Methodenartikel

Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels

DOI:

10.3791/57619

⸱

25 augustus 2018

 , 
1Department of Biology, Mount Saint Vincent University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een organotypic kweken protocol om te groeien van embryonale kip organen in vitro. Met deze methode kan de ontwikkeling van embryonale kip weefsel worden bestudeerd, met behoud van een hoge mate van controle over de omgeving van de cultuur.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De embryonale kip wordt het meestal gebruikt als een betrouwbare modelorganisme voor gewervelde ontwikkeling. De toegankelijkheid en de korte incubatie maakt periode het ideaal voor experimenten. Op dit moment is de studie van deze ontwikkelings trajecten in het embryo van de kip is olv remmers en geneesmiddelen op gelokaliseerde sites en bij lage concentraties, met behulp van een verscheidenheid van methoden toe te passen. In vitro kweken van weefsel is een techniek waarmee de studie van weefsels gescheiden van het ontvangende organisme, terwijl gelijktijdig het omzeilen van veel van de fysieke beperkingen aanwezig bij het werken met hele embryo's, zoals de gevoeligheid van de embryo 's hoge doses van potentieel dodelijke chemische stoffen. Hier presenteren we een organotypic protocol voor het kweken van de embryonale kip een half hoofd in vitro, die nieuwe mogelijkheden voor het onderzoek van ontwikkelings processen buiten de momenteel gevestigde methoden biedt te kweken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De embryonale kip (Gallus gallus) is een uitstekende modelorganisme gebruikte op het gebied van biologie. De incubatietijd is ongeveer 21 dagen en veel eicellen tegelijk kunnen worden geïncubeerd experimenten maken snel en efficiënt. Misschien belangrijkst, is het embryo ook gemakkelijk gemanipuleerd, waardoor de uitgebreide studie van belangrijke ontwikkelings processen en van de genen en eiwitten die deze processen drijven.

Het oog van de embryonale kip is een complex orgaan dat via de interactie van een aantal verschillende weefsels lijkt op veel andere lichaamssystemen ontwikkelt. Deze methode kan de studie van de ontwikkeling van deze weefsels, met name in geavanceerde stadia van ontwikkeling. Het multi-gelaagde netvlies kan bijvoorbeeld worden van bijzonder belang aan die het bestuderen van de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Alternatieve methoden waarmee de studie van andere weefsels van het oog zoals het hoornvlies, het lichaam van de vitreal, de lens, de sclera en de oogleden zijn van belang aan onderzoekers. Het kip embryonale oog bevat ook een reeks van platte botten, de scleral gehoorbeentjes, die kunnen worden gebruikt als een model voor de studie van intramembranous bot inductie en ossificatie in gewervelde dieren1.

Momenteel zijn er een aantal methoden die zijn gebruikt bij het bestuderen van de embryonale ontwikkeling. Microinjections van remmende antilichamen of andere remmende molecules2,3, chirurgisch geïmplanteerde microbeads gedrenkt in remmer4, en electroporation5 zijn alle methoden die kunnen worden gebruikt om downregulate genen of eiwitten van belang in een embryo. Soortgelijke methoden worden gebruikt om upregulate eiwitten. Deze methoden zijn niet zonder hun beperkingen. Bijvoorbeeld, wanneer het gebruik van chemische stoffen te wijzigen van de embryonale ontwikkeling, de letale effecten op het embryo moeten worden geëvalueerd, en dit beperkt het gebruik van de bovengenoemde methoden om gelokaliseerde websites van toepassing bij doses laag genoeg is om ervoor te zorgen het overlevingsvermogen van de embryo.

In vitro kweken van weefsel is gebruikt in een breed scala van organismen te bestuderen van ontwikkeling en kan worden gebruikt om sommige van de bovengenoemde beperkingen te omzeilen. Bijvoorbeeld, zijn de dijbenen6,7,8van de toppen van de veren en ledematen,9 van de kip alle bestudeerd met behulp van weefsel kweken methoden, evenals de teelballen van de muis10 en de wortels en stengels van planten11. Deze methoden geven wetenschappers een hoge mate van controle over de weefsel ontwikkeling, zoals de mogelijkheid te schommelen van de temperatuur en het veranderen van de beschikbaarheid van nutriënten. Het isolement van het weefsel van het hele embryo maakt het ook veel minder gevoelig is voor de letale effecten van chemische stoffen, waardoor manipulatie studies op wereldschaal bij hogere concentraties. Een ander opmerkelijk voordeel van in vitro kweken is de instandhouding van het weefsel van cellulaire omgeving; de rangschikking van weefsels blijft relatief ongewijzigd, waardoor het mogelijk is om te studeren van de interacties tussen de verschillende weefsel typen9. Dus, in vitro kweken opent deuren extra experimentele benaderingen niet beschikbaar in een in vivo of in ovo modellen.

Op dit moment vormt een bijzondere uitdaging voor het bestuderen van de ontwikkeling van het oog van de embryonale kip met behulp van chemische stoffen. Een aantal extraembryonic membranen betrekking hebben op het embryo, waardoor het moeilijk om toe te passen microbeads of chemische stoffen; het embryo is ook zeer actief binnen het ei als het ouder, verdere complicerende een toch al moeilijke methode. Dit protocol biedt gemakkelijk toegang tot het oog en de omliggende weefsels, opheffing van deze belemmeringen, waarbij ook nieuwe mogelijkheden te onderzoeken van de ontwikkelings processen in het oog. Dit protocol werd opgericht om te bestuderen van de inductie van de scleral gehoorbeentjes in het embryonale oog.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Voor embryo stadia, gebruik maken van de Hamburger en Hamilton12 (HH) tijdelijke tabel.

1. de embryo incubatie

  1. Incubeer bevruchte kippeneieren in een steriele, temperatuurgevoelig incubator bij 37 ° C ± 1 ° C en ~ 40% vochtigheid.
  2. Zet de eieren 1 x per dag en laten Incubeer tot HH34 (8 dagen na bevruchting).

2. voorbereiding en sterilisatie van de materialen

  1. Voor 12 embryo's autoclaaf 2 L van gedestilleerd water, 1 L van 0,85% chick saline, 12 glazen pipetten, 1 doos papier weefsel, 24 2,5 x 2,5 cm vierkantjes semi-poreuze filtreerpapier en 24 2,5 x 2,5 cm vierkantjes van staaldraad gaas met de randen gekromd naar beneden. Aan de materialen, steriliseren autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 15 minuten hen.
    Opmerking: De autoclaaf van de materialen kan worden gedaan op voorhand.
  2. De incubator met 70% ethanol steriliseren door af te vegen de kanten, de planken en de deur. Plaats 2 plastic containers met gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water binnen de incubator om vochtigheid. Prewarm de cultuur incubator tot 37 ° C ± 1 ° C en ~ 40% vochtigheid. Zorgen dat de incubator is volledig donker; Als de deur transparant is, bedek het met zilverpapier.
  3. Prewarm 100 mL voedingsbodem en 1 mL penicilline door ze te plaatsen in de incubator cultuur.
  4. Bedek de werkruimte met een papieren handdoek en steriliseren van de Bank in het spuiten met 70% ethanol. Steriliseren 2 paar pincet, schaar van de dissectie, een scheermesje en een plastic lepel met 70% ethanol op een vergelijkbare manier.
  5. Petrischalen van plek 12 steriel 100 mm en 24 steriele 35 mm petrischalen op de Bank voor gebruik. Zorg ervoor dat de gerechten blijven in een steriele zak tot gebruik.

3. de embryo voorbereiding

Opmerking: Vanaf dit moment draag een gezichtsmasker beschermende stof om verontreiniging van de culturen te vermijden. Een bacteriële of schimmel infectie zal ruïneren de cultuur en er is een risico op het snel verspreiden naar alle culturen in de incubator.

  1. Barst het ei te openen en het embryo overbrengen in een 100 mm petrischaal met zoutoplossing van 0,85% kuiken. Fase het embryo volgens de anatomische eigenschappen beschreven in de Hamburger en Hamilton enscenering van de richtsnoeren12 en bevestigen van het embryo is op HH34.
  2. Snijd de nek en vervolgens bisect het hoofd van het embryo in de schouderstreek met behulp van een gesteriliseerde scheermesje. Met behulp van steriele pincet, verwijderen de hersenen. De snavel intact laten.

4. cultuur Setup

  1. Plaats 2 van de 35 mm petrischalen binnen een 100 mm petrischaal.
  2. Plaats een stalen gaas binnen elke petrischaal 35 mm.
  3. Met behulp van Tang, 1 van de bisected koppen overbrengen naar een stuk semi-poreuze filtreerpapier van 2,5 x 2,5 cm met het oog naar boven. Het weefsel is beveiligd en niet glijden door het kantelen van het enigszins zorgen.
  4. Pincet zorgvuldig plaats met het oogweefsel en het filtreerpapier op de top van de stalen gaas in 1 van de 35 mm petrischalen, het creëren van een verhoogd podium met het oogweefsel bovenop.
  5. Herhaal stap 4.3 en 4.4 met de andere helft hoofd.
  6. Met behulp van een steriele glazen pipet, voeg zorgvuldig voedingsbodem direct in elke petrischaal 35 mm totdat zij het niveau van het koffiefilter tot. Dompel niet de halve kop in de voedingsbodem.
  7. 50 µL van 10.000 U/mL penicilline-streptomycine toevoegen aan de voedingsbodem in elke petrischaal.
  8. Vouw een stukje weefsel papier in een vierkantje en plaats deze binnen de 100 mm petrischaal. Bevochtig het met gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water.
  9. Zet de schotel van cultuur in de steriele, donkere incubator bij 37 ° C ± 1 ° C en ~ 40% vochtigheid voor tot 4 dagen.
  10. Herhaal stap 3 en 4 voor elk embryo.
    Opmerking: Het aantal embryo's nodig zal afhangen van de specifieke experiment; Hier beschrijven we het protocol voor 12 embryo's.

5. cultuur onderhoud

  1. Eenmaal per dag, herladen de plastic containers in de incubator met verse, gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water.
  2. Dagelijks controleren alle culturen voor bacteriële of schimmel infecties. Culturen die hebben gedesintegreerd of waarin het medium is veranderd van kleur zijn besmet. Gooi alle culturen die geïnfecteerd zijn.

6. fixatie

  1. Alle gerechten uit de incubator na kweken, verwijderen.
  2. Met behulp van een paar pincet, zachtjes verwijderen het oog uit het koffiefilter, verzorgen niet te scheuren van het weefsel.
  3. Corrigeer het oogweefsel in 4% paraformaldehyde in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing 's nachts bij 4 ° C of in 10% neutraal gebufferde formaline bij kamertemperatuur 's nachts.
  4. Het weefsel bij 4 ° C in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing opslaan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van deze methode, kan gaten embryonale kip worden gekweekt van dag 8 van haar ontwikkeling (HH34) in vitro voor 4 dagen. Vier dagen in ovo ontwikkeling komt overeen met HH38.

Deze kweken methode ondersteunt de ontwikkeling van veer toppen rondom het oog en op de oogleden (figuur 1B). Deze veer toppen zijn niet aanwezig in ovo op HH34 voorafgaand aan het kweken (...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt gebruik van gevestigde weefsel kweken van technieken om de groei van een oog van de kip van embryonale dag 8 (HH34) in vitro voor 4 dagen. Dit raster-kweken-methode werd oorspronkelijk beschreven door Trowell15. We een protocol van Pinto en Hall's 1991 studie16 met behulp van een semi-poreuze membraan met het raster om te studeren inductieve signalen tussen de lagen van de gescheiden weefsel van de embryonale kip oog15geop...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedank Gregory Haller (Mount Saint Vincent University) voor zijn voorbereidend werk in de ontwikkeling van het protocol. De auteurs ook bedank Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) voor zijn technische expertise en hulp bij het filmen en produceren van het audio/visuele deel van het manuscript. Daniel Andrews werd gesteund door de financiering van MSVU en de natuurlijke Sciences and Engineering Research Raad van Canada (NSERC) via een Undergraduate Student Research Award. Tamara A. Franz-Odendaal wordt gesteund door een subsidie voor de ontdekking van NSERC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
35 mm celkweek petrischalenCorning353001easy grip tissue culture dish, polystyreen, niet-pyrogeen
100 mm celkweek petrischalenCorning353003weefselkweekschaal, polystyreen, niet-pyrogeen
papieren tissuesKimtech34155Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per doos
gaasn/an/aroestvrijstalen gaas (rastermaat 0,7 mm)
wegwerp glas pipettenVWR14673-010Borosilicaatglas wegwerp 5 3/4"
voedingsmediumGibco12591-038Fitton-Jackson-modificatie, [+] L-glutamine met fenolrood (BGJB)
penicilline-streptomycineSigma-AldrichP445810000 eenheden/mL penicilline-streptomycineoplossing gestabiliseerd
filterpapierWhatman1454 090semi-poreus filterpapier 90mm
bevruchte kippeneierenDalhousie University Agricultural Collegen/ate verkrijgen bij lokale boerderijen
natriumchloride (NaCl)EMDSX0420-3natriumchloridekristallen, reagentiakwaliteit
1 L glazen flesVWR89000-2401 L pyrex autoclaveerbare glazen fles
ethanolFisher ScientificBP8201170% moleculaire biologie kwaliteit
Tupperware-containersn/an/ain de winkel gekocht en gesteriliseerd met EtOH
wegwerp scheermesjesVWR55411-050industrieel scheermesje met één zijde (chirurgisch koolstofstaal)
plastic lepelsn/an/ain de winkel gekocht en gesteriliseerd met EtOH
stofmasker3Mn/a3M 8500 Comfort Mask
paraformaldehydeSigma-AldrichP6148paraformaldehyde, reagentiakwaliteit, kristallijn
neutraal gebufferde formalineFisher Scientific7221010% neutraal gebufferde formaline
fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)n/an/a10X fosfaatgebufferde zoutoplossing pH 7,4 (137mM NaCl, 2,5mM KCl, 4,3mM Na2HPO4, 1,4mM KH2PO4)
15 ml falconbuisjesVWR21008-216voorgesteriliseerde centrifugebuizen
tangFSTn/afijne tang
kippenzoutwatern/an/a0,85% NaCl
aluminiumfolien/an/ain de winkel gekocht
papieren handdoekn/an/ain de winkel gekocht

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
  2. Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
  3. Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
  4. Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943(2015).
  5. Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498(2015).
  6. Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
  7. Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
  8. McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
  9. Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
  10. Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171(2015).
  11. Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
  12. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  13. Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
  14. Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
  15. Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
  16. Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
  17. Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
  18. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306(2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Weefselkweekhalve kopin vitrosterilisatieproceduregaasroosterfilterpapiervoedingsmediumpenicilline streptomycine

Gerelateerde artikelen