Methodenartikel

Polysoom profilering in Leishmania, menselijke cellen en muis Testis

DOI:

10.3791/57600

⸱

8 april 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Department of Biological Sciences, Texas Tech University, 3CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het algemene doel van Polysoom profiling techniek is analyse van translationeel activiteiten van individuele mRNAs of transcriptome mRNAs tijdens de eiwitsynthese. De methode is belangrijk voor de studie van eiwit synthese verordening, vertaling activering en onderdrukking in gezondheid en meerdere ziekten bij de mens.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Goede eiwit expressie op het juiste moment en in de juiste hoeveelheden is de basis van normale cel functie en overleven in een snel veranderende omgeving. Voor een lange tijd, werden de gen expressie studies gedomineerd door onderzoek op het transcriptional niveau. Echter de steady-state niveaus van mRNAs doen niet correleren goed met de productie van eiwitten en de vertaalbaarheid van mRNAs varieert afhankelijk van de omstandigheden. In sommige organismen, zoals de parasiet, Leishmania, is het eiwit expressie meestal op de translationeel niveau geregeld. Recente studies aangetoond dat eiwitten vertaling disregulatie wordt geassocieerd met kanker, metabole, neurodegeneratieve en andere ziekten bij de mens. Polysoom profilering is een krachtige methode om te studeren eiwit vertaling verordening. U kunt de translationeel status van individuele mRNAs meten of de vertaling op de schaal van een genoom-brede onderzoeken. De basis van deze techniek is de scheiding van polysomes, ribosomen, subeenheden en gratis mRNAs tijdens centrifugeren van een cytoplasmatische lysate via een verloop van sacharose. Hier presenteren we een universele Polysoom profiling protocol dat wordt gebruikt op drie verschillende modellen - parasiet, Leishmania grote, gekweekte menselijke cellen en dierlijke weefsels. Leishmania cellen groeien vrij in suspensie en gekweekte menselijke cellen groeien in aanhangend enkelgelaagde, terwijl muis testis een dierlijk weefsel steekproef. De techniek is dus aangepast aan elk van deze bronnen. Het protocol voor de analyse van polysomal breuken bevat detectie van individuele mRNA niveaus door RT-qPCR, eiwitten door westelijke vlek en analyse van ribosomaal RNAs door elektroforese. De methode kan worden uitgebreid door onderzoek van mRNAs vereniging met het ribosoom op een niveau van transcriptome door diepe RNA-seq en analyse van ribosoom-geassocieerde eiwitten door massaspectrometrie van de fracties. De methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere biologische modellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verordening van genexpressie in cellen wordt gecontroleerd door middel van de mechanismen van transcriptionele, posttranscriptional en posttranslationele. Vooruitgang in de diepe RNA sequencing toestaan de studie van de stationaire toestand mRNA niveaus op de schaal van een genoom-brede op een ongeëvenaard niveau. Echter, recente bevindingen bleek dat steady-state mRNA niveau niet altijd met eiwit productie1,2 correleren. Het lot van een individuele transcript is zeer complex en hangt af van vele factoren zoals interne/externe prikkels, stress, enz. Verordening van de genexpressie tijdens de eiwitsynthese biedt een andere laag van expressie controle nodig zijn voor een snelle reactie in veranderende omstandigheden. Polysoom (of "polyribosome") profilering, de scheiding en de visualisatie van actief vertalen ribosomen, is een krachtige methode om te studeren van de regulering van de eiwitsynthese. Hoewel, de eerste experimentele toepassingen verscheen in de jaren 1960-3, is Polysoom profilering momenteel een van de belangrijkste technieken in eiwit vertaling studies4. Enkele mRNAs kan worden vertaald door meer dan één ribosoom leidt tot de vorming van een Polysoom. Afschriften kunnen worden geblokkeerd op ribosomen met cycloheximide5 en mRNAs met verschillende nummers van polysomes kunnen worden gescheiden in het proces van Polysoom fractionering door sacharose kleurovergang ultracentrifugatie6,7 , 8 , 9. RNA analyse van polysomal breuken laat dan meting van veranderingen in de translationeel Staten van individuele mRNAs op genoom-brede schaal en tijdens verschillende fysiologische omstandigheden4,7, 10. de methode is ook gebruikt voor het onthullen van de rollen van 5' UTR en 3' UTR sequenties in controle van mRNA vertaalbaarheid11, de rol van miRNAs in translationeel repressie12onderzoeken, ontdekken van defecten in ribosoom biogenese13 , en begrijpen van de rol van ribosoom-geassocieerde eiwitten met ziekten bij de mens14,15. Tijdens de afgelopen tien jaar, is een steeds grotere rol voor de regulering van de genexpressie tijdens de vertaling gebleken dat het belang ervan voor ziekten bij de mens illustreert. Het bewijs voor translationeel controle in kanker, metabole en neurodegeneratieve ziekten is overweldigend15,16,17,18. Bijvoorbeeld disregulatie van eIF4E-afhankelijke vertalende controle draagt bij aan autisme gerelateerde tekorten15 en FMRP is betrokken bij vastlopen van ribosomen op mRNAs gekoppeld aan autisme14. Polysomal profilering is dus een zeer belangrijk instrument om te studeren fouten in translationeel verordening in meerdere ziekten bij de mens.

Eiwit analyse van polysomal breuken onder verschillende fysiologische omstandigheden ontleedt de functie van factoren die samenhangen met ribosomen tijdens de vertaling. De Polysoom profiling techniek is gebruikt in vele soorten, met inbegrip van gist, cellen van zoogdieren, planten en protozoa10,19,20,21. Eencellige parasieten zoals Trypanosoma en Leishmania vertonen beperkte Transcriptionele controle op de genexpressie. Hun genoom worden ingedeeld in polycistronic gen clusters die geen promotor-gereglementeerde transcriptie22. In plaats daarvan, developmental genexpressie wordt voornamelijk geregeld op het niveau van eiwit vertaling en mRNA stabiliteit in trypanosomatid soorten23,24. Begrip voor translationeel control in de afwezigheid van transcriptionele verordening is daarom bijzonder belangrijk voor deze organismen. Polysomal profilering is een krachtig hulpmiddel om te studeren van posttranscriptional regulering van genexpressie in Leishmania25,26,27,28.

De recente vooruitgang in de opsporing van individuele mRNAs niveaus door real time kwantitatieve PCR (RT-qPCR) en volledige transcriptome door next-generation sequencing, evenals proteomics technologieën, resolutie en voordelen van polysomal profielen naar een nieuw niveau brengt. Het gebruik van deze methoden kan worden uitgebreid door analyse van individuele polysomal breuken door diepe RNA sequencing gecombineerd met Proteoom analyse om de translationeel status van cellen in een genoom-brede schaal te controleren. Hierdoor is de identificatie van nieuwe moleculaire spelers regulering van de vertaling in de verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Hier presenteren we een universele Polysoom profilering protocol dat wordt gebruikt op drie verschillende modellen: de parasiet, Leishmania grote, gekweekte menselijke cellen en dierlijke weefsels. Over de voorbereiding van cel lysates presenteren we advies van verschillende organismen, optimalisatie van de helling, mits het, keuze van RNase remmers en toepassing van RT-qPCR, westelijke vlek en RNA elektroforese te analyseren Polysoom breuken in deze studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierlijke behandelingen en hanteren van weefsels verkregen in de studie werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Texas Tech University Health Science Center volgens de National Institutes of Gezondheid dierenwelzijn richtsnoeren, protocolnummer 96005. Gelieve te offeren van gewervelde dieren en weefsels volgens de richtlijnen van het institutionele Animal Care en gebruik Comité voor te bereiden. Als bij gebrek aan een dergelijk comité, raadpleegt u aan de richtlijnen van de National Institutes of Health het welzijn van dieren. Volwassenen (> 60 dag oud) C57BL/6 muizen werden gebruikt. Alle dieren en weefsels waren verkregen volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Texas Tech University Health Sciences Center overeenkomstig de richtsnoeren van de National Institutes of Health het welzijn van dieren. Voor euthanasie, een enkele muis werd geplaatst in een kleine kamer, en de lucht was geleidelijk aan ontheemden met ongeveer 30% van kooldioxide tot anesthetize en de nood van het dier te minimaliseren. Na beëindiging van de ademhaling, we gewend cervicale dislocatie bevestigen de dood van het dier voordat het oogsten van de weefsels.

Let op: Al het werk met live Leishmania en gekweekte menselijke cellen was gedaan in bioveiligheid kabinet in BSL-2 gecertificeerd laboratorium.

1. voorbereiding van de cytoplasmatische Lysates van Leishmania grote , gekweekte menselijke cellen en weefsels van de muis

Opmerking: Er zijn enkele verschillen in de lysate voorbereidingen van de verschillende grondstoffen. Andere maatregelen met inbegrip van sacharose kleurovergang voorbereiding en polysomal fractionering zijn identiek en niet afhankelijk van monsterbron.

  1. Leishmania grote cytoplasmatische lysate voorbereiding
    1. Leishmania grote (FV1 stam) cellen in 1 x M199 middellange29 dat 10% foetale boviene Serum (FBS) en penicilline/streptomycine mengsel bevat 30 mL beënten (100 stuks en 100 μg/mL navenant)dichtheid 1 x 105 cellen/ml .
      Opmerking: Alle stappen waarbij Leishmania grote cellen moeten plaatsvinden in een kabinet bioveiligheid.
    2. Plaats van cellen in de incubator en ze groeien bij 27 ° C tot de logaritmische fase (medio log overeenkomt met 5 x 106 cellen/mL). Het duurt meestal ongeveer twee dagen om te groeien.
    3. Cycloheximide aan Leishmania grote cultuur om een eindconcentratie van 100 μg/mL tot arrestatie van de ribosomen op vertaalde mRNAs toevoegen. Cellen plaats terug in de incubator voor 10 min bij 27 ° C.
    4. Nadat cycloheximide behandeling is voltooid, cellen overbrengen in een conische tube van 50 mL en draaien ze op 1800 x g- en 4 ° C voor 8 min. Discard supernatant.
    5. Wassen van cellen met 30 mL Dulbecco van fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). Centrifugeer bij 1800 x g en 4 ° C gedurende 8 min.
    6. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 mL DPBS.
    7. Nemen van een hoeveelheid cellen en meng het met 3,5% formaldehyde oplossing.
    8. Cellen tellen met hemocytometer en hun concentratie te bepalen. Breng het gewenste aantal cellen in microfuge buis. Lysate bereid uit 0.5x108-2 x 108 cellen/mL is voldoende voor één sacharose kleurovergang laden.
    9. Draai de cellen bij 1800 x g en 4 ° C voor 8 min. Verwijder het supernatant.
    10. Resuspendeer de pellet cel op ijs in 1 mL lysis-buffermengsel met proteaseinhibitors en RNase remmer (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1% NP-40, 1 x proteaseinhibitor cocktail (EDTA-vrij), 200 eenheden/mL RNase remmer).
    11. Passeren de lysate een 23-meter naald driemaal. De lysate moet transparant worden na passage door de naald.
    12. Centrifugeer bij 11.200 x g en 4 ° C voor 10 min te verduidelijken lysate. Overdracht van de geklaarde lysate aan een frisse tube en houdt het op ijs tot sacharose kleurovergang ultracentrifugatie.
    13. Verzamelen 400-500 μL van de lysate als input (om later te analyseren), meteen bevriezen in vloeibare stikstof voor toekomstige eiwit analyse of RNA zuivering reagens toe te voegen voordat de bevriezing voor RNA analyse.
  2. Cytoplasmatische lysate bereiding op basis van gekweekte menselijke HeLa cellen
    1. HeLa cellen splitsen en zaad ze in 20 mL van het medium van de DMEM die 10% FBS en penicilline/streptomycine mengsel (100 stuks en 100 μg/mL navenant) met cel rekenen 2 x 105 cellen/mL in een plaat van 15 cm.
    2. HeLa cellen bij 37 ° C, 5% CO2 voor 20-24 h. uitvoeren plasmide DNA transfectie volgens fabrikant protocollen te groeien.
    3. Propageren cellen gedurende 24 uur na de transfectie bij 37 ° C, 5% CO2.
    4. Cycloheximide aan de uiteindelijke concentratie van 100 μg/mL tot arrestatie van de ribosomen op vertaalde mRNAs en Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37 ° C, 5% CO2volwassen HeLa cellen toevoegen. Gecombineerd medium. Wassen van de cellen tweemaal met koude DPBS op ijs.
    5. 500 μL van lysis buffer (20 mM HEPES-KOH pH 7.4, van 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 1 x proteaseinhibitor cocktail (EDTA-vrij), 200 eenheden/mL RNase remmer of 1 mg/mL heparine) toevoegen aan de plaat en schraap de cellen op het ijs.
    6. De lysed cellen overbrengen in de microfuge buis. Aanpassen van de concentratie van NP-40 tot 0,5% en MgCl2 tot 5 mM volgens de toename van het volume van het monster.
    7. Passeren de lysate een 23-meter naald 3 - 6 keer.
    8. Spin 11.200 x g en 4 ° C voor 8 min te verduidelijken lysate. Na het centrifugeren, door bovendrijvende substantie te overbrengen in een nieuwe buis. Een spectrofotometer gebruiken om cellysis doeltreffendheid te beoordelen en te bepalen bedrag van de steekproef voor het laden op de helling. 10 μL van monster toevoegen aan 0,5 mL 0,1% natrium Dodecyl Sulfaat (SDS). Lege tegen 0,1% SDS. Meten van de absorptie bij 260 nm. Waarde van de verwachte absorptie is rond 15-20 eenheden/mL.
    9. Verdun alle monsters met lysis-buffermengsel op dezelfde waarde extinctie voordat sacharose kleurovergang centrifugeren. Houd monsters op ijs tot sacharose kleurovergang centrifugeren.
  3. Cytoplasmatische lysate bereiding op basis van muis testis
    1. Ontleden de muis testis. Maak een kleine incisie in de tunica albuginea en verzamelen de seminiferous tubuli van de teelballen en overbrengen in een conische tube van 15 mL met 5 mL DPBS aangevuld met 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF).
    2. Meng het weefsel krachtig door meerdere malen omkeren. Het toestaan van het weefsel te vestigen op de ernst van de eenheid op ijs gedurende 5 minuten.
    3. Verwijder en negeren de bewolkt buffer met bindweefsel cellen en weefsel fragmenten. Herhaal de procedure 2-3 keer. De resterende witte pellet wordt verrijkt voor seminiferous buisjes en geslachtscellen.
    4. De pellet van seminiferous zaadvormende overbrengen in een tube van 2 mL microcentrifuge en spin op 500 x g voor 1 min. Verwijder het supernatant.
    5. Voeg toe 500 µL van lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 1 x proteaseinhibitor cocktail (EDTA-vrij), 1 mg/mL heparine of 200 eenheden/mL RNase remmer) aan de tubuli. Gebruik een pipet om het triturate van het weefsel.
    6. Spoel de suspensie met een klein (0,5-1,0 mL) Dounce homogenizer. Het verstoren van het weefsel met zeven tot acht lijnen van de stamper van de glazen.
    7. De lysate overbrengen naar een 1,5 mL microcentrifuge buis.
    8. Centrifugeer het monster van 12.000 x g- en 4 ° C gedurende 8 minuten om te wissen de lysate. Overbrengen in het supernatant een nieuwe buis en winkel op ijs tot laden op het verloop van sacharose.
    9. Verzamel 50 μl van de lysate als input monster, meteen bevriezen bij-80 ° C voor toekomstige eiwit analyse; of RNA zuivering reagens voor bevriezing RNA p.a. toe te voegen.

2. sacharose kleurovergang voorbereiding en ultracentrifugatie

  1. Twee sacharose kleurovergang oplossingen (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 x proteaseinhibitor cocktail), bevattende hetzij 10 gewichtspercenten sacharose of 50 gewichtspercenten sacharose te bereiden. (Tris-HCl, pH 7.4, kan worden gebruikt in plaats van HEPES). Voeg 200 eenheden/mL RNase remmer of 1 mg/mL heparine volgens de proefopzet. Plaats een buis van de ultracentrifuge voor SW 41 rotor in het marker blok en trek de lijn langs het bovenste niveau van het blok. Breng de buis in een stabiele rack.
  2. Neem een 10 mL spuit met de gelaagdheid-apparaat dat is aangesloten en vul de injectiespuit met 10% sacharoseoplossing (bereid als hierboven). Voorzichtig los aan de onderkant van de buis van de ultracentrifuge totdat zij het mark op de buis tot.
  3. Vul een ander spuit met 50% sacharoseoplossing en schuif voorzichtig de gelaagdheid apparaat door de 10% sacharose laag naar de onderkant van de buis. Laat zachtjes los sacharoseoplossing vanaf de onderkant totdat zij het mark op de buis tot. Het zegel van de buis met het meegeleverde GLB.
  4. Ter voorbereiding van het verloop van sacharose, zet u de kleurovergang maker apparaat ON. Niveau van de plaat met behulp van de omhoog of omlaag knoppen en druk op DONE. Herverdeling is belangrijk voor de lineariteit van het verloop.
  5. Na de herverdeling van de plaat pers GRAD om de kleurovergang menu te openen. Ga naar de lijst op de kleurovergang menu en selecteer de SW 41 Ti-rotor. Kies vervolgens het gewenste sacharose verloop in de lijst van het menu met behulp van de knoppen omhoog en omlaag . Druk op gebruik.
  6. Plaats de houder van de kleurovergang buis op de plaat van de maker van de gradiënt. Breng de buis in de houder. Tot 6 verlopen kunnen bereid worden op hetzelfde moment. Druk op uitvoeren. De maker van de gradiënt draait de buizen op de geprogrammeerde snelheid en hoeken vormen een lineair verloop. Het duurt slechts een paar minuten te bereiden van het verloop.
  7. Wanneer het proces is voltooid, plaatst u de buizen in een rack. De doppen opstijgen. Het verwijderen van hetzelfde volume als het monstervolume vanaf de bovenkant van de ultracentrifuge buizen.
  8. Zorgvuldig laden 400-500 μL lysate bevatten 15-20 A260 eenheden van polysomes op de top. Plaatsen van de buizen in de rotor emmers en ze in evenwicht te brengen.
  9. Centrifugeer bij 260.000 x g en 4 ° C gedurende 2 h met gebruikmaking van SW 41 rotor.

3. Polysoom fractionering en Sample collectie

Opmerking: Hoewel lysate preparaten enkele verschillen afhankelijk van de bron hebben, kleurovergang voorbereiding en Polysoom fractionering protocollen zijn hetzelfde voor alle soorten lysates.

  1. Na voltooiing van de ultracentrifugatie, plaatst u de rotor emmers met de buizen op ijs. Draai breuk verzamelaar en kleurovergang fractionator ON. Klik op SCAN in het menu fractionator. Een rack met 24 collectie buizen in de collector van de Fractie gebracht.
  2. Vul een reservoir van de spoelen aan de zijkant van de fractionator met gedeïoniseerd water. Druk op de toets van de spoelen voor 10 s te spoelen de pomp op fractionator. Bevestig een spoel-adapter met de spuit gevuld met water om de zuiger voor het kalibreren.
  3. Open de fractionator software op de computer. Druk op kalibreren. Gebruik de standaardinstellingen en druk op OK. Wees klaar om het injecteren van water uit spuit.
  4. Druk op OK om te doen van de kalibratie. Onmiddellijk beginnen met het injecteren van water voor de volgende 5 s. Gedurende deze tijd, water zal stromen door de UV-detector stroom-cel en het instrument zal worden gekalibreerd. Het teken Nul Kalibratie voltooid wordt weergegeven. Het instrument is klaar voor fractionering.
  5. Verwijder de adapter spoelen met de spuit. Sluit een uiteinde aan de zuiger van de fractionator.
  6. Open de messing lucht ventiel en druk op lucht sleutel voor 10 s tot droge leidingen en stroom cel. Sluit de klep van de lucht.
  7. Zachtjes de kleurovergang buis uit de emmer rotor verwijderen en plaats deze in het rek. De buis houder GLB toepassen op de bovenkant van de buis en zorgvuldig bewegen de buis in de buis-houder en vergrendelen in positie.
  8. Plaats de houder onder de zuiger van de fractionator. Polysomal banden kunnen vaak worden gezien met het blote oog. Invoeren van de gewenste instellingen voor breuk getallen en volume (24 breuken bij 500 μL/fractie zijn meestal voldoende). Geef het bestand op de juiste manier. Druk op OKen vervolgens Ga naar grafiek knop. In het volgende venster, drukt u op START SCAN. Instellingen wordt weergegeven, drukt u op OK. De verzamelaar zal verplaatsen van de goot op de eerste breuk en de zuiger zal verhuizen naar de buis. Wanneer de zuiger de top van het verloop bereikt op zal zacht naar de geselecteerde snelheid en de fracties zal worden verzameld. Wanneer voltooid, wordt de zuiger beweegt uit de kleurovergang buis.
  9. Open de messing lucht ventiel en druk op lucht -toets op de fractionator voor het ophalen van de laatste fractie.
  10. Verplaats de buizen van het rek op ijs.
  11. Voeg 2 delen van RNA zuivering reagens voor elke fractie en flash bevriezen in vloeibare stikstof tot zuivering van RNA. Als alternatief, als proteïne worden geanalyseerd moet, trichloorazijnzuur aan toevoegen de eindconcentratie van 10% te concentreren ze voor westelijke bevlekkende (zie punt 8).

4. bereiding van synthetische RNA In Vitro normalisering van mRNAs niveaus tijdens de analyse van de gegevens van het RT-qPCR

Opmerking: De E. coli OmpA mRNA wordt gebruikt in dit protocol voor normalisatie. Elke andere RNA waaraan nog geen uitgebreide identiteit met de mRNAs van het bestudeerde organisme (zoogdieren of Leishmania) kan worden gebruikt.

  1. Het fragment van de OmpA DNA SP6 promotor reeks bevattende een standaard PCR-reactie van een plasmide met OmpA gene30voor te bereiden.
  2. 100 µL van het mengsel te bereiden: 80 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 16 mM MgCl2, 2 mM Spermidine, 10 mM DTT, 3 mM ATP, 3 mM CTP, 3 mM UTP, 3 mM GTP, 0.5 U/μL RNase remmer, 1 μg OmpA PCR DNA, 3 μL SP6 RNA-polymerase , 0,005 U/l-pyrophosphatase.
  3. Incubeer bij 40 ° C gedurende 2 uur.
  4. Zuiveren RNA door een RNA zuivering kit.
  5. Concentratie door spectrofotometer meten en onderzoeken door agarose gelelektroforese.

5. RNA isolatie van Gradient breuken en cDNA voorbereiding

Opmerking: Ga door rechtstreeks met dit protocol voor RNA zuivering als een RNase-remmer werd gebruikt als een ribonuclease inhibitor. Echter wanneer gebruikt als een ribonuclease inhibitor, zal heparine remmen reverse-transcriptase gebruikt in cDNA voorbereiding. Daarom zal extra zuivering van RNA nodig zijn indien heparine werd gebruikt in de lysis-buffermengsel en verloop. Zie afdeling 6 voor te bereiden op RNA cDNA synthese als heparine werd gebruikt.

  1. Ontdooien van de monsters met RNA zuivering reagens, Voeg 20 ng van synthetische RNA als interne controle voor normalisatie van RT-qPCR resultaten. Doorgaan met RNA voorbereiding volgens de fabrikant protocol behalve één wijziging. Voeg 1 µL van RNA rang glycogeen (20 µg) voorafgaande isopropanol en neerslag. Ontbinden RNA pellets in 20-25 µL RNase-gratis water.
    Opmerking: Glycogeen dient als een drager en helpt om te voorkomen dat verliezen en visualiseren van RNA pellet tijdens het zuiveringsproces ongehinderd. OmpA mRNA wordt gebruikt voor verdere normalisering in RT-qPCR reacties.
  2. RNA concentratie met behulp van de spectrofotometer om voldoende opbrengst meten. Combineer gelijke hoeveelheden van RNA breuken met 40S, 60S en monosomes als prepolysomes. Breuken met 2-4 ribosomen combineren als lichte polysomes en breuken met 5-8 ribosomen combineren als zware polysomes.
  3. 5-10 µL van RNA van gecombineerde breuken gebruiken ter voorbereiding van de cDNAs met behulp van een kit en de aanbevelingen van de fabrikant.
  4. 80 µL van nuclease gratis water aan 20 µL van cDNA toevoegen. Bevriezen van de cDNA monsters bij-20 ° C.

6. RNA zuivering van heparine besmetting

Opmerking: Heparine remt nucleïnezuur verwerking van enzymen zoals reverse-transcriptase. Daarom dit extra reiniging-protocol te gebruiken wanneer heparine wordt gebruikt in de lysis-buffermengsel en/of in het verloop.

  1. LiCl toevoegen om een eindconcentratie van 1 M aan de gezuiverde RNA samples.
  2. Meng de monsters en incubeer op ijs gedurende 1 uur.
  3. Draaien van de monsters bij 16.000 x g en 4 ° C gedurende 15 minuten.
  4. Verwijder het supernatant zo compleet mogelijk met behulp van een precisiepipet.
  5. De korrels voor ongeveer 5 minuten drogen.
  6. Resuspendeer de korrels in de aanvankelijke omvang van RNase-gratis water.
  7. Uitvoeren van spectrofotometrische meting bij 260 nm tot het bepalen van de concentratie van het RNA. Meestal, is het verlies van het monster minimaal.

7. RT-qPCR en Data-analyse van mRNA distributie

  1. Combineer 10.2 μL van 20 μL van SYBR groen, water, 4.8 μL van gene specifieke primers (2,5 μM elke set), 5 μl van cDNA, meng goed en 10 μL per putje in triplicates in 384-well plaat geladen.
  2. Afdekplaat met kleeffilm strak samen en centrifugeer plaat bij 1800 x g gedurende 5 min.
  3. Met een Real-Time PCR-instrument, is instellen van qPCR reactie onder de voorwaarden vermeld in de tabel 1.
  4. Met behulp van de drempel van de cyclus (CT) bereken waarden en de vergelijkende CT (ΔΔCT) methode31 het percentage (%) van mRNA distributie in prepolysomes, licht en zware polysomes als beschreven32 met één wijziging. Gebruik synthetische RNA (OmpA hier) voor de normalisatie van de gegevens in de analyse van de gegevens van de RT-qPCR. De synthetische RNA biedt een normalisatie-besturingselement waarmee berekenen de relatieve mRNAs niveaus te vergelijken in verschillende fracties van een verloop.

8. analyse van eiwitten in Polysomal breuken door het westelijke bevlekken

  1. Uit een voorraad van 100% (m/v), trichloorazijnzuur (TCA) toevoegen aan de geselecteerde breuken (500 l) om een eindconcentratie van 10%, houd op ijs gedurende ten minste 15 minuten, centrifuge in een microfuge voor 5 min, weggeworpen, wassen tweemaal met ijskoude aceton en Los dit op in 25 μL van S DS-monster laden paginabuffer voor elektroforese.
  2. De belasting op de SDS-pagina en voeren standaard elektroforese met volgende overdracht aan het membraan PVDF. Ga verder met het westelijke bevlekken33.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie, beschrijven we de toepassing van de polysomal profiling techniek op drie verschillende bronnen: parasitaire Leishmania grote, gekweekte menselijke cellen en muis testis. Leishmania cellen groeien vrij in de vloeibare media in suspensie, gekweekte menselijke cellen groeien in het aanhangend enkelgelaagde op platen, en de testis muis een weefsel steekproef. De methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere soorten vrij volwassen cellen in schorsing, ve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polysoom fractionering door sacharose verloop in combinatie met RNA en eiwit analyse van breuken is een krachtige methode voor het analyseren van translationeel status van individuele mRNAs of de hele translatome en rollen van proteïne factoren reguleren translationeel machine tijdens normale fysiologische of ziekte staat. Polysomal profilering is een speciaal geschikt techniek te studeren translationeel verordening in organismen zoals trypanosomatids, met inbegrip van Leishmania waar Transcriptionele controle g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Ching Lee voor hulp met audio-opname. Het onderzoek werd gesteund door de Start-up middelen uit Texas Tech University Health Sciences Center en door het Center of Excellence voor translationele neurowetenschappen en Therapeutics (CTNT) toekennen PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; gedeeltelijk door de NIH grant R01AI099380 K.Z. James C. Huffman en Kristen R. Baca waren CISER (centrum voor de integratie van STEM onderwijs & onderzoek) geleerden en werden ondersteund door het programma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Instrumenten:
Gradient masterBiocomp Instruments Inc.108
Piston Gradient FractionatorBiocomp Instruments Inc.152
FractiecollectorGilson, Inc.FC203B
NanoDrop OneThermo ScientificNanoDrop One
Nikon invers microscoopNikonECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermal CyclerApplied Biosystems by Life Technologies4359659
CO2 incubatorPanasonic Healthcare Co.MCO-170A1CUV
HERATHERM incubatorThermo Scientific51028063
Biologische veiligheidskast, klasse II, type A2NuAire Inc.NU-543-400
Revco vriezerRevco TechnologiesULT1386-5-D35
Beckman L8-M UltracentrifugeBeckman CoulterL8M-70
CentrifugeEppendorf5810R
CentrifugeEppendorf5424
Ultracentrifuge Rotor SW41Beckman Coulter331362
Swing-bucket rotorEppendorfA-4-62
Fixed angle rotorEppendorfF-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR-machine 285880228Applied Biosystems by life technologies4470661
TC20 Geautomatiseerde celtellerBio-Rad145-0102
HemacytometerHausser Scientific02-671-51B
Software 
Triax software Biocomp Instruments Inc.
Materialen:
Telplaatjes, dubbel kamer voor celtellerBio-Rad145-0011
1,5 mL microcentrifugebuisjeUSA Scientific1615-5500
Polyclear centrifugebuizen met open bovenzijde, (14 mm x 89 mm)Seton Scientific7030
Spuit, 5 mLBD309646
BD Spuit 3 mL23 Gauge 1 Inch NaaldBD10020439
Nunclon Delta Surface plaat, 14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta Surface plaat, 9 cmThermo Scientific172931
Nalgene rapid-flow 90mm filtereenheid, 500 mL, 0.2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3 kolfThermo Scientific130193
Nunc 50 mL kegelvormige centrifugebuizenThermo Scientific339653
Chemicaliën:
Trizol LSAmbion by Life Technologies10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Trizma baseSigmaT1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-hoge glucose (DMEM)SigmaD6429-500ML
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF0926-50ML
Penicilline-Streptomycine (P/S)SigmaP0781-100ML
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS)SigmaD8537-500ML
Magnesiumchloride hexahydraat (MgCl2x6H2O)Acros OrganicsAC413415000
Kaliumchloride (KCl)SigmaP9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)Fluka (Sigma-Aldrich)74385
Recombinant Rnasin Ribonuclease InhibitorPromegaN2511
Heparine natriumzoutSigmaH3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-vrije proteaseremmersRoche Diagnostics11836170001
GlycogenThermo ScientificR0551
WaterSigmaW4502-1L
CycloheximideSigmaC7698-1G
ChloroformFisher Scientific194002
Dithiothreitol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Ethidium BromideFisher ScientificBP-1302-10
Ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumdehydraat (EDTA)Fisher ScientificS316-212
OptimemLife Technologies22600050
Puromycine dihydrochlorideSigmaP8833-100MG
SucroseFisher ScientificS5-3KG
Trypsine-EDTA oplossingSigmaT4049-100ML
Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase KitApplied Biosystems by life technologies4368814
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems by life technologies4367659
HClFisher ScientificA144SI-212
IsopropanolFisher ScientificBP26324
Kaliumhydroxide (KOH)Sigma221473-500G
Anti-RPL11 antilichaamAbcamab79352
Ribosomaal eiwit S6 (C-8) antilichaamSanta Cruz Biotechnology Inc.sc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
Lithium chlorideSigmaL-9650
Dimethylsulfoxide (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Gel Loading Buffer IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgaroseThermo Scientific

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069(2013).
  3. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
  4. Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
  5. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  6. Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  7. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  8. Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
  9. Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15(2017).
  10. Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
  11. Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
  12. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  13. Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
  14. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  15. Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
  16. Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
  17. Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
  18. Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
  19. Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
  20. Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
  21. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128(2013).
  22. De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
  23. Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
  24. De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
  25. Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
  26. McNicoll, F., et al. Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
  27. Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
  28. Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
  29. Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
  30. Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
  31. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  32. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
  33. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  34. Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
  35. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  36. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
  37. Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
  38. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Sucrosegradi ntultracentrifugatielysaatbereidingfractieverzamelingRNA analyseWestern blotribosoomassociatietranslatieregulatiemodelorganismen

Gerelateerde artikelen