Methodenartikel

A11-positieve β-amyloid oligomeren voorbereiding en de evaluatie met behulp van Dot bevlekken analyse

11.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57592

⸱

22 mei 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Li Dak Sum Yip Yio Chin Kenneth Li Marine Biopharmaceutical Research Center, Ningbo University, 3School of Materials Science and Chemical Engineering, Ningbo University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol wordt beschreven hoe voor te bereiden Aβ oligomeren van een synthetische peptide in vitro en relatieve hoeveelheid Aβ oligomeren evalueren door een stip bevlekken analyse.

Samenvatting

Β-amyloid (Aβ) is een hydrofobe peptide met een intrinsieke tendens u zelf samenvoegen tot aggregaten. Onder diverse aggregaten, Aβ oligomeren algemeen aanvaard wordt als de toonaangevende neurotoxine in de voortgang van de ziekte van Alzheimer (AD) en wordt beschouwd als de cruciale gebeurtenis in de pathogenese van AD. Daarom Aβ oligomeren remmers misschien voorkomen neurodegeneratie en hebben het potentieel om te worden ontwikkeld als ziekte-aanpassen behandelingen van AD. De vorming van de verschillende protocollen van Aβ oligomeren kunnen echter leiden tot oligomeren met verschillende kenmerken. Bovendien, er zijn niet vele methoden om effectief scherm Aβ1-42 oligomeren remmers. Een antilichaam A11 kan reageren met een subset van giftige Aβ1-42 oligomeren met anti-parallel β-sheet structuren. In dit protocol beschrijven we hoe te bereiden een A11-positieve Aβ1-42 oligomeren-rijke monster uit een synthetische Aβ1-42 peptide in vitro en evalueren van relatieve hoeveelheid A11-positieve Aβ1-42 oligomeren in monsters met een dot bevlekken analyse met behulp van de A11 en Aβ1-42-specifieke 6E10 antilichamen. Met behulp van dit protocol, kunnen remmers van A11-positieve Aβ1-42 oligomeren ook worden afgeschermd van de van semi-kwantitatieve experimentele resultaten.

Inleiding

De ziekte van Alzheimer (AD) is een van de belangrijkste neurodegeneratieve ziekten van van oudere mensen wereldwijd1. Het is algemeen aanvaard dat de abnormale aggregatie van β-amyloid (Aβ) de dominante pathologische factor van advertentie kan worden. Aβ aggregaten zijn de belangrijkste onderdelen van de seniele plaques, één van de biologische markers in de hersenen van patiënten van de advertentie. Bovendien produceren Aβ aggregaten, in het bijzonder, met inbegrip van oligomeren potente neurotoxiciteit, die mogelijk de oorzaak van de neuronale dood als AD vordert. Daarom, neurodegeneratie ertoe leiden dat de remming van de vorming van Aβ oligomeren en Aβ oligomeren remmers kunnen worden ontwikkeld als ziekte-aanpassen behandelingen van AD. Vele studies hebben gewend een synthetische Aβ peptide vormen oligomeren in vitro, morphologies en structuren van kunstmatige Aβ oligomeren verkennen en onderzoeken de inhibitors van Aβ oligomeren met behulp van in vitro modellen2,3 , 4. echter verschillende in vitro vorming protocollen van Aβ oligomeren kunnen leiden tot oligomeren met verschillende morfologische kenmerken, die de onvergelijkbare resultaten onder de verschillende onderzoeksgroepen zou kunnen veroorzaken. Een standaard formatie-protocol voor Aβ oligomeren is daarom dringend noodzakelijk.

Tot nu toe niet veel methoden om direct detecteren Aβ oligomeren gemeld. Transmissie elektronische microscopie (TEM), niet-denaturering gelelektroforese enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en stip bevlekken analyse kunnen worden gebruikt om te onderzoeken de hoeveelheid en/of de morfologie van Aβ oligomeren in vitro5, 6. bijvoorbeeld, de morfologie en de structuur van Aβ oligomeren kunnen worden waargenomen in TEM. De relatieve hoeveelheden en moleculaire grootte van Aβ aggregaties kunnen worden afgemeten aan niet-denaturering gelelektroforese. ELISA kan worden gebruikt om te bepalen van Aβ oligomeren in serum, plasma en extracten van hersenweefsel. Tot slot, dot bevlekken analyse, een techniek die wordt gebruikt voor het opsporen, analyseren en identificeren van eiwitten, kan worden gebruikt om de relatieve concentratie van Aβ oligomeren in verschillende monsters met behulp van oligomeren-specifieke en Aβ-specifieke antilichamen. Bovendien biedt een stip bevlekken assay aanzienlijke tijd te besparen, zoals de gelelektroforese van het en de Bevlekkende procedures voor gels niet nodig zijn. Deze bepaling is derhalve normaal scherm potentiële Aβ oligomeren remmers gebruikt. Het algemene doel van dit protocol is voor het beschrijven van een relatief eenvoudige, betrouwbare en reproduceerbare methode ter voorbereiding van een monster Aβ1-42 oligomeren-rijk, voor het analyseren van de hoeveelheid Aβ1-42 oligomeren met stip bevlekken analyse en scherm Aβ Oligomeer remmers met behulp van semi-kwantitatieve experimentele resultaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. oplossing voorbereiding

Opmerking: Zie Tabel van materialen voor reagens bronnen.

  1. Bereid een 5% bovien serumalbumine (BSA) oplossing door 5 g BSA tot 100 mL van tweemaal gedestilleerd water toe te voegen. Meng ze volledig door vortexing hen. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
  2. Bereid een anti-oligomeren antilichaam A11 oplossing (1:1, 000) door toevoeging van 10 µL van de stockoplossing van antilichaam aan 10 mL van de oplossing van 5% BSA. Meng ze volledig door vortexing hen. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
  3. Bereid een anti-Aβ antilichaam 6E10 oplossing (1:1, 000) door toevoeging van 10 µL van de stockoplossing van antilichaam aan 10 mL 5% BSA oplossing. Meng ze volledig door vortexing. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
  4. Bereid een (1:1, 000) van de antilichaam OC-oplossing in anti-fibrillar oligomeren door 10 µL van de stockoplossing van antilichaam aan 10 mL 5% BSA oplossing toe te voegen. Meng ze volledig door vortexing. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
  5. Bereid een Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) stamoplossing door 24 g voor Tris base en 88 g NaCl aan 1000 mL tweemaal gedestilleerd water toe te voegen. Breng de pH op 7.4. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor maximaal 3 maanden.
  6. Bereiden een Tris-gebufferde zoutoplossing en oplossing van Tween-20 (TBST) door toevoeging van 1 mL van Tween-20 tot 100 mL van TBS voorraad en 900 mL tweemaal gedestilleerd water.
  7. Bereid een secundair antilichaam-oplossing door toe te voegen 10 µL van mierikswortel peroxidase (HRP) geit anti-konijn IgG (H + L) tot 10 mL van oplossing van TBST. Meng ze volledig door vortexing hen. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
  8. Los 3.68 g curcumine in 1 mL dimethylsulfoxide (DMSO) vormen een stockoplossing 10-mM curcumine.
  9. Los 5 mg van synthetische Aβ1-42 in 2 mL zuiver 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) vormen een 2,5 mg/mL Aβ monomeer oplossing. Plaats het op kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 20 min. maken 100 µL aliquots en bewaren bij-20 ° C voor maximaal 6 maanden.
    Opmerking: Deze procedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd. De pipet tips zou worden afgesneden om ervoor te zorgen nauwkeurige pipetteren.
  10. Bereid electrochemiluminescence (ECL) vloeistof door het mengen van ECL vloeistof A en B met een volumeverhouding van 1:1. Deze oplossing moet net vóór gebruik worden bereid.

2. de monstervoorbereiding

Opmerking: Voer de monsterverwerking 2 dagen vóór de stip bevlekken analyse.

  1. Voeg 900 µL van tweemaal gedestilleerd water tot een koker van Aβ1-42 monomeer oplossing; de concentratie van Aβ1-42 zullen 0,25 mg/mL. Plaats het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
  2. Damp de oplossing met hoge zuiverheid stikstofgas totdat het volume ongeveer 850 µL is. De concentratie van de oplossing van de1-42 Aβ zal gaan over 0.29 mg/mL.
    Opmerking: De oplossing moet van tijd tot tijd geschud worden om dat de HFIP volledig is verdampt. Normaal gesproken is het volume van de resterende oplossing na 30 min van verdamping, ongeveer 850 µL.
  3. Verdun de curcumine stockoplossing om een werkoplossing curcumine (0.2 en 2 µM) met tweemaal gedestilleerd water. Meng de Aβ1-42oplossing en de curcumine werkoplossing met een volumeverhouding van 1:1. De eindconcentraties van curcumine zullen 0,1 en 1 µM.
    Opmerking: Potentiële oligomeren remmers kunnen gemengd worden met de oplossing1-42 Aβ in verhouding indien nodig.
  4. Schud de oplossing voortdurend in een magnetische roerder (Zie Tabel van materialen).
    1. Fix het plastic scheidingslijn voor de magnetische roerder. Plaats 2 magnetische roer bars op 2 hoeken van het vak en plaatsen van de buizen van het monster in het midden van het vak.
    2. Schud het vak bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 48 uur.
      Opmerking: De snelheid van de magnetische roerder is ongeveer 60 rpm.
  5. Centrifugeer de buizen voor 15 min bij 4 ° C en 18.000 x g. verzamelen het supernatant.

3. dot bevlekken analyse

Opmerking: Alle incubations worden uitgevoerd op een horizontale shaker.

  1. Membraan van het nitrocellulose in 1 cm brede repen gesneden.
    Opmerking: De breedte van het membraan van het nitrocellulose kan worden aangepast volgens de experimentele behoeften.
  2. Leg 2-µL monsters gelijkmatig op 2 strips (strip 1 en 2) met elk punt interval op 0,5 cm.
  3. Plaats de strips bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten totdat de druppel op de band droog is.
  4. Incubeer de strips met een oplossing van 5% BSA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Spoel de strips met een oplossing van TBST gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. De oplossing van TBST gecombineerd. Gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, Incubeer 1 strip met een anti-oligomeren antilichaam A11 oplossing en strippen van 2 met een anti-Aβ antilichaam 6E10 oplossing.
  7. Spoel de strips met een oplossing van TBST driemaal, telkens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  8. De oplossing van TBST gecombineerd. Incubeer de strips met een secundair antilichaam oplossing voor 40 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Spoel de strips met een oplossing van TBST driemaal, telkens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  10. Toepassing de gemengde ECL vloeistof gelijkmatig op het oppervlak van de strips. De strips in een automatische Chemoluminescentie imaging systeem bloot (Zie Tabel van materialen).
    Opmerking: Normaal, 300 µL van ECL vloeistof is genoeg voor één membraan. Het membraan moet vochtig worden bewaard tijdens de blootstelling. De belichtingstijd wordt automatisch berekend door het imaging systeem.
  11. Maak een analyse van de grijswaarden met ImageJ (National Institutes of Health) of een andere beeldverwerking software om semi-kwantitatieve resultaten te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om te onderzoeken of een Aβ1-42 monomeer een Aβ1-42 oligomeren na voorbereiding kan vormen, werd TEM analyse gebruikt. Geen zichtbare aggregaten werden waargenomen in de HFIP-ontbonden Aβ1-42 monomeer steekproef(Figuur 1). Bovendien voornamelijk bolvormige aggregaten met een diameter van rond 10-80 nm werden waargenomen in de steekproef Aβ1-42 na 48u schudden, suggereren dat Aβ1-42 oligom...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol hebben we een methode ter voorbereiding van de monsters met Aβ1-42 oligomeren, en voor het analyseren van de hoeveelheid A11-positieve Aβ1-42 oligomeren door een stip bevlekken analyse gemeld. Hoewel onze methoden voor de bereiding van Aβ1-42 oligomeren-rijke monsters vrij eenvoudig, betrouwbaar en reproduceerbaar zijn, zijn er nog enkele punten om opgemerkt te worden. In de eerste plaats wordt HFIP gebruikt voor het ontbinden van de synthetische Aβ1-42 peptide....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (U1503223, 81673407, 21475131), het onderzoeksproject toegepast op non-profitorganisatie technologie van de provincie Zhejiang (2016C 37110), het Ningbo International Science en technologie Samenwerkingsproject 2014D 10019, de Ningbo gemeentelijke innovatie Team van Life Science en gezondheid (2015C 110026), de Ningbo Sci & Tech Project voor gemeenschappelijke rijkdom 2017C 50042, de Li Dak som Yip Yio kin Kenneth Li Marine biofarmaceutische Ontwikkelingsfonds, en het Fonds K. C. Wong Magna Ningbo Universiteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)AbcamGR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)Cell Signalling Technology2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)MilliporeAB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) BeyotimeA0208
Aβ1-42GL Biochem52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanolAladdinI1523078
CurcuminSigmaC1386
Albumin Bovine VSolarbioA8020
Sodium chlorideSangon BiotechD920BA0003
Sodium dodecyl sulfateSCR30166428
TRISSolarbioT8060
GlycineSolarbioG8200
 Dimethyl sulfoxideSolarbioD8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein MarkerBeyotimeP0016
Genshare CFAS anyKD PAGEGenshareJC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting MembranePall CorporationT50189
MethanolSCR10014118
EthanolSCR10009218
Super low range protein MarkerSolarbioPR1300
Transfer MembranesImmobilon-PSQISEQ00010
BeyoECL StarBeyotimeP0018A
Commassie Blue Fast staining solutionBeyotimeP0017
All - automatic chemiluminescence imaging systemTanonTanon 5200
Image JNational Institutes of Health
Image processing softwareAdobePhotoshop CS6
Magnetic agitatorShanghai Huxi

Referenties

  1. Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
  2. De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).
  3. Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
  4. Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
  5. Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256(2015).
  6. Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
  7. Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
  8. Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
  9. Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
  10. Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).
  11. Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Amylo de b ta oligomeerA11 antilichaamb ta amylo de preparatiecurcumine inhibitieTEM beeldvormingchemiluminescentiedetectiesecundair antilichaamTBST wassingnitrocellulosemembraan

Gerelateerde artikelen