Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van insuline 3D lymfkliertest pancreatoids uit de alvleesklier progenitoren vrij zwevende e10.5 losgekoppeld en de bijbehorende mesenchym uitdrukken.

Abstract

De alvleesklier is dat een complex orgaan samengesteld uit vele verschillende soorten cellen die samenwerken om bloed glucose homeostase en spijsvertering te regelen. Deze celtypen behoren enzym-afscheidende acinaire cellen, een arborized ductaal systeem verantwoordelijk voor het vervoer van enzymen aan de gut en hormoon-producerende endocriene cellen.

Endocriene beta-cellen zijn de enige celtype in het lichaam die insuline tot lagere niveaus van de glucose van het bloed. Diabetes, een ziekte die wordt gekenmerkt door het verlies of de disfunctie van de beta-cellen, is het bereiken van epidemische proporties. Het is dus essentieel om protocollen voor het onderzoek naar bèta-cel ontwikkeling die kan worden gebruikt voor screeningonderzoek voor het afleiden van de drug en cel-gebaseerde therapeutics. Terwijl het experimentele onderzoek van muis ontwikkeling essentieel is, zijn in vivo studies moeizaam en tijdrovend. Gekweekte cellen bieden een handiger platform voor screening; Nochtans, zijn zij niet in staat om de cellulaire diversiteit, architecturale organisatie en cellulaire interacties gevonden in vivo. Het is dus essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe instrumenten voor het onderzoek naar alvleesklier organogenese en fysiologie.

Alvleesklier epitheliale cellen ontwikkelen in de nauwe samenwerking met mesenchym vanaf de aanvang van de organogenese als cellen organiseren en in de complexe, fysiologisch bevoegde volwassen orgel differentiëren. De alvleesklier mesenchym biedt belangrijke signalen voor de endocriene ontwikkeling, waarvan vele niet goed nog, dus moeilijk begrepen zijn te recapituleren tijdens de in vitro cultuur. Hier beschrijven we een protocol bij cultuur three-dimensional, cellulaire complexe muis organoids die mesenchym behouden, pancreatoids genoemd. De e10.5 lymfkliertest alvleesklier kiem is ontleed, losgekoppeld en gekweekt in een scaffold-vrije omgeving. Deze zwevende cellen monteren zelf met mesenchym onder omslag steken de ontwikkelende pancreatoid en een robuust aantal endocriene beta-cellen ontwikkelen en de acinaire cellen van de buis. Dit systeem kan worden gebruikt om te studeren van de cel lot vastberadenheid, structurele organisatie, en voedselproductie, cel-cel interactie tijdens organogenese, of voor de drug, klein molecuul of genetische screening.

Introduction

De mechanismen van de normale ontwikkeling en de Fysiologie uitgezet is primordiaal te begrijpen van de etiologie van de ziekte en behandelingsmethoden uiteindelijk te cultiveren. Kweken en differentiatie van stamcellen maakt het snel en high-throughput analyse van de ontwikkeling, het wordt beperkt door de bestaande hoeveelheid kennis met betrekking tot de mechanismen tot regeling van de cel lot en kunstmatig recapituleert ontwikkeling in een relatief homogene, tweedimensionale staat^1,2. Niet alleen biedt in vivo ontwikkeling beïnvloed door Extrinsieke invloeden, met verschillende soorten cellen in d....

Protocol

Alle dierproeven in deze methode beschreven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Baylor College of Medicine.

1. bereiding van muis embryonale dag 10.5 alvleesklier voorlopercellen

Opmerking: Dit protocol hoeft niet te worden gevolgd onder steriele omstandigheden tot stap 2, maar het is optimaal steriliseren dissectie tools te spuiten met 70% ethanol vóór gebruik.

1. Als u wilt instellen voor dissectie, vul een ijsemmer en plaats een container fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in het ijs. Reinig twee boete-tipped pincet en dissectie schaar met 70% ethanol. Ingestel....

Results

Zorgvuldige dissectie van muis embryo's bij e10.5 van de baarmoeder hoorn moet onbeschadigd embryo's in PBS voor verdere dissectie (Figuur 1A) opleveren. Het maag-darmkanaal kan efficiënt worden verwijderd van het embryo (Figuur 1,B), het toelaat van onderscheidingsvermogen van de dorsale alvleesklier toppen op de kruising van de darm en maag (Figuur 1C-F

Discussion

De progressie van cel cultuur modellen is cruciaal voor goed model ontwikkelen, produceren klinisch relevante celtypes, test drug werkzaamheid of zelfs transplantatie aan patiënten. Echter kunstmatig Recapitulerend ontwikkeling in een schotel is een uitdaging zoals we zijn nog lang niet het begrip van de mechanismen van de organogenese en fysiologie in vivo. In vitro cellen zijn dus inefficiënt gegenereerde, niet volledig functioneel, kunnen worden gehandhaafd voor langere tijd, of haven van andere afwi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes	Sigma-Aldrich	A5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free water	ThermoFisher	D119
Borosilicate Capillary Tubes	Sutter Instruments	GB1007515	O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5080
Cell-Repellent 96-Well Microplate	Greiner Bio-One	650970	U-bottom
Centrifuge 5424 R	Eppendorf	5401000013
Chloroform	Sigma-Aldrich	233306
Chromogranin-A antibody	Abcam	ab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60	Leica
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10310
Countess Cell Counter Slides	Invitrogen	C10312
CryoStar NX70	ThermoFisher	957000L
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride)	Roche	10 236 276 001	Powder
DBA antibody	Vector Lab	RL-1032
Dispase II, Powder	Gibco	17105041
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
Dnase I	Invitrogen	18068-015
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip
EGF (Epidermal growth factor)	Sigma-Aldrich	E9644
Ethanol, 200 Proof	Decon Laboratories	2716
Forma Steri Cycle CO2 Incubators	ThermoFisher	370
Fluoromount-G	Southern Biotech	OB10001
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
INSM1 Antibody	Santa Cruz BioTechnology	sc-271408	Polyclonal Mouse IgG
Isopropanol	Fisher	a4164
Isothesia Isoflurane, USP	Henry Schein	11695-6776-2
Insulin Antibody	Dako	A056401	Polyclonal Guinea Pig
KAPA SYBR FAST Universal	KAPA Biosystems	KK4618
KCl	KaryoMax	10575090
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal	Leica
MgCl2	Sigma-Aldrich	442615
Mouse C-Peptide ELISA	ALPCO	80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA	ALPCO	80-INSMSU-E01
MX35 Microtome Blades	ThermoFisher	3052835
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S3817
NaH2PO4	Sigma-Aldrich
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS 1X	Corning	21-040-CV
Pdx1 antibody	DSHB	F6A11	Monoclonal Mouse MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	VWR	15160-157
Penicillin-Streptomycin Solution	Corning	MT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)	Sigma-Aldrich	P1585
Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	22431081	1.5mL Capacity
Recombinant Human FGF-10 Protein	R&D Systems	345-FG
Recombinant Human FGF-Acidic	Peprotech	100-17A
Recombinant Human R-Spondin I Protein	R&D Systems	4546-RS
BenchRocker 2D	Benchmark	BR2000
Sucrose 500g	Sigma-Aldrich	S0389
SuperFrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Super Pap Pen	Electron Microscopy Sciences	71310
Thermomixer R	Eppendorf	05-412-401
Tissue Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596018
TrypLE Express	Invitrogen	12604039	(1x), no Phenol Red
Trypan Blue Stain	Invitrogen	15250061	For cell counting slides
Trypsin-EDTA (0.05%)	Corning	25-052-CI
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200072	Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-Well Plate	Corning	3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well	Corning	4520
Vimentin Antibody	EMD Millipore	AB5733	Polyclonal Chicken IgY
Vortex Genie	BioExpres	S-7350-1
Y-27632 Dihydrochloride	R&D Systems	1254	Also known as ROCK inhibitor
Zeiss 710 Confocal Microscope	Zeiss