Methodenartikel

Een In Vitro Model voor het bestuderen van het Effect van Fotodynamische therapie 5-Aminolevulinic Zuur-gemedieerde op Staphylococcus aureus Biofilm

7.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57604

⸱

16 april 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een protocol om te bestuderen van de antimicrobiële werking van 5-aminolevulinic zuur-gemedieerde Fotodynamische therapie (PDT-ALA) op een biofilm Staphylococcus aureus . Dit protocol kan worden gebruikt om een in vitro model om te bestuderen van de behandeling van bacteriële biofilms met PDT in de toekomst te ontwikkelen.

Samenvatting

Staphylococcus aureus (S. aureus) is een gemeenschappelijke menselijke pathogenen, waardoor pyogenic en systemische infecties. S. aureus -infecties zijn moeilijk uit te roeien niet alleen te wijten aan de opkomst van antibiotica-resistente stammen, maar ook zijn vermogen om vorm biofilms. Fotodynamische therapie (PDT) heeft onlangs, is aangegeven als een van de mogelijke behandelingen voor het beheersen van biofilm infecties. Echter zijn verdere studies nodig om onze kennis van de invloed ervan op bacteriële biofilms, evenals de onderliggende mechanismen te verbeteren. Dit manuscript beschrijft een in vitro model van PDT met 5-aminolevulinic acid (5-ALA), een voorloper van de werkelijke fotosensitizer, protoporfyrine IX (PpIX). Kort, oudere S. aureus biofilms werden geïncubeerd met ALA en vervolgens blootgesteld aan het licht. Vervolgens was het antibacteriële effect van ALA-PDT op S. aureus biofilm gekwantificeerd door het berekenen van de kolonievormende eenheden (CFUs) en gevisualiseerd door levensvatbaarheid fluorescerende vlekken via confocale laser scanning microscopie (CLSM). Representatieve resultaten toonde een sterke antibacteriële werking van ALA-PDT op S. aureus biofilms. Dit protocol is eenvoudig en kan worden gebruikt voor het ontwikkelen van een in vitro model voor het bestuderen van de behandeling van S. aureus biofilms met ALA-PDT. Het kan in de toekomst ook in PDT studies met behulp van andere photosensitizers voor verschillende bacteriestammen met minimale aanpassingen worden verwezen.

Inleiding

S. aureus is een belangrijke Gram-positive pathogenen die de huid en mucosa van menselijke gastheren koloniseert. Haar vermogen om vorm biofilms wordt beschouwd als een belangrijk aspect van de pathogenese1. Bacteriële biofilms zijn een Gemeenschap van bacteriën die zijn ingesloten in een zelf geproduceerde matrix, die is samengesteld uit de extracellulaire polymere stoffen, zoals polysacharide, DNA en proteïne. Deze matrix speelt een belangrijke rol in de persistentie van bacteriële infecties, bijgedragen tot een hoge mate van weerstand tegen het menselijke immuunsysteem en de huidige anti-microbiële therapieën2. Antibiotica zijn nog steeds de belangrijke behandeling tegen biofilms infecties, hoewel de effecten van antibiotica op biofilms beperkt zijn. Eerder is aangetoond dat cellen in biofilms 10 - 1000 keer meer resistent zijn tegen antibiotica vergeleken met hun tegenhangers van de planktonische3. Dus, alternatieve strategieën nodig zijn om het veroveren van deze kwestie.

PDT, een alternatieve behandeling van bacteriële infecties, wordt het licht van een passende golflengte om te activeren photosensitizers. Dit leidt tot de productie van reactieve zuurstof soorten (ROS), die dodelijk voor de doelcellen zijn door beschadiging van DNA4, verstoren de celwand en enzymen te inactiveren. Dit kenmerk voor meerdere doelen maakt het moeilijk voor bacteriën ontwikkelen resistentie tegen de behandeling met PDT.

De antimicrobiële effect van PDT op bacteriële en schimmelinfecties biofilms, met meerdere photosensitizers, zoals toluïdine blauw, groen Malachiet, methyleenblauw, chloor e6 en porphyrins, is bestudeerd in vorige verslagen5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, een voorstadium van de werkelijke fotosensitizer, PpIX, wordt gekenmerkt door zijn kleine moleculaire gewicht en de snelle goedkeuring12,14. Deze voordelen geven ALA-PDT groot potentieel als een therapeutische toepassing. Hoewel het effect van ALA-PDT op planktonische bacteriën is bestudeerd door vele groepen12, heeft het antimicrobiële effect van ALA-PDT op bacteriële biofilms niet toch geweest opgehelderd. Ondertussen is het moeilijk te vergelijken van de resultaten van eerdere studies. Een van de redenen is dat de verschillende protocollen worden gebruikt door diverse groepen. Dus, dit protocol beschrijft een in vitro model van een ALA-PDT-systeem is gebaseerd op onze eerdere werk15. Het effect van dit model werd bevestigd door CFU berekening en levensvatbaarheid kleuring met CLSM.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. de Biofilm vorming

  1. Biofilm vorming in 96-Wells-microplates
    1. Ophalen van de S. aureus -stam USA300 en 3 biofilm-vormende klinische stammen (C1 - C3) opgeslagen bij-80 ° C.
      Opmerking: Het vermogen van de klinische stammen aan formulier biofilms werd bepaald door de microtiterplaat plaat assay eerder beschreven15.
    2. Enten van de bacterie in 5 mL trypton soja Bouillon (TSB) medium, en cultiveer in een broedmachine met schudden bij 37 ° C's nachts aan de stationaire fase.
    3. Centrifugeer het nachtelijke bacteriecultuur bij 4000 x g gedurende 10 minuten bij 25 ° C en vervolgens Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellets in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een eindconcentratie van 2.0 x 109 CFU/mL.
      Opmerking: De concentratie van de bacteriën werd geschat door het meten van de extinctie en verder bepaald door plaat rekenen16, onthullen dat 1 OD600 van schorsing opgenomen 1.5 x 108 CFU/mL.
    4. Verdun de bacteriële suspensie te 1:200 (1.0 x 107 CFU/mL) in TSB opslagmedium met 0,5% glucose. Inoculeer 200 µL van bacteriële suspensie in ieder putje van een cel-cultuur-testgroep polystyreen 96-Wells-microplate.
    5. Incubeer de microplate statisch bij 37 ° C gedurende 24 uur onder een goed zuurstofrijk milieu.
      Opmerking: De incubatietijd voor volwassen biofilm vorming kan variëren voor verschillende bacteriestammen; Dit moet worden bepaald voordat de PDT experimenteren15.
    6. Was de putjes goed microplate zachtjes met PBS driemaal, negeren van de media in de putjes en vervolgens Verwijder het supernatant.
      Opmerking: De stap moet worden uitgevoerd heel voorzichtig om te voorkomen dat de gevormde biofilm verstoren.
  2. Biofilm vorming in gerechten
    1. Enten van de S. aureus -stam USA300 in 5 mL van TSB medium, en cultiveer in een broedmachine met schudden bij 37 ° C's nachts aan de stationaire fase.
    2. Centrifugeer het nachtelijke bacteriecultuur bij 4000 x g gedurende 10 minuten bij 25 ° C en vervolgens Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellets in PBS om een eindconcentratie van 2.0 x 109 CFU/mL. Dan Verdun de bacteriële suspensie te 1:200 (1.0 x 107 CFU/mL) in TSB opslagmedium met 0,5% glucose. Enten van 2 mL van bacteriële suspensie in een 35-mm optische kwaliteit glazen bodem cel cultuur schotel en incubeer statisch bij 37 ° C gedurende 24 uur.
      Opmerking: De concentratie van de bacteriën werd geschat door het meten van de optische dichtheid.
    3. De media met een pipet, gecombineerd en spoel de biofilms in de schotel voorzichtig met PBS driemaal en vervolgens Verwijder het supernatant zorgvuldig.
      Opmerking: Raak het uiteinde van de pipet naar de onderkant van de schotel. De stap 2.2 moet worden uitgevoerd onmiddellijk na deze stap om te voorkomen dat het drogen van de gevormde biofilm.

2. lichte bestraling

  1. 5-ALA in een koelkast 4 ° C worden opgeslagen. Voordat het experiment, Verdun 5-ALA met PBS tot 10 mM.
    Opmerking: 5-ALA oplossing moet vers worden bereid voor het experiment.
  2. In de experimentele groep, voeg toe 200 µL van 10 mM ALA aan elk putje van de microplate of 2 mL tot de cultuur schotel. Dekking van de plaat/schotel met aluminiumfolie en incubeer gedurende 1 uur. Vervolgens het bestralen van de plaat/schotel met een licht afgevende diodes (LED) met een lage intensiteit van 100 mW/cm2 voor 1 h om een lichte dosis van 360 J/cm2 bij een grote golflengte van 633 ± 10 nm17.
    Opmerking: Om te laten de lichtenergie worden effectief en even afgeleverd bij de biofilm in alle putten/gerechten, de afstand van de piek van de lichtbron tot de goed/schotel 6.0 cm vast, en beperken van de experimentele regio op het gebied van de centrale bestraling (10 cm x 8 cm). om ervoor te zorgen dat de resultaten reproduceerbaar zijn, de experimenten moeten worden uitgevoerd bij dezelfde kamer temperatuur.
    In de LED bestraling stap, om te voorkomen dat de rechtstreekse blootstelling van de plaat aan andere lichtbronnen, zoals zonlicht, ruimtelicht of lamplicht, de LED is ingeschakeld voordat u de plaat/schotel naar de bestraling gebied, en het licht was helder genoeg om de bewerking te voltooien.
  3. Instellen van de controlegroepen (drie controlegroepen werden opgezet in ons experiment).
    1. Voor het eerste besturingselement wordt in groep (ALA - LED-), 200 µL van PBS toevoegen aan elk putje van de microplate of 2 mL tot de cultuur schotel. Dekking van de plaat/schotel met aluminiumfolie en het Incubeer gedurende 2 uur.
    2. Voor de tweede controlegroep (ALA + LED-), 200 µL van 10 mM ALA toevoegen aan elk putje van de microplate of 2 mL tot de cultuur schotel. Dekking van de plaat/schotel met aluminiumfolie en het Incubeer gedurende 2 uur.
    3. Voor de derde controlegroep (ALA-LED +), 200 µL van PBS toevoegen aan elk putje van de microplate of 2 mL tot de cultuur schotel. Dekking van de plaat/schotel met aluminiumfolie en het Incubeer gedurende 1 uur. Dan bloot de plaat op de LED met 360 J/cm2 lichte bestraling bij een grote golflengte van 633 ± 10 nm17.
      Opmerking: In de LED bestraling stap, vermijd directe blootstelling van de plaat aan andere lichtbronnen, zoals zonlicht, ruimtelicht of lamplicht.

3. bepaling van de effectiviteit van PDT behandeling

Opmerking: Om te bevestigen het effect van ALA-PDT op de S. aureus biofilms, de levensvatbaarheid van de cellen met of zonder ALA-PDT werd geëvalueerd door het tellen van de CFU alsmede door levensvatbaarheid kleuring.

  1. Bepaling van de resterende levensvatbare bacteriële cellen
    1. Na de ALA-PDT behandeling, negeren van de media in de putjes en was de putjes met PBS driemaal te verwijderen van alle niet-aanhanger cellen voor beide experimentele en controlegroepen.
      Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd heel zachtjes.
    2. Schraap de aanhangend bacteriën cellen grondig de putjes met de pipet-tip en het verzamelen van de cellen in de conische buisjes.
    3. Centrifugeer de bacteriële schorsing bij 4000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, en vervolgens de vloeistof wordt weggeworpen.
    4. Resuspendeer de bacteriën in 1 mL van 0,25% Pancreatine enzym in PBS en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1,5 uur.
    5. Centrifugeer bij 4000 x g gedurende 10 minuten; Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL van PBS.
    6. Maken van 1:10 seriële verdunningen van de cel-oplossing met PBS; Voeg vervolgens toe 5 µL van elk monster seriële verdunning op het bord trypton soja agar (TSA). Incubeer de TSA-plaat bij 37 ° C gedurende 16 uur; vervolgens (met blote oog) het aantal bacteriële kolonies (CFU/mL).
  2. Waarneming van S. aureus biofilms door CLSM
    1. Na de bestraling van het licht, spoel de biofilms in de cultuur-schotel met PBS driemaal.
      Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd heel zachtjes.
    2. Voeg 1 mL 1 µM groen-fluorescerende nucleaire en chromosoom vlek thats permeabele aan de prokaryote cel membranen (bijvoorbeeldSYTO9) en 1 mL 1 µM propidium jodide (PI) voor 20 min om de biofilm, evenals dode cellen vlek.
    3. Observeren van levensvatbare cellen (groene fluorescentie, Ex / Em 485 nm/530 nm) en dode cellen (rode fluorescentie, Ex / Em 485 nm/630nm) onder een CLSM met een 63 X 1.4-NA olie-immersie objectief.
    4. Afbeeldingen met behulp van microscopie software genereren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De levensvatbaarheid van de bacteriën in de biofilms werd verlaagd na de ALA-PDT behandeling in vergelijking met de besturingselementen (ALA - LED-, ALA + LED- en ALA-LED +) in zowel USA300 als de drie klinische stammen (Figuur 1).

Om te bevestigen de resultaten van de CFU assay en observeren het antibacteriële effect van ALA-PDT op de S. aureus biofilm in situ, de USA300 biofilms ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

PDT is een goed bestudeerde therapie voor de behandeling van kanker sinds het werd meer dan 100 jaar geleden uitgevonden18. Het laatste decennium, PDT is toegepast als een antimicrobiële strategie en effectiviteit tegen sommige antibiotica-resistente ziekteverwekkende bacteriën12heeft aangetoond. Ten opzichte van de planktonische staat, bacteriële biofilms lijken te zijn meer resistent tegen antibiotica behandeling3, terwijl het effect van ALA-PDT op...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door nationale aard Science Foundation van China voor jonge geleerden (nr. 81300810), Shanghai jonge arts trainingsprogramma (nr. 20141057), en nationale Natural Science Foundation van China (81671982, 81271791 en 81571955). We zouden graag bedanken LetPub (www.letpub.com) voor het verstrekken van taalkundige bijstand tijdens de voorbereiding van dit manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tryptone Soya Broth (TSB)OXOIDCM0129B
Tryptone Soya Agar (TSA)OXOIDCM0131
SYTO9Thermo Fisher ScientificL7012The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits 
Propidium iodide (PI)Thermo Fisher ScientificL7012The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits 
PancreatinSigma-AldrichP3292
5-aminolevulinic acid (ALA)Fudan Zhangjiang Bio-Pharm3.1
Staphylococcus aureus strain USA300//The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”.
Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3)//All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].
96-well microplateCorning Inc3599Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile
FluorodishNEST Biotechnology801001Glass bottom, Non-pyrogenic
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf microcentrifuge 5417EppendorfZ365998 | SIGMA
IncubatorThermo Fisher ScientificSHKE4000MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers
Light emitting diode (LED)Wuhan Yage Optic and Electronic Technique COLED-IB
Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscopeLeica Microsystems
Leica LAS AF softwareLeica Microsystems
IMARIS softwareBitplane

Referenties

  1. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
  2. Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
  3. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
  4. Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
  5. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
  6. Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
  7. Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
  8. Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
  9. Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202(2015).
  10. Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
  11. De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039(2015).
  12. Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
  13. Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
  14. Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
  15. Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627(2017).
  16. Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863(2013).
  17. Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
  18. St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
  19. O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
  20. Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
  21. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
  22. Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
  23. Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kolonievormende eenhedenconfocale laserscanmicroscopiefluorescentiekleuringbacteri le levensvatbaarheidbiofilmvormingantimicrobieel effect

Gerelateerde artikelen