Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters

9.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57609

⸱

7 oktober 2018

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM U1127, CNRS UMR 7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, Sorbonne Universités, 2UPMC Univ Paris 06, INSERM UMRS1166, Institute of Cardiometabolism and Nutrition, Sorbonne Universités

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol ter bevordering van de integratie van transgenic en productie van oprichter transgene muizen met hoge doeltreffendheid door een eenvoudige injectie van een lentivirale vector in de ruimte van de perivitelline van een bevruchte oöcyt.

Samenvatting

Bijna 40 jaar vertegenwoordigt pronuclear DNA injection de standaardmethode voor het genereren van transgene muizen met willekeurige integratie van transgenen. Dergelijke een routineprocedure wordt wijd gebruikt in de hele wereld en haar belangrijkste beperking woont in de arme werkzaamheid van transgenic integratie, wat resulteert in een laag rendement van oprichter dieren. Slechts enkele procenten van dieren die zijn geboren na implantatie van ingespoten bevruchte eicellen hebben geïntegreerd de transgenic. In tegenstelling, lentivirale vectoren zijn krachtige hulpmiddelen voor integratieve genenoverdracht en hun gebruik te transduce van de bevruchte eicellen kan zeer efficiënte productie van oprichter transgene muizen met een gemiddelde opbrengst boven de 70%. Bovendien, een stam van de muis kan worden gebruikt voor de productie van transgene dieren en de doordringendheid van transgenic meningsuiting is extreem hoog, boven de 80% met lentivirale gemedieerde Transgenese vergeleken met DNA microinjection. De grootte van het fragment van DNA die kan lading door de lentivirale vector is beperkt tot 10 kb en vertegenwoordigt de belangrijkste beperking van deze methode. Met behulp van een eenvoudige en gemakkelijk uit te voeren van injectie procedure onder de zona zitten van bevruchte eicellen, kunnen meer dan 50 oprichter dieren worden geproduceerd in een enkele sessie van microinjection. Deze methode is zeer aangepast uit te voeren, direct in de oprichter dieren, snelle winst en verlies van functie studies of scherm genomic DNA-regio's voor hun vermogen om te controleren en reguleren gen expressie in vivo.

Inleiding

Het baanbrekende werk van Gordon et al. in 1980 bleek dat de injectie van de plasmide-DNA in de mannelijke pronuclei van bevruchte eicellen na implantatie bij pseudopregnant muizen, de productie van transgene dieren die geïntegreerd kan opleveren de plasmide DNA1. De demonstratie dat transgene zoogdieren kunnen worden gegenereerd gehad een enorme impact op de wereldwijde biowetenschappen, openen de weg naar nieuwe velden van onderzoek zowel voor basiswetenschappen en translationeel Biomedische Wetenschappen. In de afgelopen vier decennia, is DNA microinjection een gangbare praktijk geworden. Hoewel een enorm aantal transgene muizen zijn vervaardigd, wordt de standaardmethode is niet volledig bruikbaar voor alle muis stammen en vereist tijdrovend backcrosses2,3. De toepassing ervan op andere soorten nog steeds uitdagend4 en de algehele transgenic integratie opbrengst is beperkt tot een paar percentage van geboren dieren5. Bovendien, betekent de werkzaamheid van transgenic integratie de beperkende factor die het slechte algehele rendement van pronuclear DNA injection verklaart. In dit opzicht, integratieve virale vectoren zijn de meest efficiënte gereedschappen om lading en integreren van transgenen en dus kon voorzien in nieuwe middelen aanzienlijk te verhogen integratie opbrengst, de enige beperking is dat de transgenic grootte die niet hoger zijn dan 10 kb6 .

Lentivirale vectoren pseudo-getypte met de envelop eiwitten van het Virus van vesiculaire Stomatitis (VSV) zijn pantropic en zeer integrative gene transfer tools en kunnen worden gebruikt om de bevruchte eicellen7transduce. De zona zitten rond de eicellen is een natuurlijke virus barrière en moet worden doorgegeven zodat transductie met de lentivirale vectoren. Transgene dieren zijn gegenereerd door transducing bevruchte eicellen na micro-boren of verwijderen van de zona zitten8,9. Echter, injectie onder de zona zitten in de perivitelline ruimte lijkt de eenvoudigste methode om de bevruchte eieren zoals oorspronkelijk beschreven door Lois en collega's7transduce.

De perivitelline injectie van lentivirale vectoren kan hoge opbrengsten in de productie van transgene dieren die boven de 70% van de geboren dieren. Deze opbrengst is meer dan 10-fold hoger zijn dan het beste rendement dat kan worden bereikt met behulp van standaard pronuclei DNA injectie7,10,11. In deze context zal één sessie van injecties ten minste 50 transgene oprichters (F0) genereren. Het grote aantal oprichters compatible, dus met fenotypering van het effect van de transgenic rechtstreeks uitgevoerd op F0 Muizen zonder de noodzaak voor het genereren van transgene muis lijnen. Dit voordeel zorgt voor een snelle screening van het transgenic effect en is speciaal aangepast voor het uitvoeren van in vivo winst en verlies van functie studies binnen weken. Daarnaast kunnen regelgevende DNA-elementen ook worden snel gescreend om kaart smaakversterkers en DNA motieven gebonden transcriptie factoren11,12. Met pronuclear injecties integreren transgenen meestal als meerdere exemplaren in een unieke locus. Met lentivirale vectoren, integratie in meerdere loci treedt op als een enkel exemplaar per locus10,13. De veelheid van geïntegreerde loci daarom waarschijnlijk geassocieerd met de zeer hoge expressie doordringendheid waargenomen in de transgene stichters, waardoor de nieuw gegenereerde model robuuster.

Nog belangrijker is, bij het gebruik van pronuclear injectie van DNA, is visualisatie van pronuclei tijdens de procedure absoluut vereist. Deze technische beperking voorkomt het gebruik van de bevruchte eicellen die afkomstig zijn uit een grote verscheidenheid van stammen van de muis. Dus, de productie van een transgene model in een bepaalde stam voor welke pronuclei zijn onzichtbaar de productie van dieren in een tolerante stam gevolgd door ten minste 10 opeenvolgende backcrosses vereist overdracht van de transgenic in de gewenste muis stam. Met de lentivirale vector injecties, perivitelline ruimte is altijd zichtbaar en de injectie niet vereist zeer specifieke vaardigheden. Als voorbeeld, zijn knik/SCID transgene muizen die niet geschikt voor pronuclei injectie zijn verkregen met de virale vector injecties14.

Hier is een uitgebreide protocol gepresenteerd zodat eenvoudige productie van transgene muizen met behulp van lentivirale vector injecties in de ruimte van de perivitelline van een embryo van de fase één cel. Transgenic expressie gecontroleerd met een alomtegenwoordige of cel specifieke initiatiefnemers wordt in detail beschreven.

De ΔU3 van de lentivirale backbone van pTrip werd gebruikt in deze studie15. Deze vector kan voor het produceren van replicatie defecte lentivirale vectoren waarin de volgorde van de U3 is gedeeltelijk verwijderd om te verwijderen van de U3 promotor activiteit en het genereren van een zelf inactivating vector (SIN)16. Lentivirale vector voorraden werden geproduceerd door voorbijgaande transfectie van HEK-293T cellen met de p8.91 inkapseling plasmide (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, de codering van de vesiculaire stomatitis virus (VSV) glycoproteïne-G17, en de pTRIP-ΔU3 pHCMV-G recombinante vector. De gedetailleerde productie-procedure wordt hier geboden als aanvullende methoden.

Productie van hoge titer lentivirale vector voorraden wordt uitgevoerd onder Biosafety Level II voorwaarden (BSL-2). Dit geldt voor de meeste transgenen met uitzondering van oncogenen die moeten worden geproduceerd in BSL-3. Daarom is de productie in BSL-2 voorwaarden voor de meeste gevallen voldoende. Bovendien, zijn het gebruik en de productie meestal verbroken voor de meeste nationale regelgevende instanties die zich bezighouden met genetisch gemodificeerde organismen (GGO's). Beperkte hoeveelheid replicatie incompetent SIN lentivirale vectoren (onder 2 µg p24 Eiwitmantel eiwit) kunnen worden gebruikt onder BSL-1 voorwaarden zoals beschreven door de Franse GGO-Agentschap in overeenstemming met de aanbevelingen van de Europese Unie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures die onder meer dierlijke ethische goedkeuring hebt verkregen en door het Franse Ministerie van onderzoek en onderwijs onder nummer APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 en 05311.02 zijn gemachtigd. De ICM dier faciliteit PHENOPARC is geaccrediteerd door het Franse Ministerie van landbouw onder de accreditatie nummer B75 13 19. Het totale protocol vereist dat u elke procedure binnen een nauwkeurige termijn die is samengevat in uitvoert in Figuur 1.

1. dierlijke aankoop en voorbereiding van fundamentele verbindingen

  1. Dierlijke aankoop
    1. Bestel 25 vasectomized mannetjes B6CBAF1/JRj, die 8 weken oud zijn (F1 generatie van origineel kruist tussen ♀C57Bl/6JRj en ♂CBA/JRj).
      Opmerking: Isoleren mannetjes bij aankomst. Vasectomized mannen kunnen opnieuw worden gebruikt voor ten minste één jaar.
      Wijzig de kooien elke 3 weken.
    2. Bestel 50 B6CBAF1/JRj vrouwtjes die 10 weken oud zijn en houden van een pool van ten minste 50 dieren.
    3. Bestel 10-15 C57BL/6JRj vruchtbare mannetjes die 8 weken oud zijn.
    4. Bestel 30 C57BL/6JRj vrouwen die 4 weken oud zijn.
  2. Narcose en euthanasie
    1. Anesthesie wordt uitgevoerd met behulp van een volume van 300μL ketamine/xylazine mix, geïnjecteerd intraperitoneally (ketamine bij een dosis van 150μg/g lichaamsgewicht, xylazine bij een dosis van 0.15μg / g lichaamsgewicht). Dieren worden geplaatst onder de verwarming pad om aan te passen van de lichaamstemperatuur. Controleer reflexen door het knijpen van de staart van het dier vóór aanvang van de procedure.
    2. Euthanasie werd uitgevoerd door cervicale dislocatie. Onthoofding werd opgenomen als een secundaire methode voor het bevestigen van de dood van het dier. Euthanasie van embryo's werd uitgevoerd door onthoofding.
      Opmerking: Bij aankomst, toestaan dat dieren een minimum van 1 week tot koeien naar de faciliteit (geen behandeling of paring). Nog belangrijker is, kunnen elke muis stammen, met inbegrip van transgene lijnen worden gebruikt als vruchtbare mannetjes en vruchtbare vrouwtjes voor superovulatie. De keuze van stam moet worden gemaakt overeenkomstig de voorschriften van de wetenschappelijke vraag.
  3. Hormoon voorbereiding
    1. Voeg 910 µL van PSMG (zwangere Mare Serum gonadotrofinen) buffer in 1 gelyofiliseerd PMSG flesje, Breng 100 µL aliquots en opslaan bij-20 ° C.
      Opmerking: Elk aliquot bevat 55 UI voor 11 muizen. Nooit houd PMSG aliquots voor meer dan 2 weken na het eerste gebruik.
    2. 2730 µL van hCG (humaan choriongonadotrofine) buffer in 1 gelyofiliseerd hCG flacon toevoegen Breng 100 µL aliquots en opslaan bij-20 ° C.
      Opmerking: Elk aliquot bevat 55 UI voor 11 muizen.
  4. Hyaluronidase voorbereiding
    1. 1 flacon van hyaluronidase met 3 mL M2 Medium 50 µL aliquots te verkrijgen van een 10 mg/mL stockoplossing reconstrueren. Sla bij-20 ° C.
  5. Chirurgie extra voorbereiding
    1. Alle chirurgie hulpmiddelen met behulp van de autoclaaf steriliseren.

2. superovulatie van vrouwelijke donoren

  1. In een dier faciliteit met behulp van de 12 h dag - nacht cyclus, injecteren PMSG om 14u op dag -3. Injecteren hCG op 12u op dag -1 en stuurman met vruchtbare mannetjes net na de hCG-inspuiting.
  2. Op dag -3, voeg 1 mL steriele 0.9% NaCl-oplossing in 1 hoeveelheid 100 µL PMSG (55 UI). 10 C57BL/6JRj vrouwtjes injecteren met 100 µL intraperitoneally met behulp van een injectiespuit zonder een dode volume.
    Opmerking: Elke muis ontvangt 5 UI van PMSG.
  3. Op dag -1, voeg 1 mL steriele 0.9% NaCl-oplossing in 1 hoeveelheid 100 µL van hCG (55 UI). Injecteer de muizen die de injectie van de PMSG met 100 µL van verdunde hCG oplossing (5UI) intraperitoneally ontvangen. Gebruik een injectiespuit zonder een dode volume. De injectie traag en wachten voordat het verwijderen van de naald, zodat de vloeistof doet niet lekken.
    Opmerking: Elke muis ontvangt 5 UI van hCG. Injectie met hCG moet 46 h na PMSG worden uitgevoerd.
  4. Plaats elke C57BL/6JRj vrouw in de kooi van de stoeterij man direct na de hCG-inspuiting.
  5. Controleren van vaginale stekkers op de ochtend van dag 0 en met de positieve vrouwtjes verzamelen bevruchte eieren.

3. voorbereiding van de B6CBAF1/jRj Pseudopregnant vrouwtjes

  1. Partner van een vasectomized man eergisteren eicelpunctie (dag -1) met 2 B6CBAF1/JRj vrouwtjes om 5 PM.
    Opmerking: Het is zeer belangrijk te paren met de vrouwtjes die van oorsprong zijn uit verschillende kooien om te voorkomen dat de synchronisatie van de vrouwelijke cyclus. Dit zal het verhogen van het rendement van het verkrijgen van vaginale stekkers. Daarnaast Voeg geen een vrouw aan een mannelijke kooi die is veranderd in de afgelopen 2 dagen. Werkzaamheid van reproductieve gedrag in het mannetje wordt verhoogd wanneer de kooi vuil is.

4. bevruchte eieren collectie

  1. Voorbereiding
    1. 1450 µL van M2 aan hyaluronidase stamoplossing te bereiden de werkoplossing hyaluronidase toevoegen.
    2. Breng een druppel van 100 µL van de werkoplossing hyaluronidase per vrouw gebruikt voor het produceren van bevruchte eieren in een petrischaal van 100 mm en houden bij kamertemperatuur.
    3. Voeg 500 µL van M16 in 4 wells-platen. Gebruik 2 putten per soort lentivirale vectoren die zal worden geïnjecteerd: een goed zal bevatten de ingespoten eieren en de andere degenen niet-ingespoten. Plaats de 4 platen goed in de incubator bij 37 ° C met een 5% CO2 -sfeer.
  2. Pipetten voorbereiden van verzameling en behandeling van embryo's.
    1. De glazen hematocriet haarvaten (75 mm/60 µL) verzachten door het draaien van het midden van de capillaire buis van hard glas in de vlam.
    2. Haal de haarvaten van het vuur zo spoedig mogelijk en trek aan het verkrijgen van een buis met een inwendige diameter van ongeveer 300 µm. Pull op de afgekoelde buis te verkrijgen van een nette breuk.
  3. Verzamelen oviducts.
    1. C57BL/6JRj vrouwtjes euthanaseren door cervicale dislocatie om 9u op dag 0. Dood wordt bevestigd door onthoofding.
      Opmerking: Deze methode euthanasie werd goedgekeurd door de IACUC en Europese aanbevelingen volgt.
    2. Het uitvoeren van een grote horizontale snede om te openen de buikholte met een schaar. Het oviduct is gelegen tussen de baarmoeder en de eierstokken.
    3. Verwijder de mesometrium en het membraan met prominente bloedvaten met gebogen pincet.
    4. Scheid de oviduct uit de eierstok met gebogen pincet.
    5. Gebruik gebogen pincet als een gids te snijden het oviduct uit de eierstok met gebogen schaar.
    6. Trek het oviduct en gesneden uit de baarmoeder met gebogen schaar.
      Let op: Raak niet de gezwollen Papil waarin de bevruchte eieren. De hele procedure met behulp van steriele instrumenten uitvoeren.
    7. Plaats alle verzamelde oviducts in de M2 medium (35 mm cultuur schotel) bij kamertemperatuur
    8. Plaats 2 oviducts in de dezelfde 100 µL druppel hyaluronidase werkoplossing (0,3 mg/mL).
  4. Cumulus cellen verwijderen uit bevruchte eieren.
    1. Gebruik onder een stereomicroscoop, 2 insuline spuiten: de eerste te houden het oviduct en de tweede verscheuren de ampul te dispergeren bevruchte eieren in de werkoplossing hyaluronidase.
    2. Neem de bereid glazen pipet voor het verzamelen van de eieren en het verbinden van de buis en een 0,22 μm filter gemonteerd op het mondstuk aan alle eieren gecombineerd. Verzamel alle eieren en was ze door opeenvolgende passage in 6 verschillende druppels 100 µL van M2 medium.
    3. Gewassen bevruchte eieren in bevochtigde 37 ° C incubator met een sfeer van 5% CO2 in M16 medium te plaatsen.

5. het maken van injectie Pipettes

  1. Gebruik van dunwandige glazen capillaire buis (10-15 cm lang) met een buitendiameter van 1 mm en klem deze capillair in horizontale micropipet trekker.
    Opmerking: In meest horizontale Pipetteer trekkers, 3 parameters kunnen worden aangepast: warmte kracht, sterkte en tijd vertraging tussen verwarming en trekken te trekken. Deze parameters worden gebruikt voor het verkrijgen van injecterende pipets strekking degene gepresenteerd in figuur 2Aaanpassen. Voor gebruikers die routinematig van DNA microinjection uitvoeren, gebruik van de standaard instellingen en aanpassen van de vertraging tussen verwarming en trekken om de globale vorm van het uiteinde van de Pipet wijzigen.

6. ervoor zorgen dat bedrijf Pipettes

  1. Gebruik een injecterende Pipetteer ter voorbereiding van de Pipet van het bedrijf.
  2. Een intraveneuze Pipetteer hechten aan een microforge. Snijd de pipet met de microforge te verkrijgen van een scherpe symmetrische tip met diameter van 80 tot 100 µm. Pools dan de tip met de warmte op de microforge te verkrijgen van een symmetrische ronde vorm zonder scherpe heggen.

7. voorbereiding van de injectie Pipetteer met de lentivirale Vector

  1. Centrifugeer het lentivirale vector schorsing bij 160 x g gedurende 2 min naar de pellet puin vaak aanwezig in bevroren lentivirale voorraden.
  2. Herstellen van het supernatant en breng dit in een nieuwe 0,5 mL-buis in een klasse II veiligheidskast.
  3. 1 µL van supernatans overbrengen in een injectie Pipetteer voorbereid zoals beschreven in stap 5 met behulp van een Micro-loader.
  4. De injectie pipet aangezet door de houder van het instrument van het juiste micromanipulator. Het bedrijf Pipetteer sluit aan op de linker micromanipulator.
    Opmerking: De titer van de transductie van het lentivirale vector zal rechtstreeks worden gecorreleerd aan de werkzaamheid van oprichter productie. Voor hoge doeltreffendheid (> 70%), gebruik van virale vectoren met een titer in het bereik van 100 ng van p24 Eiwitmantel eiwit/µL. Wanneer de titer wordt uitgedrukt in eenheden van de transductie (TU), de titer moet boven 109 TU/mL. Lentivirale vector voorraden moeten worden vervaardigd via voorbijgaande transfectie van 293T cellen met de plasmide van p8.91 encapsidation, pHCMV-G, codering van de vesiculaire stomatitis virus (VSV) glycoproteïne-G, zoals beschreven in aanvullende methoden18.

8. micro-injectie

  1. Afzien van 8 µL van M2 medium in het midden van een depressie dia en dek met lichte Paraffineolie (embryo getest) om te voorkomen dat de verdamping.
  2. Plaats 20 eieren in de daling als minst verspreide mogelijk.
    Let op: Maak geen bubbels bij de neerlegging van de embryo's.
  3. Zorg ervoor dat het uiteinde van de pipet injectie geopend is. Als dat niet het geval is, tikt u op de injectie Pipetteer met de Pipet van het bedrijf.
  4. De microinjector instellen voor een injectie tijd van 20 s.
    Opmerking: De viscositeit van de virale opschorting maakt het mogelijk duidelijke visualisatie van de spreiding van de virale vector in de perivitelline ruimte. De druk van de injectie moet worden aangepast om in te vullen de hele ruimte binnen 20 s van injectie, waarmee een volume van 10 tot 100 pL. Injectie druk mag niet meer dan 600 hPa.
  5. Gecombineerd een bevruchte eicel met 2 pro kernen en 2 poollichaampjes met de pipet bedrijf onder de stereomicroscoop.
  6. Injecteer het ei met de microinjector met behulp van de instellingen die worden beschreven in 8.4, in de perivitelline ruimte.
    Let op: Het plasmamembraan met injectie Pipetteer niet aanraken.
  7. Injecteren van alle bevruchte eieren beschikbaar in batches van de 20 eieren en plaats de ingespoten eieren direct in voorverwarmde M16 medium in de incubator bevochtigde 37 ° C met een sfeer van 5% CO2.
    Opmerking: Incubeer de ingespoten eieren voor een minimum van 30 min na injectie voordat overplanting.

9. overdracht van embryo's in B6CBAF1/JRj Pseudopregnant vrouwtjes

  1. Controleer de copulatie plug 16 h na de paring B6CBAF1/JRj vrouwtjes met B6CBAF1/JRj vasectomie mannetjes. Doe dit net voordat de eicelpunctie.
  2. Implantatie pipetten voorbereiden op het ingespoten embryo.
    1. Maken van implantatie pipetten voor embryo's zoals beschreven voor het verzamelen en verwerken van embryo's (stap 4.2). Selecteer pipetten met een inwendige diameter van ongeveer 150 µm met een smalle deel ongeveer 4-5 cm in lengte.
      Opmerking: De tip moet worden gepolijst, teneinde mogelijke schade aan de eieren of de oviduct vlam.
      1. Vul met lichte Paraffineolie (embryo getest) net boven de schouder van de pipet.
      2. Een kleine luchtbel, dan M2 medium, en tenslotte een tweede luchtbel gecombineerd.
      3. Opstellen van embryo's een achter elkaar tot een minimum beperken van het totale volume van het medium dat in het oviduct samen met de embryo's zullen worden ingespoten.
      4. Tot slot een zeer kleine druppel licht Paraffineolie (embryo getest) laden van ongeveer één embryo breedte.
        Let op: Wees zacht tijdens het verwerken van de pipet.
  3. Embryotransfer.
    1. Steriliseren van alle instrumenten.
    2. Het vrouwtje met behulp van een intraperitoneale injectie van 300 μL van steriele NaCl 0,9%-oplossing met 150 μg per g lichaamsgewicht van Ketamine en 0,15 μg per g lichaamsgewicht van Xylazine anesthetize.
    3. Controleer of de diepte van de verdoving door te knijpen van de staart van het dier met een tang en injecteren subcutaneouly 0,1 mg/kg pijnstiller (buprenorfine) vóór aanvang van de procedure.
    4. 2 cm aan beide zijden van de rug langs het ruggenmerg op het niveau van de laatste rib scheren.
    5. Plaats de vrouwelijke muis op een verwarming pad en in een steriele veld. Snijd een 2 x 2 cm-venster in het midden van de achterkant van de muis.
    6. Breng een antiseptische oplossing (10% Povidon jodide) op de huid en maken een dwarse incisie van 1 cm met een schaar, dan schuif de huid lateraal tot het ovarium (oranje kleur) zichtbaar door de muur van het lichaam is.
    7. Een incisie 5 mm in het lichaam muur net boven het ovarium maken met de fijne schaar onder een verrekijker chirurgische Microscoop.
    8. Pak het vet pad met een atraumatische bulldog klem en trek de eierstok, het oviduct en de bovenkant van de baarmoeder.
    9. Visualiseer de Papil en het maken van een hemisection met een vannas schaar op het oviduct segment die links van de eierstok naar de ampul.
    10. Introduceren van de Pipet van de embryo transfer en leveren van eieren in de ampul, stoppen bij de eerste luchtbel in de pipet implantatie.
    11. Herhaal de procedure voor de tweede oviduct.
    12. De huid close-up met wond clips.
    13. Plaats het dier in het herstel kamer (39 ° C, 30-60 min) tot volledig wakker.
    14. Herhaal pijnstillende injectie na 12 uur en 48 uur in geval van tekenen van pijn of leed.
    15. Verwijder wond clips 7-10 dagen na de operatie.
    16. Selectievakje geïmplanteerd vrouwtjes voor zwangerschap door hun gewicht curve te volgen om de 3 dagen na implantatie. Een aanzienlijke gewichtstoename 10 tot 12 dagen na implantatie kan worden waargenomen en indicatief voor zwangerschap zal worden.
      Opmerking: Alle embryo's, dat hier zal ontwikkelen zal vertegenwoordigen putatief transgene oprichters. Het fenotype van deze grondleggers kan worden geanalyseerd op eventuele ontwikkelingsstadia of na de geboorte volgens de wetenschappelijke vraag gekoppeld aan de generatie van deze transgene dieren.

10. genotypering transgene oprichters

  1. Bereiden van genotypering buffer met 10 mM Tris-HCl, pH 8; 5 mM EDTA, pH 8,0 met 0,2% SDS (w/v), 50 mM NaCl. De genotypering buffer steriliseren door een 0,22 µm filter en bewaren bij kamertemperatuur gedurende enkele maanden.
  2. Put extraembryonic membranen (voor embryo's) of kleine stukje van de staart (voor geboren dieren) in 500 µL van gefilterde van genotypering buffer en 15 µL van proteïnase K (20 mg/mL) toe te voegen. Na een nacht bebroeden bij 55 ° C.
  3. Centrifugeer het lysate bij 15.000 x g gedurende 5 minuten en gebruik vervolgens 1 µL van supernatans voor de PCR-reactie. Lysate kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor enkele maanden.
  4. De PCR-amplificatie van een fragment van de transgenic in een 20 µL reactie volume met 1 x PCR buffer, 1.5 mM MgCl2, 200 µM van dNTPs, 0,2 µM elke PCR inleidingen, 1 UI van polymerase van DNA Taq en 1 µL van elk verteerd monster uitvoeren. Als een negatieve controle, gebruik 1 µL van H2O. Als positieve controle, DNA van het lentivirale vector plasmide met de transgenic te gebruiken.
  5. Beschreven voor de detectie van eGFP gebruik:
    eGFP vooruit Primer: 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
    eGFP Reverse Primer: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'
  6. Uitvoeren van PCR versterking in een thermocycler: 4 min bij 94 ° C, gevolgd door 35 cycli van 1 min bij 94 ° C, 1 minuut bij 60 ° C, en 2 minuten bij 72 ° C.
  7. Het laden van het PCR-product op een 2% agarose gel om te visualiseren een 300 bp eGFP PCR product zoals geïllustreerd in figuur 2B.
    Opmerking: Alle individuen met een 300 bp PCR band hebben geïntegreerd de eGFP transgenic en kunnen worden beschouwd als transgenics.
  8. Transgenic expressie in transgene dieren analyseren. Bijvoorbeeld uitvoeren histologische en immunokleuring als geïllustreerd in Figuur 3 en 4 van de figuur en in aanvullende methoden beschreven.
    Opmerking: Beide transgenic expressie en fenotype analyse moeten worden uitgevoerd met behulp van relevante methoden volgens de mondiale wetenschappelijke vraag.

11. kwantificering van transgenic exemplaaraantal

  1. DNA-monsters voorbereiden op kwantitatieve PCR.
    1. Uittreksel genomic DNA (gDNA) van het proteïnase K lysate verkregen bij stap 10.3 met behulp van een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant.
    2. GDNA kwantificeren door spectrofotometrie op 260 nm.
    3. Verdun elk monster gDNA om een eindconcentratie van 10 ng/µL.
    4. Voor elk monster, maak 5 seriële verdunningen (1:5) in H2O te verkrijgen van 6 buizen bij de volgende concentraties: 10 ng/µL, 2 ng/µL, 0.4 ng/µL, 0.08 ng/µL, 0,016 ng/µL en 0.0032 ng/µL
  2. De kwantitatieve PCR (qPCR)-mix voor te bereiden.
    1. De primer mix voorbereiden op qPCR. Voor elk paar primer te gebruiken voor qPCR, voeg 10 µL van voorwaartse primer (100 µM primer stockoplossing), 10 µL van omgekeerde primer (100 µM) en 80 µL van H2O.
      Opmerking: Om te vullen eGFP, gebruik vooruit TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA en Reverse TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG inleidingen. Cdx2 gen wordt gebruikt als normalizer voor de qPCR (2 exemplaren per genoom). Gebruik voor Cdx2 normalizer vooruit GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG en Reverse GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT primers
    2. Bereiden van 2 qPCR mixen, één met de eGFP primer mix en één met Cdx2 primer mix. Voldoende qPCR mix te versterken van de 6 verdunningen in duplicaten van elke gDNA voor te bereiden. Een qPCR reactie bevat 3.8 µL van H2O, 5 µL van fluorescente groene 2 x reactie mix en 0.2 µL van primer mix.
      Opmerking: Voor elk transgene dier om te testen, 24 qPCR reacties zal worden uitgevoerd. De mix is voorzien van een 384 goed qPCR machine.
    3. Voor elk dier om te testen, distribueren: 12 putjes met 9 µL van eGFP qPCR mix en 12 putjes met 9 µL van Cdx2 qPCR mix. Voeg 1 µL van elke verdunning gDNA aan 2 putjes met de eGFP qPCR mix en 2 putten met de qPCR van eGFP meng.
    4. Laat 2 putten voor elke qPCR mengen in welke gDNA werd vervangen door H2O als negatieve controle.
  3. Plaats de 384 goed plaat in de qPCR-machine en de volgende lopende protocol toepassen: 10 min bij 95 ° C dan 50 cycli van 10 s bij 95 ° C en 1 minuut bij 60 ° C.
  4. Gegevens analyseren. Voor elke gDNA om te testen, de Ct-waarden worden uitgezet als functie van het logboek van totale gDNA bedrag (6 punten in duplicaten). Past de curve met behulp van lineaire regressie met de minste vierkante methode en het extrapoleren van de Ct-waarde die overeenkomt met het snijpunt met de y-as. Gebruik de geëxtrapoleerde Ct-waarden voor eGFP en de genormaliseerde Cdx2 voor het berekenen van het exemplaaraantal eGFP ten opzichte van de Cdx2 (2 exemplaren) met behulp van de methode standaard 2ΔdCt 11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Transgene dieren werden gegenereerd met behulp van het protocol hier gepresenteerd. Vertegenwoordiger resultaten zowel alomtegenwoordige en cel type specifieke transgenic expressie worden geïllustreerd.

Constitutieve uitdrukking van transgenen

Alomtegenwoordige initiatiefnemers zijn fundamenteel onderzoekstools wil transgenen in een duurzame en efficië...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De perivitelline injectie van lentivirale vectoren in bevruchte eicellen hier beschreven resulteerde in de productie van transgene embryo's die meer dan 70% van transgene embryo's ten opzichte van het totaal aantal verzamelde embryo's opgeleverd. Dit resultaat is in overeenstemming met eerdere verslagen en is een voorbeeld van het specifieke karakter van de procedure2,7,10,11,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen conflict van belang om te vermelden.

Dankbetuigingen

Wij danken Magali Dumont en Rolando Meloni voor kritische lezing van het manuscript, de iVector en een Phenoparc ICM Cores voor technische bijstand in lentivirale vector productie en dierlijke respectievelijk huisvesting. Dit werk werd gesteund door het Institut Hospitalo-Universitaire de Neurosciences Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. ontvangen financiering voor de vereniging de Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) en een gezamenlijke JDRF / INSERM verlenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PMSG 50UISigmaG4527
hCG 5000UISigmaCG5-1VL
NaClSigma7982
100 mm petrischaalDutsher353003
4 wells Nunc schaalDutsher56469IVF schaal
M2 mediumSigmaM7167
M16 mediumSigmaM7292
0,22 µm SpuitfilterDutsher146611
Hyaluronidase enzym 30mgSigmaH4272getest op muis embryo
Insulin spuitVWR613-3867Terumo Myjector
Gebogen pincetMoria2183
Gebogen schaarMoriaMC26
Aspiratiebuisassemblages voor gekalibreerd microcapillair pijpjesSigmaA5177-5EA
Borosilicaat glas capillairenHarvard apparatusGC 100-10
Horizontaal micropipet pullerNarishigePN-30
MicroforgeNarishigeMF-900
Omgekeerd microscoopNikonTransferman NK2 5188Hoffman modulatie contrast verlichting is vereist
MicromanipulatorEppendorfCelltram air
Controller of houdende pijpEppendorfFemtojet
MineralolieSigmaM8410getest op muis embryo
MicroinjectorEppendorfFemtojetKan gebruikt worden om DNA of virale vectoren te injecteren
Dumont # 5 pincetMoriaMC 40
vannas micro schaarMoria9600
IsofluraancentravetISO005ISO-VET 100% 250ml
ocrygelcentravetOCR002
Povidon jodiumcentravetVET001vetedine 120ml
BuprenorfinecentravetBUP002Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HClSigmaT5941Trizma hydrochloride
EDTASigmaE9884
SDSSigma436143
NaClSigmaS7653poeder
proteinase KSigmaP2308 
oneTaq kitNEBM0480L
PrimersEurogentec
Reep van 8 PCR buisjes4titude4ti-0781
96 well thermische cyclerApplied Biosystems4375786Veriti
Genoom DNA mini kitinvitrogenK1820-02
Nanodrop 2000Thermo ScientificND-2000C 
qPCR Master mixRoche4887352001SYBR Green 
Multiwell plate 384Roche5217555001
qPCR instrument 384 wellRoche5015243001LightCycler 480

Referenties

  1. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  2. Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
  3. Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
  4. Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
  5. Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
  6. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  7. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  8. Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
  9. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  10. Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
  11. van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).
  12. Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741(2010).
  13. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
  14. Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
  15. Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
  16. Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
  17. Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
  18. Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
  19. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
  20. Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
  21. Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413(2010).
  22. Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
  23. Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274(2015).
  24. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  25. Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
  26. Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
  27. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  28. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
  29. Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Lentivirale transgeneseperivitelline injectiefounder dierenlentivirale vectorenmicroinjectietechniekembryo overdrachtdissectie van de eileiderM16 mediumM2 medium
Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.