Identificatie van genetische varianten bij te dragen tot complexe ziekten bij de mens laat ons toe om nieuwe mechanismen te identificeren. Hier, aantonen wij een multiplex genotypering aanpak aan kandidaat-genen of gene traject analyse die maximaliseert de dekking tegen lage kosten en is vatbaar voor cohort gebaseerde studies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kandidaat-gen in klinische cohortstudies met Multiplexed genotypering en massaspectrometrie testen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Complexe aandoeningen zijn vaak ondersteund door meerdere voorkomende genetische varianten die tot de gevoeligheid van de ziekte bijdragen. Hier beschrijven we een kosteneffectieve tag single nucleotide polymorphism (SNP) aanpak massaspectrometrie, een multiplexed genotypering assay met te onderzoeken gene traject verenigingen in klinische cohorten. We onderzoeken de voedsel allergie kandidaat-locus Interleukin13 (IL13) als voorbeeld. Deze methode maximaliseert efficiënt de dekking door gebruik te maken van gedeelde koppeling onevenwicht (LD) binnen een regio. Geselecteerde LD SNPs vervolgens beogen in een multiplexed assay, waardoor maximaal 40 verschillende SNPs te analyseren gelijktijdig, stimuleren van kosteneffectiviteit. Polymerase-kettingreactie (PCR) wordt gebruikt voor het versterken van de target loci, gevolgd door extensie van één nucleotide, en de waarbij vervolgens worden gemeten met behulp van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie-tijd van de Spectrometrie van de massa van de flight(MALDI-TOF). De ruwe uitvoer wordt geanalyseerd met het genotype aanroepen van software, met behulp van strikte kwaliteitscontrole definities en cut-offs, en hoge waarschijnlijkheid genotypen zijn bepaald en output voor data-analyse.
Inleiding
In complexe ziekten bij de mens, genetische varianten bijdragen tot ziekte gevoeligheid en kwantificeren van deze varianten kunnen nuttig zijn voor begrip pathogenese, hoog risico patiëntengroepen, en behandeling-responders te identificeren. Inderdaad, de belofte van precisie geneeskunde is afhankelijk van het met behulp van genomische informatie ter identificatie van de patiënt subgroepen1. Helaas, binnen de complexe ziekte biologie ruimte, waar ziekte fenotypen geschraagd worden door een grote genetische heterogeniteit, lage doordringendheid en variabele expressiviteit, cohort formaat vereisten voor genoom-brede benaderingen te identificeren ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het genetische materiaal gebruikt hierin werd ethisch goedgekeurd voor gebruik door het Bureau voor kinderen HREC (menselijke ethiek Commissie onderzoek) (CDF/07/492), het departement van menselijke diensten HREC (10/07) en de Koninklijke kinder ziekenhuis (RCH) HREC (27047).
1. de ontwerpen van de Multiplexed Assay
- Een lijst van SNP voorbereiden assay ontwerp.
- Inbreng van de doel-regio in de muzikale functie van Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Gebruik de LD (correlatie, r2) tussen SNPs verspreid over de regio doel voor het genereren van een lijst van SNPs, die volledige dekking v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met het protocol zoals hierboven beschreven, label we gegenotypeerde SNPs over het Th2 immuun gen IL13 in een cohort van voedsel allergie gevallen en besturingselementen9. We logistische regressieanalyse, gecorrigeerd voor het voorgeslacht en andere potentiële covariates, om te testen of de genetische varianten binnen de regio van belang voedsel allergie risico toegenomen toegepast. Tabel 10 9 ziet u dat één variant.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier tonen we de methode van multiplexed genotypering met behulp van spectrometrie van de massa. De representatieve resultaten werden gegenereerd met behulp van PCR MALDI-TOF massa spectrometrie4 met assay chemie in de Tabel van materialen13genoemde gekoppeld. Met dit platform, we genereerden een totaal van 11,295 genotypen op 1,255 personen voor 9 SNPs binnen 40 h in het lab.
We illustreren het nut van de techniek bij de beantwo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen bevestigingen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Genomic DNA | - | - | 1 μL bij een concentratie van 5-10 ng/μL |
| Primers: voorwaartse en omgekeerde amplificatie en extensie | IDT | - | zie manuscript sectie 1.2.1 over het ontwerp van primers |
| Gedeïoniseerd water | Bijvoorbeeld Milli-Q water | - | gedeïoniseerd met 18,2 MΩ.cm resistiviteit |
| Genotyperingsreagenskit. iPLEX Gold Chemistry reagensset | Agena Bioscience | #10148-2 | bevat alle reagentia voor reacties in 2.2.1, 2.3.1 en 2.4.2, chip en hars |
| PCR platen (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | Voor het MassARRAY systeem zijn platen van Abgene compatibel |
| Micropipetten | enkelvoudig en 8-kanaals | ||
| Centrifuge | compatibel met 384-well platen | ||
| Thermocycler | compatibel met PCR-programma's zoals beschreven in 2.2.4, 2.3.2 en 2.4.3 | ||
| Dimple harsplaat | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 Systeem | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool gebruikt om de multiplex genotyperingsassays te ontwerpen | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzym | ||
| Hars | Agena Biosciences | Wordt geleverd met iPLEX kit |
Referenties
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
