvormende modaliteiten zijn instrumenteel in het identificeren van vasculaire pathologie, bevestiging van schip bij, en evalueren van orgel perfusie. Onlangs, micro-berekend tomografie (micro-CT) is gebruikt om te bestuderen van de therapieën van muizen en ook grote dieren. In tegenstelling tot het bot is de axiale beeldvorming van de bloedvaten door computertomografie beperkt, zoals intraluminale bloed inherent relatief radiolucente is. Wanneer gecombineerd met intravasculaire contrastmiddelen, echter kan micro-CT gedetailleerde driedimensionale reconstructies van dierlijke vasculatures voor de studie van macro-anatomische vasculaire pathologie¹¹.

De geselecteerde contrast agent is (Zie de Tabel van materialen) een radiopaak silicone rubber dat lood chromaat en lood sulfaat bevat. Bij perfusie in aanwezigheid van een katalysator, verhardt het snel om te vormen van een cast van de therapieën met minimale wijzigingen in de macro-anatomische architectuur van de schepen, waardoor de therapieën zeer radiopaak in tegenstelling tot de achtergrond weefsels wanneer röntgenologisch onderzocht. Deze agent contrast is voordelig omdat het is gemakkelijk te hanteren en vermijdt de aantasting van het weefsel en het vaartuig verlies als gevolg van breuk vaak geassocieerd met vasculaire cast corrosie. Zoals het geneest met minimale krimp¹², schepen gewist van bloed blijven octrooi en zorgen voor een correcte inschatting van de dierlijke macro-therapieën in de niet-survival experimenten. Vorige werk heeft met succes gebruikt voor radiopaak silicone rubber-contrast in een verscheidenheid van dierproeven. Specifiek, is toepasbaarheid in het visualiseren van de coronaire, glomerulaire, placenta, en de cerebrale circulatie^{11,12,13,14,15} aangetoond. In deze paper detailleren wij de methodologie van open links-ventriculaire punctie voor de intravasculaire perfusie van loodhoudende radiopaak silicone rubber te karakteriseren kwantitatief BAPN-geïnduceerde aorta pathologie in een muismodel door micro-CT.

Protocol

De protocollen voor het hanteren van dieren werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de Universiteit van Maryland, Baltimore (dierlijke protocolnummer 0116024) en uitgevoerd volgens AAALAC internationale normen.

1. bereiding van reagentia

1. Heparine
   1. Verdun 250 µL van 1000 U/mL heparine sulfaat in 50 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing om een eindconcentratie van 5 U/mL.
   2. Warm de heparinized (5 U/mL) met fosfaat gebufferde zoutoplossing, ter vervanging van het bloed in de therapieën in een waterbad ingesteld op 37 ° C.
   3. Bereiden de pomp druk-gecontroleerd door het aansluiten van de benodigde buizen en 2 leeg 10 mL spuiten, 1 voor de buffer van de EDTA-zoutoplossing en 1 voor de contrast-agent.
   4. Vul de slang met de warme EDTA fosfaatgebufferde zoutoplossing en verwijder de luchtbellen uit de slang van de drukpomp.
2. Contrast agent
   Opmerking: Gelieve te verwijzen naar de Tabel van materialen voor de contrast agent kit bestanddelen.
   1. Meng een gepigmenteerde compound met een oplosmiddel om een 1:6-kleurstof verdunningsmiddel verhouding.
   2. Voeg onmiddellijk vóór gebruik (stap 2.3.12), 200 µL van een genezen agent aan elk aliquot 5 mL van de verdunde gepigmenteerde compound en meng ze goed (4% van hun volume).
      Opmerking: De fabrikant gemeld dat de arbeidstijd is 40 min. Als de siliconen-rubber contrast agent begint te polymeriseren 20 min na toevoeging van de uithardende agent, is het belangrijk om voor te bereiden van de oplossing vóór haar infusie.
3. BAPN drinkwater
   1. Β-aminopropionitrile (BAPN) ontbinden in drinkwater maken een eindconcentratie van 3 g/L (aangepast vanuit protocollen die hierboven worden beschreven in de literatuur)^9,16,17.
   2. Beheren van het drinkwater BAPN-bevattende aan een groep van muizen als ze eenmaal 4 weken oud tot het tijdstip van perfusie voor micro-CT. zijn

2. de chirurgische Procedure

1. Dierlijke voorbereiding
   1. Spenen van de muizen op 3 weken leeftijd, onderhouden ze op een 12 h licht/12 h donker cyclus en voeden ze standaard knaagdier chow. Beheren voor het BAPN-testgroep, vers bereide BAPN drinkwater voor 16-26 weken ad libitum. Bieden dat de controledieren met standaard drinken water ad libitum.
2. Verdoving techniek
   Opmerking: 24 h vóór het CT-analyse, de volgende procedure wordt uitgevoerd. Chirurgische ingrepen worden uitgevaardigd ter voorbereiding van het model van een postmortem intracardiac perfusie.
   1. Induceren een verdoving via een inductie tank met 100% O₂ en 3% Isofluraan geleverd via een vaporizer precisie. Na de inductie van de anesthesie, staken de Isofluraan en leegmaken van de kamer met O₂. Het handhaven van de narcose met 2 tot 2,5% Isofluraan en 1 L/min voor O₂ via een neus kegel.
   2. Zowel de kamer van de inductie en de gelaatsmasker koppelen aan een houtskool scavenger voor afgassen adsorptie ter bescherming van personeel. Zorgen voor een voldoende verdoving vliegtuig door aan te tonen dat er geen antwoord op schadelijke stimuli (Teen snuifje is).
   3. Een operatieve veld dat bestaat uit een chirurgische lade en de noodzakelijke chirurgische instrumenten voor te bereiden.
   4. Het dier overbrengen in het chirurgische gebied en plaats deze in de dorsale ligcomfort.
3. Operatietechniek
   1. Met behulp van schaar, maken een middellijn incisie door de huid en weke delen vanaf midden tussen de symphysis pubica aan de sternale inkeping, uit te breiden door de huid en weke delen overliggende van het borstbeen.
   2. Maak met schaar een gaatje in het middenrif bij het proces van de xiphoid in te voeren van de borstholte.
   3. Gebruik schaar te ontleden van het membraan van de ventrale borstwand, bilateraal.
   4. De ribben kraakbeen te scheiden van de ribben van het borstbeen rechts sternale grens doorsnijden.
   5. Een fijne hemostatische klem van toepassing op het puntje van het borstbeen (in de buurt van de xiphoid process) en de hemostat cranially te verplaatsen, zodat deze op het hoofd van de muis is geplaatst. Dit zal de zwezerik en borstbeen van het hart, het hart en de grote schepen voor verdere manipulatie bloot intrekken.
   6. Scherp ontleden eventuele bijlagen tussen het centrum en de borstwand.
   7. De 27-gauge IV katheter naald verbinden met een injectiespuit voorgeladen met 10 mL EDTA fosfaatgebufferde zoutoplossing (5 U/mL) en vul alle buizen met de buffer om de luchtbellen uit de buizen van de drukpomp verwijderen.
   8. Wees voorzichtig bij de voorbereiding van de vloeistof als de bubbels in de vloeiende lijn kan belemmeren het vullen van kleinere schepen. Beperk het aantal vaartuigen die zijn beschadigd tijdens de dierlijke voorbereiding, omdat dit leiden de contrast-agent tot zal te lekken uit de afgehakte vaartuigen, het volume nodig voor een volledige vulling en de invoering van artefacten aan de definitieve imaging wijzigen.
   9. Het linkerventrikel doorprikken met een 27-gauge-naald die met een rechte hoek-klem is gestabiliseerd. Onmiddellijk incise de rechterventrikel of de vena cava inferior om drain het heparine oplossing en het bloed.
      Opmerking: Heparine wordt gebruikt om te voorkomen dat het bloed van stolling in de schepen na de dood van het dier als een antistollingsmiddel.
   10. Perfuse van het dier met een constante snelheid van 2 mL/minuut met behulp van een één-spuitpomp. Opmerking de zichtbare Blancheren van de organen. Blijven de perfusie totdat het perfusaat aftappen van de veneuze circulatie van bloed (ongeveer 5-6 mL) vrij. Stoppen met de pomp.
   11. De IV-katheter buis verbreken door de 10 mL spuit, verzorgen niet te verstoren de naald op de positie in het linkerventrikel.
   12. Onmiddellijk na de volledige exsanguination, de oplossing van de agent contrast te scheiden in 5 mL aliquots en de uithardende agent op dit moment toevoegt (zie stap 1.2). Meng ze goed. Opstellen van 5 mL van de contrast agent mix in een 10 mL spuit en het dier met het perfuse.
   13. Voor een volledige vulling van de schepen (slagaders en aders), blijven de infusie voorbij het punt wanneer het kan worden gezien het verlaten van de veneuze oplossing. Zoeken naar tekenen van een succesvolle perfusie met inbegrip van de visualisatie van een agent gieten in de kransslagaders, de slagaders pulmonary, darm en lever therapieën.
   14. De contrast-agent zal genezen na ongeveer 20 min bij kamertemperatuur. Oogst van de afzonderlijke organen, zo nodig na uitharding en corrigeren in 10% neutraal gebufferde formaline. Fix hele karkassen als de monsters worden niet gebruikt voor micro-CT scan de volgende dag. Als de karkassen wordt gebruikt de volgende dag, positioneren op een metalen dienblad en plaats ze in een koelkast bij 4 ° C tot genezen overnachten.

3. micro-CT Scanning en Parameters

Opmerking: De specifieke afbeelding overname parameters worden afhankelijk van de machine in gebruik.

1. Verwerven X-ray berekend tomografie beelden van elke muis de dag volgende op de perfusie met behulp van een micro-CT-scanner met behulp van een röntgenbuis spanning van 55 kVp, een stroom van 150 μA, een vergrotingsfactor systeem van 2.19 en een CCD camera pixel binning factor 2. Dit levert een doeltreffende pixelgrootte van 29 µm.
   1. Leg de muis karkas liggende op de tafel van de micro-CT scanner en krijgen een scout X-ray scan.
   2. Het gezichtsveld van de detector van 57,4 mm (axiaal) x 37.1 mm (transaxial) richten op de romp om het imago van de volledige lengte van de aorta.
   3. Verwerven van 180 prognoses van de afbeelding met een toename van de rotatie van 2 graden en een keer per projectie van 2800 ms.
2. Reconstrueren van de afbeeldingen via een gewijzigde Feldkamp algoritme besproken; de gereconstrueerde voxel-grootte is 29 x 29 x 29 µm³ (slice dikte = 29 µm) met behulp van de multimodale 3D visualisatie plug-in voor de software die hier wordt gebruikt.

4. post verwerking en renderen

1. De CT-gegevens omzetten in een DICOM-indeling met behulp van de juiste software.
2. Het analyseren van de beelden te identificeren of een aneurysma aanwezig was. Meten van de secundaire as diameter op het breedste punt van de aortaboog, aflopende thoracale aorta en abdominale aorta zoals eerder beschreven¹⁸ (Figuur 1).
   Opmerking: In onze studie, beelden werden geanalyseerd door twee onafhankelijke waarnemers (een verblind) met behulp van een DICOM viewer om te bepalen of een aneurysma aanwezig was. De secundaire as diameter werd gemeten op het breedste punt van de aortaboog, aflopend van thoracale aorta en abdominale aorta als eerder beschreven¹⁹ (Figuur 1). Betekent niet-aneurysmal arteriële segmenten van muizen BAPN-onbehandeld vastgestelde normale vaartuig diameters de leeftijd-matched controlewaarden bijeenkomen.
3. Aneurysma worden gedefinieerd als een gelokaliseerde of diffuse verwijding van de aorta segmenten aan de diameter groter is dan 50% van de diameter van de referentie. Zoek deze op basis van de bovenstaande metingen.

Results

Om te evalueren van dit protocol, 20 mannelijke volwassen muizen, van gemengde achtergrond als eerder beschreven¹⁹ en 20-30 weken oud, met of zonder BAPN behandeling, waren geperfundeerd met een loodhoudende radiopaak silicone rubber (Zie de tabel van materialen ) met behulp van het protocol die hierboven is uiteengezet. Ze onderging micro-CT scan op de volgende dag (Figuur 1 en F...

Discussion

Micro-CT beeldvorming kan worden gebruikt om zeer gedetailleerde en drie-dimensionale reconstructies van vasculaire pathologie in diermodellen. Door het gebruik van intravasculaire contrast-enhanced media, kunnen non-enhanced zachte weefsels, zoals het lumen van een bloedvat, worden onderscheiden van die verbetering van zijn. Terwijl laser Doppler, microangiography, magnetische resonantie angiografie, histologie met confocal, of twee-foton microscopie kan worden gebruikt voor het beoordelen van vasculaire bedden, ze mees...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microfil	Flow Tech, Inc	MV-122	We gebruiken geel, een andere kleur kan naar wens worden besteld. Kit bevat MV-Compound, MV-Diluent en MV-Curing Agent.
Heparine (1000 U/mL)	Sagent Pharmaceuticals	25021-400-10
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Corning	21-031-CV
Isofluraan	Vet One, MWI	502017
3-aminopropionitrilfumaraat zout	Sigma-Aldrich	A3134
Enkele spuitpomp	Fisher Scientific	14-831-200
27-gauge hoofdvatnaald	Exel Int	26709	27G x 3/4", 12" buis
Inveon Micro-CT scanner	Siemens Medical Solutions
Osirix MD	Pimxmeo SARL		Versie 8.0.2
Inveon Research Workplace	Siemens Medical Solutions		Versie 4.2
Rodent Chow	Harlan Teklad	2018sx