Methodenartikel

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

DOI:

10.3791/57599

⸱

2 juni 2018

 ,  ,  , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Center for Cell and Gene Therapy, Texas Children's Hospital, and Houston Methodist Hospital, Baylor College of Medicine, 3Molecular and Cellular Biology Department, Baylor College of Medicine, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Center, Baylor College of Medicine, 5McNair Medical Institute, Baylor College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van insuline 3D lymfkliertest pancreatoids uit de alvleesklier progenitoren vrij zwevende e10.5 losgekoppeld en de bijbehorende mesenchym uitdrukken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De alvleesklier is dat een complex orgaan samengesteld uit vele verschillende soorten cellen die samenwerken om bloed glucose homeostase en spijsvertering te regelen. Deze celtypen behoren enzym-afscheidende acinaire cellen, een arborized ductaal systeem verantwoordelijk voor het vervoer van enzymen aan de gut en hormoon-producerende endocriene cellen.

Endocriene beta-cellen zijn de enige celtype in het lichaam die insuline tot lagere niveaus van de glucose van het bloed. Diabetes, een ziekte die wordt gekenmerkt door het verlies of de disfunctie van de beta-cellen, is het bereiken van epidemische proporties. Het is dus essentieel om protocollen voor het onderzoek naar bèta-cel ontwikkeling die kan worden gebruikt voor screeningonderzoek voor het afleiden van de drug en cel-gebaseerde therapeutics. Terwijl het experimentele onderzoek van muis ontwikkeling essentieel is, zijn in vivo studies moeizaam en tijdrovend. Gekweekte cellen bieden een handiger platform voor screening; Nochtans, zijn zij niet in staat om de cellulaire diversiteit, architecturale organisatie en cellulaire interacties gevonden in vivo. Het is dus essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe instrumenten voor het onderzoek naar alvleesklier organogenese en fysiologie.

Alvleesklier epitheliale cellen ontwikkelen in de nauwe samenwerking met mesenchym vanaf de aanvang van de organogenese als cellen organiseren en in de complexe, fysiologisch bevoegde volwassen orgel differentiëren. De alvleesklier mesenchym biedt belangrijke signalen voor de endocriene ontwikkeling, waarvan vele niet goed nog, dus moeilijk begrepen zijn te recapituleren tijdens de in vitro cultuur. Hier beschrijven we een protocol bij cultuur three-dimensional, cellulaire complexe muis organoids die mesenchym behouden, pancreatoids genoemd. De e10.5 lymfkliertest alvleesklier kiem is ontleed, losgekoppeld en gekweekt in een scaffold-vrije omgeving. Deze zwevende cellen monteren zelf met mesenchym onder omslag steken de ontwikkelende pancreatoid en een robuust aantal endocriene beta-cellen ontwikkelen en de acinaire cellen van de buis. Dit systeem kan worden gebruikt om te studeren van de cel lot vastberadenheid, structurele organisatie, en voedselproductie, cel-cel interactie tijdens organogenese, of voor de drug, klein molecuul of genetische screening.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mechanismen van de normale ontwikkeling en de Fysiologie uitgezet is primordiaal te begrijpen van de etiologie van de ziekte en behandelingsmethoden uiteindelijk te cultiveren. Kweken en differentiatie van stamcellen maakt het snel en high-throughput analyse van de ontwikkeling, het wordt beperkt door de bestaande hoeveelheid kennis met betrekking tot de mechanismen tot regeling van de cel lot en kunstmatig recapituleert ontwikkeling in een relatief homogene, tweedimensionale staat1,2. Niet alleen biedt in vivo ontwikkeling beïnvloed door Extrinsieke invloeden, met verschillende soorten cellen in de niche en milieu paracrine signalen en organisatorische steun te loodsen organogenese, maar de functie van deze cellen beroept zich ook op hun omgeving voor begeleiding3,4,5. Gezien het belang van deze externe signalen, de beperkingen van differentiatie protocollen en het moeizame karakter van in vivo muismodellen, zijn nieuwe systemen nodig om de fundamentele ontwikkelings processen en fysiologie experimenteel te onderzoeken.

De opkomst van protocollen voor het genereren van driedimensionale, complexe organoids biedt een handige en congruent systeem om te studeren organogenese, fysiologie, drug werkzaamheid en zelfs pathogenese. Tot vaststelling van lymfkliertest organoids voor verschillende systemen zoals de maag6 en darm7 hebben ons begrip van de organogenese uitgebreid, die een tool om te bestuderen van ontwikkelingsstoornissen complexiteit met minder beperkingen dan in vivo bieden: en in vitro modellen. Vanwege deze vooruitgang in de lymfkliertest organoid formatie en de komst van menselijke pluripotente cellen, menselijke intestinale8, retinale9, renale10,11, en cerebrale12 organoids zijn vervaardigd, en dit repertoire wordt alleen beperkt door de bestaande kennis over de mechanismen van ontwikkeling.

Van bijzonder belang is de generatie van de alvleesklier organoids, zoals een groot aantal ziekten verschillende alvleesklier celtypes teistert, met inbegrip van acinaire cellen en leidingen in exocrine alvleesklier insufficiëntie13, acinaire cellen van pancreatitis14, en beta cellen in diabetes15. Verwerven van kennis met betrekking tot de ontwikkeling van deze verschillende soorten cellen zou helpen bij het begrijpen van hun pathologie en kan ook fungeren als een platform voor gepersonaliseerde drug screening of transplantatie. Eerder, Greggio et al. een methode ontwikkeld om lymfkliertest alvleesklier organoids die in vivo morfogenese recapituleren en ontwikkelen van georganiseerde, driedimensionale, complexe structuren, samengesteld uit alle belangrijke alvleesklier epitheliale cel maken 16,17soorten. Dit is een belangrijke stap voorwaarts in de alvleesklier veld, met name als maken cellen in vitro biologische onderzoek van bèta-cel ontwikkeling kunt inschakelen. Echter een schaarste van de endocriene cellen gevormd in dit protocol, tenzij de organoids waren in weefsel, waar de niche zou kunnen communiceren en bieden instructievideo signalen17getransplanteerd. Het mesenchym vormt het grootste gedeelte van de niche, zwaar onder omslag steken de ontwikkelende epitheel van de vroege stadia van de organogenese aan latere stadia, met inbegrip van endocriene delaminatie en differentiatie3,4, 18. De interactie van het mesenchym met de ontwikkelingslanden alvleesklier is nog een ander voorbeeld van Extrinsieke signalering en het belang van het behoud van in vivo cellulaire complexiteit te bestuderen van de organogenese.

Hier beschrijven we hoe te genereren van driedimensionale alvleesklier organoids, pancreatoids, van gedissocieerde e10.5 lymfkliertest alvleesklier progenitoren genoemd. Deze pancreatoids behouden van inheemse mesenchym, zelf monteren in zwevende voorwaarden en alle grote alvleesklier celtypes, met inbegrip van een robuust aantal endocriene beta cellen19genereren. Deze aanpak is geschikt voor de analyse van de ontwikkeling van het endocriene, zoals eerdere protocollen robuuste endocriene differentiatie ontbreken. Echter, met behulp van het protocol voor alvleesklier organoids zoals beschreven door Greggio et al. beter voor de analyse van de alvleesklier epitheliale vertakking en voedselproductie geschikt is, als vertakking beperkter is in pancreatoids.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven in deze methode beschreven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Baylor College of Medicine.

1. bereiding van muis embryonale dag 10.5 alvleesklier voorlopercellen

Opmerking: Dit protocol hoeft niet te worden gevolgd onder steriele omstandigheden tot stap 2, maar het is optimaal steriliseren dissectie tools te spuiten met 70% ethanol vóór gebruik.

  1. Als u wilt instellen voor dissectie, vul een ijsemmer en plaats een container fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in het ijs. Reinig twee boete-tipped pincet en dissectie schaar met 70% ethanol. Ingesteld in de buurt van de dissectie-gebied, een container met ten minste drie borosilicaat capillaire buizen, mond Pipetteer een lichtere, en 1.000 µL Pipetteer tips gefilterd.
    1. Bereiden van ten minste 1 mL koude dispase 1,25 mg/mL verdund in gesteriliseerd water en plaats in de tweede put uit een 12 goed bord op het ijs. PBS zetten in de eerste, derde en vierde putjes van de 12 goed plaat. Plaats 1 mL van 0,05% trypsine in een 1,5 mL tube op ijs. Vooraf warm een schudden incubator naar 37 oC.
  2. Euthanaseren e10.5 getimede-zwangere muizen overeenkomstig de richtsnoeren van de IACUC. Spray de buik met 70% ethanol te reinigen van de regio alvorens een V-vormige insnijding in de schaamstreek van de muis met schaar en pincet en het blijven tot het middenrif.
    Opmerking: Verschijning van een vaginale plug in dit protocol geeft dag 0,5. 5 - 6-week-oude muizen, met fungeert een gewichtstoename van meer dan 2 g als een secundaire maatregel van succesvolle bevruchting.
    1. Accijnzen zorgvuldig de baarmoeder doordat een insnijding om de bovenste laterale gedeelten van de baarmoeder, het orgel omhoog uit de buurt van de muis, en na deze incisie tot de genitale regio trekken voordat herhalen aan de andere kant. Plaats het in een 10 cm petrischaal met de koude PBS.
      Opmerking: Het is mogelijk te krijgen van organoids van e11.5 los gezien de cellen, maar in tegenstelling tot de e10.5 pancreatoids, deze organoids nog niet zijn gekenmerkt en dus niet de capaciteit om te differentiëren in alle drie belangrijke alvleesklier lineages kan behouden.
  3. Onder een licht dissectie Microscoop, plaats de petrischaal en zorgvuldig de baarmoeder weefsel te openen door het plaatsen van twee pincet tussen elk embryo en peeling weefsel uit de buurt van de dooierzak. Transfer van embryo's door grijpen de dooierzak voorzichtig met een pincet en breng dit in een 10 cm petrischaal met verse, koude PBS. Plaats de petrischaal op ijs.
    Opmerking: Het is belangrijk om te heedfully het verwijderen van embryo's, bij voorkeur binnen de dooierzak, gehouden als krachtig verwijdering kan trek de navelstreng, rippen van weefsel van het embryo en de structurele integriteit.
  4. Plaats meerdere PBS druppels op een 10 cm petrischaal deksel. Gebruiken deze druppels voor het overbrengen van het embryo tijdens dissectie extraembryonic weefsels worden geschrapt om te zorgen voor zichtbaarheid. Een embryo overbrengen in een daling van de PBS en zachtjes verwijderen uit de dooierzak met pincet, terwijl de resterende embryo's in PBS op ijs(Figuur 1 blijven). Verwijder het hoofd voordat het embryo verhuizen naar een nieuwe PBS drop pincet met licht schep het embryo, niet het weefsel (Figuur 1B) schade.
    Opmerking: Het weefsel moet mogelijk vaker worden overgedragen aan de verse PBS druppels dan hier beschreven, afhankelijk van de dekking van de vloeistof.
    1. In een nieuwe PBS drop, verwijderen de toppen van de voorpoot met pincet (Figuur 1B). Plaats pincet in de opening waar ledemaat bud was aanwezig en zachtjes scheuren alleen de meeste externe weefsel anteriorly (Figuur 1B). Draaien van embryo en herhaal Richtung posterior, stoppen bij de stuk knop. Op dit punt, moet het maag-darmkanaal zichtbaar (Figuur 1B).
    2. De achterste regio van het maag-darmstelsel heeft een lichte bocht (figuur 1F). Invoegen pincet achter deze bocht in de opening tussen het maag-darmkanaal en de spinale regio van de muur van het lichaam. Loskoppelen van het maag-darmkanaal, werken langzaam naar boven tot de meest anterior regio wordt bereikt waar de cardiale regio verbindt (Figuur 1-B-E).
      Optioneel: Verwijder het primordiale hart en de lever knoppen uit de ventrale regionen van het maagdarmkanaal, waardoor alleen de continue gut buis. De eerste paar keer dit protocol wordt uitgevoerd het kan dan makkelijker te vertrekken van het hart en de lever als ventrale monumenten tot de morfologie van het maag-darmkanaal en de dorsale alvleesklier bud meer zijn familiar (Figuur 1C en D ).
    3. Het maag-darmkanaal overbrengen in de verse PBS druppel.
    4. Pincet te nemen en zachtjes knijpen het weefsel onder de uitstekende kiem en de darm en iets til het buitenste weefsel uit (Figuur 1D-F).
      Opmerking: De dorsale alvleesklier kiem ligt tussen de maag en darm (Figuur 1C-G). De alvleesklier kiem onder moet uitzien als een ronde, knobby structuur (Figuur 1G).
    5. Pincet plaats op de plaats waar de kiem verbindt met de darm en een snuifje omhoog de kiem (Figuur 1G) los te maken. Één keer in een nieuwe PBS-zeepbel wassen vóór de overbrenging van de kiem in het eerste putje van de plaat 12 goed in koude PBS op ijs. Herhaal totdat alle knoppen worden verzameld uit embryo's en in het eerste putje van de 12 goed plaat geplaatst.
  5. Plaats de 12 schotel goed onder de loep lichte dissectie. Het aantal alvleesklier toppen met succes ontleed om te berekenen later de splitsingsverhouding.
    1. Plaats een gefilterde 1.000 µL pipette uiteinde in de mond pipet met een capillair verbonden. Vlam steriliseren van het capillair en maken een bocht in de buis voor het gebruiksgemak. Gebruik het capillair toppen overbrengen naar de tweede goed met koude dispase oplossing voor 2 min voordat de overdracht aan de derde putje met de schone PBS (Figuur 1G).
      Opmerking: Tijdens het overzetten toppen van dispase naar PBS, raak het weefsel naar het uiteinde van het capillair. Als het weefsel vast te aan het uiteinde van de buis zitten komt, omhoog en omlaag Pipetteer of schudden in de schone PBS oplossing totdat losgemaakt.
    2. Pipetteer toppen op en neer, en breng aan de vierde putje met schone PBS. Ten slotte, met behulp van de capillaire apparaat overdracht toppen aan de 1,5 mL-buis met 0,05% trypsine. Plaats de buis in de voorverwarmde 37 oC shaker en schud bij 1500 t/min voor 4 min.
    3. Vortex voor ongeveer 10 s plaats dan onmiddellijk de buis in een centrifuge en spin gedurende 5 minuten bij 200 g. verwijderen alle maar ongeveer 50 µL van oplossing voorzichtig over het gecentrifugeerde cellen (Figuur 1G) niet te verstoren.

2. het kweken van gedissocieerde progenitoren om te vormen van de Pancreatoids

Opmerking: Het volgende moet worden uitgevoerd in een steriele atmosfeer in een standaard weefselkweek kap, met behulp van steriele standaardprocedures.

  1. Voor elke bud verzameld, toevoegen 400 µL organogenese media16,17 (tabel 1) aan de gecentrifugeerde cellen. Pulse vortex driemaal en plaat 100 µL per putje van een lage bijlage 96 goed plaat, splitsen toppen met een verhouding van 1:4 (Figuur 1G).
  2. Kijk onder de Microscoop te visualiseren losgekoppeld cellen vrij zwevend (Figuur 1H). Zet de schotel van cultuur in een incubator 37 oC met 5% CO2 op een rocker op middellange snelheid.
  3. De voortgang van pancreatoids dagelijks. Vervangen door 100 µL van verse media om de 3 dagen, zorgvuldig pipetting media onder microscopische controle in de kap te verwijderen terwijl het verlaten van pancreatoid in de put. Anderzijds kunnen vers 100 µL van media worden toegevoegd aan een nieuwe goed en pancreatoid overgedragen met behulp van de borosilicaat-capillair verbonden aan mond pipet en 1000 µL gefilterd pipette uiteinde.

3. verwerking van de Pancreatoids voor immunefluorescentie Imaging

  1. Voor het verwerken van pancreatoids voor immunefluorescentie beelden, eerst voorbereiden 4% paraformaldehyde/PBS, pH7.4 (PFA) oplossing. Plaats 50 µL van 4% PFA in wells van een 96 goed plaat.
    1. Pancreatoids borosilicaat capillaire buisjes en mond pipet gebruikt met het topje van de gefilterde Pipetteer 1.000 µL, overdracht van kweekmedium zo weinig media zoveel mogelijk rekening met de verse put met 4% PFA. De rocker aangezet bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    2. Pancreatoids overbrengen van 4% PFA in een putje met 100 µL van verse PBS, rock bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten herhalen voor een totaal van drie verse PBS wast.
      Opmerking: Het protocol kan worden gepauzeerd hier, met pancreatoids die zijn opgeslagen in 100 µL van PBS bij 4 oC gedurende maximaal één week.
  2. Voor wholemount imaging (aanbevolen als antilichamen geschikt, alternatieve aanpak in sectie 3.3 zijn. en microscopie in 3.4.), van PBS overboeken naar 50 µL 5% ezel serum in 1 x PBS met 0,1% nonionic wasmiddel (PBST) te blokkeren. Rock's nachts op 4 oC of als alternatief voor 4 uur bij kamertemperatuur.
    1. Pancreatoids overbrengen naar een nieuwe put met primaire antilichamen verdund in 50 µL van 5% ezel serum in 1 x PBST. Optimaal, rock gedurende 24 uur bij 4 oC (ten minste 12 h maar maximaal 36 uur).
      Opmerking: Antilichamen opgesomd in de Tabel van materialen tegen Chga (1:100), DBA (1:400), Vim (1:400) en Pdx1 (1:100) zijn geschikt voor wholemount vlekken; andere antilichamen voorschrijven optimalisatie.
    2. Pancreatoids overbrengen in een put met 100 µL van verse PBST te wassen en rock gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap voor een totaal van drie verse PBST wast.
    3. Pancreatoids overbrengen naar een nieuwe put met secundaire antilichamen verdund in 50 µL van 5% ezel serum in 1 x PBST. De plaat beschermen tegen licht en plaats in de 4 oC, schommelen voor optimaal 24 h (ten minste 12 h maar maximaal 36 uur).
      Opmerking: Alle secundaire antilichamen vermeld in de Tabel van materialen en DAPI nucleaire counterstain zijn geschikt voor wholemount vlekken.
    4. Pancreatoids overbrengen naar een nieuwe put met 100 µL van 1 x PBST en rock bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten herhalen voor een totaal van drie wast in 1 x PBST. In de derde en laatste wash, voeg 300 nM DAPI.
    5. Tot slot plaatst in 100 µL van schone PBS en winkel bij 4 oC beschermd tegen licht voor tot een week voordat het imaging door confocale microscopie, hoewel de beste resultaten komen uit imaging onmiddellijk na kleuring. Om te voorkomen dat verkeer van pancreatoids tijdens imaging maar voorkomen uitdroogt, plaatst u elke pancreatoid in een druppel 20 µL van PBS. Als pancreatoids niet nog blijven, PBS volume te verlagen.
  3. Voor bevroren secties, pancreatoids van PBS overboeken naar 30% sacharoseoplossing 's nachts op 4 oC.
    1. Insluiten media toevoegen in een luchtbel onder een Microscoop dissectie. Geniet met pincet onder microscopische controle, pancreatoids door zachtjes duwen door de insluiten media meermaals residuele sacharose verwijderen vóór de overbrenging naar een weefsel blok met bevroren insluiten media.
    2. Plaats het weefsel blok op droog ijs totdat bevroren en de sectie op de cryostaat op 8 µm.
      Opmerking: Secties kunnen worden achtergelaten bij-80 oC of immunostained onmiddellijk.
    3. Het toestaan van secties van-80 oC te ontdooien bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 5 minuten tot droog. Tekenen van een hydrofobe barrière met behulp van de pen van de hydrofobe pap rond het weefsel en het blok met behulp van 5% ezel serum verdund in 1 x PBST gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder media en vervang onmiddellijk door primaire antilichamen verdund in 5% ezel serum verdund in 1 x PBST overnachting in 4 oC.
    5. Verwijder de primaire oplossing en wassen van weefsels driemaal met 1 x PBST voor 10 minuten elk. Na dit, voeg secundair antilichaam oplossing verdund in 5% ezel serum verdund in 1 x PBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en dia's te beschermen tegen licht.
    6. Verwijderen van de secundaire oplossing en wassen van dia's drie keer in 1 x PBST voor 10 minuten elk. In de laatste wasbeurt, voeg 300 nM DAPI.
    7. Verwijder media en voeg montage media en een dekglaasje aan. Winkel glijdt weg van licht in 4 oC tot klaar om het imago.

4. isolatie van RNA van Pancreatoids voor transcriptie analyse

  1. Verzamelen pancreatoids met behulp van borosilicaat capillair verbonden aan een mond Pipetteer met een gefilterde 1.000 µL pipette uiteinde voor steriliteit en plaats in 500 µL van zure guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroformoplossing in een 1,5 mL-buis. Bewaren bij-80 oC of ga onmiddellijk naar RNA isolatie.
  2. Voor RNA isolatie, monsters op ijs ontdooien als nodig en voeg 100 µL van chloroform. Vortex goed en plaats in de 4 oC gedurende 15 minuten cool vooraf een centrifuge naar 4 oC.
    1. Plaats van buizen in centrifuge en spin voor 20 min bij 12.000 g bij 4 oC.
    2. Verwijder voorzichtig buizen om de scheiding van de lagen niet te storen. Met behulp van een 200 µL Pipet, verzamelen de heldere waterige oplossing en leg in een nieuwe 1,5 mL-buis, waardoor er achter een klein bedrag aan buffer van de witte eiwit laag en roze DNA. Raak niet aan het uiteinde van de pipet om het even wat in dit proces en raak niet de muren van de 1,5 mL-buis.
    3. Voeg 500 µL van 100% isopropanol en aan de nieuwe buis met de waterige laag en vortex. Laat zitten bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, langer op het ijs, of voor maximale neerslag laat 's nachts op-20 oC.
    4. Centrifugeer bij 12.000 g gedurende 15 minuten op 4 oC aan het RNA pellet. Verwijder de isopropanol zonder de pellet te verstoren.
      Opmerking: Omdat pancreatoids klein zijn, is het waarschijnlijk dat de pellet zal niet zichtbaar zijn.
    5. Voeg koud, 75% ethanol en omkeren van de buis meerdere malen. Plaats in de centrifuge en draaien op 9.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 oC. verwijderen de ethanol en spin voor 2 min op 9.000 x g.
    6. Gebruik een pipet 200 µL te verwijderen van alle resterende ethanol in de buis, zonder contact met de regio die de pellet woont in. Laat het GLB open op de buis gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur om verdamping van residuele ethanol.
    7. Resuspendeer de pellet in door vortexing in 20 µL van schone, nuclease-gratis water.
      Optioneel: Warmte het RNA bij 65 oC gedurende 3 minuten en onmiddellijk terugkeren naar het ijs. RNA kan worden opgeslagen bij-80 oC of onmiddellijk gebruikt voor reverse transcriptie en qPCR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zorgvuldige dissectie van muis embryo's bij e10.5 van de baarmoeder hoorn moet onbeschadigd embryo's in PBS voor verdere dissectie (Figuur 1A) opleveren. Het maag-darmkanaal kan efficiënt worden verwijderd van het embryo (Figuur 1,B), het toelaat van onderscheidingsvermogen van de dorsale alvleesklier toppen op de kruising van de darm en maag (Figuur 1C-F

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De progressie van cel cultuur modellen is cruciaal voor goed model ontwikkelen, produceren klinisch relevante celtypes, test drug werkzaamheid of zelfs transplantatie aan patiënten. Echter kunstmatig Recapitulerend ontwikkeling in een schotel is een uitdaging zoals we zijn nog lang niet het begrip van de mechanismen van de organogenese en fysiologie in vivo. In vitro cellen zijn dus inefficiënt gegenereerde, niet volledig functioneel, kunnen worden gehandhaafd voor langere tijd, of haven van andere afwi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Jolanta Chmielowiec voor nuttige discussie over het protocol en het manuscript. Wij danken ook Benjamin Arenkiel voor toegang tot de confocal microscoop. Dit werk werd gesteund door de NIH (P30-DK079638 naar M.B.) en T32HL092332-13 M.A.S. en M.B., de McNair medische Stichting (M.B.) en de confocal kern op de BCM intellectuele en ontwikkelingsstoornissen Research Center (NIH U54 HD083092 van de Eunice Kennedy Shriver nationale Instituut van kind gezondheid en menselijke ontwikkeling).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary PipettesSigma-AldrichA5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free waterThermoFisherD119
Borosilicate Capillary TubesSutter InstrumentsGB1007515O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm lengte
CaCl2Sigma-AldrichC5080
Cell-Repellent 96-Well MicroplateGreiner Bio-One650970U-bodem
Centrifuge 5424 REppendorf5401000013
ChloroformSigma-Aldrich233306
Chromogranin-A antibodyAbcamab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60Leica
Countess Automated Cell CounterInvitrogenC10310
Countess Cell Counter SlidesInvitrogenC10312
CryoStar NX70ThermoFisher957000L
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-fenylindole-dihydrochloride)Roche10 236 276 001Poeder
DBA antibodyVector LabRL-1032
Dispase II, PoederGibco17105041
DMEM/F-12, HEPESGibco11330032
Dnase IInvitrogen18068-015
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-100,05 x 0,02 mm; Titanium; Biologie tip
EGF (Epidermal growth factor)Sigma-AldrichE9644
Ethanol, 200 ProofDecon Laboratories2716
Forma Steri Cycle CO2 IncubatorsThermoFisher370
Fluoromount-GSouthern BiotechOB10001
Heparine natriumzout van varkensdarmSigma-AldrichH3149-10KU
INSM1 AntibodySanta Cruz BioTechnologysc-271408Polycloonaal Muis IgG
IsopropanolFishera4164
Isothesia Isofluraan, USPHenry Schein11695-6776-2
Insulin AntibodyDakoA056401Polycloonaal Guineea Pig
KAPA SYBR FAST UniversalKAPA BiosystemsKK4618
KClKaryoMax10575090
KnockOut Serum ReplacementInvitrogen10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral ConfocalLeica
MgCl2Sigma-Aldrich442615
Mouse C-Peptide ELISAALPCO80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISAALPCO80-INSMSU-E01
MX35 Microtome BladesThermoFisher3052835
NaClSigma-AldrichS7653
NaHCO3Sigma-AldrichS3817
NaH2PO4Sigma-Aldrich
Normaal EzelserumJackson Immuno Research017-000-121
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PBS 1XCorning21-040-CV
Pdx1 antibodyDSHBF6A11Monocloonaal Muis MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding MoldsVWR15160-157
Penicillin-Streptomycin SolutionCorningMT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)Sigma-AldrichP1585
Protein LoBind Microcentrifuge TubesEppendorf224310811.5mL Capaciteit
Recombinant Human FGF-10 ProteinR&D Systems345-FG
Recombinant Human FGF-AcidicPeprotech100-17A
Recombinant Human R-Spondin I ProteinR&D Systems4546-RS
BenchRocker 2DBenchmarkBR2000
Sucrose 500gSigma-AldrichS0389
SuperFrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Super Pap PenElectron Microscopy Sciences71310
Thermomixer REppendorf05-412-401
Tissue Tek O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
TRIzol ReagentInvitrogen15596018
TrypLE ExpressInvitrogen12604039(1x), geen Fenol Rood
Trypan Blue StainInvitrogen15250061Voor celtellingsplaten
Trypsin-EDTA (0,05%)Corning25-052-CI
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200072Fenol Rood
Ultra-Low Attachment 24-Well PlateCorning3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-WellCorning4520
Vimentin AntibodyEMD MilliporeAB5733Polycloonaal Kippenei IgY
Vortex GenieBioExpresS-7350-1
Y-27632 DihydrochlorideR&D Systems1254Ook bekend als ROCK-remmer
Zeiss 710 Confocal MicroscopeZeiss

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
  3. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
  4. Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143(2011).
  5. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
  6. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  9. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  10. Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
  11. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  12. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  13. Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38(2005).
  14. Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060(2017).
  15. Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
  16. Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725(2014).
  17. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
  18. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
  19. Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810(2017).
  20. Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
  21. Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
  22. Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
  23. Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
  24. Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
  25. Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
  26. Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
  27. Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
  28. Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).
  29. Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
  30. Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649(2015).
  31. Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79(2015).
  32. Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Steigerloze kweekpancreato devormingdissectie van muisembryo sdispasebehandelingtrypsineverteringplating op low attachment platenimmunokleuringanalysekwantitatieve PCRb taceldifferentiatie

Gerelateerde artikelen