Methodenartikel

Eencellige Multiplex omgekeerde transcriptie Polymerase-kettingreactie na Patch-clamp

DOI:

10.3791/57627

⸱

20 juni 2018

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de kritische stappen en voorzorgsmaatregelen moeten uitvoeren van eencellige multiplex omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie na patch-clamp. Deze techniek is een eenvoudige en effectieve methode voor het analyseren van het profiel van de expressie van een vooraf vastgesteld samenstel van genen van een enkele cel gekenmerkt door patch-clamp recordings.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De cerebrale cortex bestaat uit vele celtypes verschillende morfologische, fysiologische en moleculaire kenmerken vertonen. Deze diversiteit belemmert gemakkelijke identificatie en karakterisering van deze soorten cellen, vereisten voor het bestuderen van hun specifieke taken. Dit artikel beschrijft het multiplex eencellige omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) protocol, waardoor, na patch-clamp opnemen in plakjes, de expressie van tientallen genen in één cel tegelijk te detecteren. Deze eenvoudige methode kan worden geïmplementeerd met morfologische karakterisering en is breed inzetbaar voor het bepalen van de fenotypische kenmerken van verschillende celtypes en hun bijzondere cellulaire omgeving, zoals in de nabijheid van bloedvaten. Het principe van dit protocol is graag een cel met de patch-clamp techniek, oogst en reverse transcriberen cytoplasmatische inhoudelijk en kwalitatief detecteren de uitdrukking van een vooraf gedefinieerde set genen door multiplex PCR. Het vereist een zorgvuldige ontwerp van PCR inleidingen en intracellulaire patch-clamp oplossing compatibel met RT-PCR. Om ervoor te zorgen een selectieve en betrouwbare transcript vereist detectie, deze techniek ook adequate controle van het cytoplasma oogsten naar versterking stappen. Hoewel voorzorgsmaatregelen hier besproken moeten strikt worden gevolgd, kan vrijwel elke elektrofysiologische laboratorium de multiplex eencellige RT-PCR-techniek gebruiken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De cerebrale cortex bestaat uit vele celtypes die betrokken zijn bij verschillende fysiologische processen. Hun identificatie en karakterisering, een voorwaarde is voor het begrip van hun specifieke functies, kunnen zeer uitdagend gelet op de grote morfologische, fysiologische en moleculaire diversiteit die kenmerkend corticale cel typen1 ,2,3,4.

Eencellige multiplex RT-PCR is gebaseerd op de combinatie van patch-clamp en RT-PCR technieken. Het kan tegelijkertijd de expressie van meer dan 30 vooraf gedefinieerde genen in electrophysiologically geïdentificeerde cellen5sonde. De opname van een neuronale tracer in de opname pipet verder kan de morfologische karakterisering van de opgenomen cellen na histochemische openbaring6,7,8,9, 10. het is een zeer nuttige techniek voor de indeling van neuronale typen op basis van multivariate analyse van hun fenotypische eigenschappen5,9,10,11,12 ,13,14. Eencellige multiplex RT-PCR is ook geschikt voor de karakterisatie van de non-neuronale cellen zoals astrocyten15,16,17, en vrijwel kan worden toegepast op elke hersenen structuur18, 19,20,21,22,23 en cel type, ervan uitgaande dat ze kunnen worden opgenomen in de configuratie van de gehele-cel.

Deze techniek is erg handig voor de identificatie van de cellulaire bronnen en/of doelstellingen van transmissie systemen7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, vooral wanneer specifieke antilichamen ontbreken. Het steunt op patch-clamp opnames van visueel geïdentificeerde cellen29, en dus maakt het ook mogelijk de doelgerichtheid van cellen in een specifieke cellulaire omgeving8,15,16. Aangezien de cytoarchitecture van hersenweefsel bewaard in de hersenen segmenten gebleven is, maakt deze aanpak ook bovendien studie van de anatomische relaties van de gekarakteriseerd cellen met neuronale en non-neuronale elements7,8 , 18.

Omdat deze techniek beperkt door de hoeveelheid geoogste cytoplasma en de efficiëntie van de RT is, kan de detectie van mRNA uitgedrukt op lage exemplaaraantal moeilijk zijn. Hoewel andere benaderingen gebaseerd op RNaseq technologie toestaan om te analyseren de hele transcriptome van afzonderlijke cellen3,4,30,31, ze nodig hebben high-throughput dure sequencers niet noodzakelijkerwijs beschikbaar voor elk laboratorium. Aangezien de eencellige multiplex RT-PCR techniek eindpunt PCR gebruikt, vereist het alleen verkrijgbaar thermocyclers. Het kan gemakkelijk worden ontwikkeld in laboratoria die toegerust zijn met elektrofysiologische set-ups en vereist geen dure apparatuur. Het kan bieden, binnen een dag, een kwalitatieve analyse van de uitdrukking van een vooraf gedefinieerde set genen. Dus, deze aanpak biedt een gemakkelijke toegang tot de moleculaire karakterisering van afzonderlijke cellen op een snelle manier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures waarbij dieren werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Franse regelgeving (Code Rural R214/87 naar R214/130) en gelijkvormig aan de ethische richtlijnen van de Europese Economische Gemeenschap (86/609/EEG) én de Franse nationale Handvest over de ethiek van dierproeven. Alle protocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie van Charles Darwin en voorgelegd aan het Franse Ministerie van onderwijs en onderzoek (goedkeuring 2015 061011367540). De IBPS dier faciliteit is geaccrediteerd door de Franse autoriteiten (A75-05-24).

1. voorlopige overwegingen

Opmerking: Om te voorkomen dat verontreinigingen, voldoen aan de volgende aanbevelingen vóór onderneming eencellige RT-PCR na patch-clamp.

  1. Gebruik geen plasmiden waarop genen van belang in het laboratorium als ze een potentiële bron van besmetting.
  2. Reserveren van een lab-Bank uit de buurt van de kamer van de Elektroforese van het gel te bereiden PCRs.
  3. Een set van pipetten en resistente aërosol filter tips voor het manipuleren van DNA en RNA bij concentraties lager dan 1 ng/µL wijden. Gebruik nooit deze te analyseren van PCR producten.
  4. Gebruik RNase - en DNase-vrije producten altijd op en draag handschoenen.
  5. Gebruik speciale chemische stoffen voor het opstellen van interne patch-clamp oplossingen. Gebruik nooit een spatel maar eerder met een gewicht van papier om wegen van poeders.
  6. Gebruik een speciale pH elektrode en pH-standaardoplossingen, als ze kunnen een bron van verontreiniging (b.v., RNase).
  7. Winkel borosilicaatglas haarvaten; 20 µL lang, fijn en flexibel tips; een 20 µL micropipet; een zelfgemaakte lijnzaadkoek (patch-clamp Pipetteer houder gekoppeld aan een 10 mL spuit); 500 µL PCR buizen; 10 µL aërosol resistente filter tips; en dun permanente markeringen in een speciale doos (Figuur 1).

2. primer Design

Opmerking: Multiplex RT-PCR berust op twee stappen van de versterking. Tijdens de eerste PCR, zijn alle van de genen van belang mede versterkt door mengen samen alle PCR inleidingen. U wilt opsporen betrouwbaar afschriften van afzonderlijke cellen, is het essentieel om efficiënte en selectieve PCR inleidingen ontwerpen. Het gebruik van genestelde inleidingen van de (interne) voor de tweede ronde van PCR verbetert zowel de specificiteit en de efficiency van de versterking.

  1. Ophalen van de curator mRNA opeenvolgingen van de genen van belang in de NCBI reeks referentiedatabank32 , alsmede die van verwante familieleden (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. Typ de naam van de gene(s) en de soorten van belang als een query en klik op de opgehaalde relevante volgorde.
    2. Ter beperking van de analyse in de codering reeks van de gene(s), klik op verzenden (rechter bovenhoek) en selecteer codering sequenties en FASTA Nucleotide als formaat. Vervolgens klikt u op Bestand maken en opslaan van de volgorde van de FASTA met extensie ".nt".
  2. MACAW software33 (meerdere uitlijning bouw & analyse Workbench) of andere meerdere uitlijning software gebruiken om te bepalen van de regio's van de homologie.
    1. Klik op bestand | Nieuw Project... en selecteer DNA als het type van de reeks. Als u wilt importeren het gensequenties, selecteer volgorde | Importeren van reeks... en een ".nt"-bestand laden. Herhaal de procedure voor alle verwante sequenties.
    2. Klik en sleep alle sequenties in de schematische venster te selecteren van de hele sequenties.
    3. Zoeken van de regio's van de homologie door te selecteren uitlijning | Zoek blokken... (CTRL + S). Selecteer Segment paar overlappen in Zoekmethode. Passen de Pairwise score cutoff op een relatief hoge waarde (bijvoorbeeld1.000) en de Min. seqs. per blok aan het totaal aantal sequenties uitlijnen en klik op starten.
    4. In het opkomende venster Zoekresultaat , selecteer de resultaten met de hoogste MP-score en klik op de Link. Als er geen resultaat is gevonden, verminderen de Pairwise score cutoff en/of de Min. seqs. per blok.
    5. Om te vergemakkelijken de visualisatie van homologe gebieden, selecteer uitlijning | Arcering | Score betekent.
    6. Selecteer niet-gekoppelde onderdelen van de sequenties en herhaalt u de stappen 2.2.3–2.2.4 om te kunnen bepalen andere regio's van de homologie met een lagere MP-score.
    7. Voor het verkrijgen van de meest specifieke primers, selecteer de regio's met de minste reeks homologie.
  3. Halen van de sequenties van alle splice varianten en herhaalt u stappen 2.2.1–2.2.6. Selecteer hun gemeenschappelijke gebieden voor een algemene detectie. Overweeg alternatieve cassettes voor speciale splice varianten analyses20,34,35,,36.
  4. Hiermee lijnt u de mRNA opeenvolgingen in het genoom van de diermodel BLAST37 genoom (Basic Local Alignment Search Tool) gebruiken om te bepalen van de intron-exon-structuur van de genen (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. Het genoom van de muis BLAST selecteren door te klikken op de muis en het uploaden van de volgorde van de opgehaalde FASTA in de sectie van de Query-reeks invoeren . In de Programma selectie, selecteer optimaliseren voor zeer soortgelijk sequenties (megablast)en klik op de knop BLAST .
    2. Selecteer in de sectie beschrijvingen de uitlijning met de hoogste identiteit (tot 100%). Zorg ervoor dat het overeenkomt met het gen van belang zoals aangegeven in Eigenschappen van de sectie uitlijning .
    3. De uitlijning door Query beginpositie in dezelfde sectie te verkrijgen van de exons opeenvolging van de codering volgorde sorteren. Opmerking de begin- en eindposities van alle hits die ruwweg met de positie van de introns op de query-reeks (figuur 2A corresponderen).
  5. Selecteer twee verschillende exons voor de betekenis en antisense inleidingen te onderscheiden gemakkelijk cDNA van versterking van de genomic DNA (gDNA) op basis van een groottecriterium (Figuur 2).
    Opmerking: De amplificatie van gDNA kan optreden bij een lage frequentie wanneer de kern wordt geoogst met het cytoplasma. Het is dus essentieel voor het ontwerpen van intron overspanning primerparen (figuur 2A). In het geval van intron-minder genen is de collectie van de kern problematisch aangezien het tot potentieel verstorende resultaten kan leiden. Om dit probleem te verhelpen, omvatten een reeks inleidingen gericht op het sturen van een intronic reeks sonde voor de aanwezigheid van gDNA25. Wanneer de genomic controle positief is, moeten de resultaten voor alle intron-minder genen worden verwijderd.
  6. Selecteer om een efficiënte versterking, inleidingen waarbij genereren met een lengte ideaal bestaat tussen 200 en 400 basenparen (Figuur 2).
  7. Om te vullen gelijktijdig verschillende cDNAs tijdens de multiplex PCR stap, inleidingen met een lengte tussen de 18 en 24 nucleotiden en een smelttemperatuur (Tm) ontwerpen tussen 55 en 60 ° C.
  8. Selecteer om te minimaliseren van de vorming van secondaire structuren, die de opbrengst amplificatie verminderen, verstand en anti-zin inleidingen met minimale haarspeld en dubbelzijdig lengtes (figuur 2B).
  9. Interne inleidingen met behulp van dezelfde criteria (in stappen van 2,5-2,8) te ontwerpen.
  10. Controleer of de specificiteit van de PCR inleidingen door aanpassing van de inleidingen op de referentiedatabank voor het opeenvolging van RNA van het organisme van belang met behulp van een nucleotide BLAST.
    1. In BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), klik op nucleotide BLAST. Plak de volgorde van een primer in de Query-reeks invoeren.
    2. In de sectie Kies Search Set Klik op anderen (nr etc.), selecteer referentie RNA-sequenties (refseq_rna) in de Database optie en geef het organisme (bijvoorbeeld Mus musculus (taxid:10090) ) om de analyse te beperken tot de gewenste soorten.
    3. Selecteer optimaliseren voor enigszins vergelijkbaar sequenties (blastn)in Programma selectie . In de sectie parameters van het algoritme het woord grootte tot 7 te verhogen de kans om het verkrijgen van de treffers te verkleinen.
  11. Om selectieve inleidingen ontwerpen, houden alleen die waarvan reeks heeft ten minste 3 incongruenties met ongewenste cDNAs indien mogelijk.
  12. Bestel ontzout inleidingen op een relatief hoge concentratie (b.v., 200 µM) om ervoor te zorgen dat alle externe inleidingen kunnen met elkaar vermengd worden op een eindconcentratie van 1 µM.

3. voorbereiding van de RT reagentia

  1. 5 x RT-mix: bereiden in RNase-gratis water 400 µL van de werkoplossing RT mix (5 x) met willekeurige primers op 25 µM en dNTPs bij elke 2.5 mM. Deze mix van werken als 20 µL aliquots in 500 µL buizen worden opgeslagen.
  2. 20 x Dithiothreitol (DTT): 1 mL 0,2 M DTT in RNase-vrij water bereiden en op te slaan als 50 µL aliquots.
  3. 2.500 U van RNase remmer (40 U/µL) en 10.000 U van reverse-transcriptase (RTase, 200 U/µL) opslaan als 5 µL aliquots.
  4. Om te zorgen voor een optimale kwaliteit van de RT-reagentia, slaan de aliquots bij-80 ° C. Gebruik ze voor maximaal 10 cellen en alleen voor één dag.

4. PCR validatie

  1. CDNAs voor te bereiden door het doen van een omgekeerde transcriptie van een relatief grote hoeveelheid totaal RNA (meestal 1 µg) geëxtraheerd38 uit de structuur van belang.
    1. Gebruik niet de pipetten gewijd aan single cell RT-PCR voor deze voorbereidende stappen maar gebruiken de pipetten RNase-gratis. Verdun totaal RNA naar 1 µg/µL.
    2. In een 500 µL PCR buis, voeg 1 µL van verdunde totaal RNA en 8 µL van RNase-gratis water. Denatureren bij 95 ° C gedurende 1 min en afkoelen de buis op ijs.
    3. 4 µL van RT 5 x buffer geleverd door de fabrikant, 4 µL van RT mix oplossing, 1 µL van RTase, 1 µL van RNase remmer en 1 µL van 200 mM DTT toevoegen (zie paragraaf 3).
    4. Flick van de buis, toeren, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    5. Bewaar de cDNAs bij-80 ° C gedurende maximaal enkele jaren. Bereiden een aliquoot gedeelte van het cDNAs wordt verdund tot 1 ng/µL van totale RNAs equivalenten.
  2. Mengen en verdunnen van elk paar primer op 1 µM met de pipetten gewijd aan eencellige RT-PCR. Gebruik 20 µL van elke primer mix voor 100 µL PCRs.
  3. Op het ijs, bereiden voor elk paar primer een premix met: water (q.s., 80 µL), 10 µL van 10 X buffer, 1 µL van 100 x dNTPs (50 µM elk), 500 – 1000 pg van cDNA verdund op 1 ng/µL en 0,5 µL (2.5 U, 5 U/µL) van Taq polymerase.
  4. Het gebruik van PCR-buizen die strak de putten van de PCR-machine voor een optimale temperatuurregeling passen. Voeg 2 druppels (~ 100 µL) van minerale olie aan de premix zonder aan te raken van de muur of het GLB van de PCR-buis.
  5. Een warme start uitvoeren door het plaatsen van de PCR te minimaliseren van de vorming van inleidingsdimeer buizen in de thermocycler pre-water verwarmd bij 95 ° C. Na 30 s, 20 µL van het mengsel van de primer op de top van de olie snel te verdrijven.
  6. Na 3 min bij 95 ° C, 40 cycli worden uitgevoerd (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) gevolgd door een definitieve rek stap bij 72 ° C gedurende 5 minuten.
  7. Analyseren 10 µL van elke PCR producten door agarose gel elektroforese (2%, gewicht/volume)39. Als sommige PCR producten niet de verwachte grootte, andere inleidingen hoeft (zie sectie 2) opnieuw te ontwerpen.
    Let op: Ethidiumbromide is een intercalating chemische stof die DNA mutaties kan veroorzaken. Raadpleeg de lokale veiligheid kantoor alvorens het te gebruiken. Draag altijd handschoenen wanneer het manipuleren. Gebruik een commercieel beschikbare oplossing van ethidium bromide (10 mg/mL) oplossing in plaats van poeder om te minimaliseren van het risico van inademing. Ook kan UV-licht schadelijk zijn, dus zorg ervoor dat UV bescherming veiligheidsbril of een masker dragen. Trekken bevuilde gels, tips, handschoenen en buffer in containers gewijd aan ethidium afval.
  8. Zodra alle primerparen individueel zijn gevalideerd, test het multiplex protocol (Figuur 3).
    1. Mengen en verdunnen van alle externe inleidingen samen in 1 µM. winkel de multiplex inleidingen Meng bij-20 ° C voor maximaal enkele weken.
    2. Op het ijs, bereiden een premix met: water (q.s., 80 µL), 10 µL van 10 X buffer, 1 µL van 100 x dNTPs (50 µM van elk), 500 – 1000 pg van cDNAs verdund 1 ng/µL, en 0,5 µL (2.5 U, 5 U/µL) van Taq polymerase.
    3. Flick van de PCR-buis, draai het en Voeg twee druppels (~ 100 µL) van minerale olie.
    4. Voert een warme start, zoals beschreven in stap 4.5 met 20 µL van multiplex primer mix. Na 3 min bij 95 ° C, 20 PCR cycli identiek aan die van stap 4.6 worden uitgevoerd.
    5. Bereiden een aantal PCR buizen identiek is aan het aantal genen te analyseren. Bereiden een premix zoals in stap 4.8.2, maar 1 µL van het eerste PCR product per gen als sjabloon gebruiken. Pas alle volumes volgens het aantal genen te analyseren en te overwegen om 10% van extra volume te compenseren pipetting fouten.
    6. Schud voorzichtig, draai de buis 80 µL van het voormengsel in elke buis PCR verzending en Voeg twee druppels (~ 100 µL) van minerale olie per buis zonder aan te raken van de muur of het plafond van de buizen.
    7. Uitvoeren van een warme start (zie stap 4.5) door uitzetting 20 µL van interne primer mix bereid in stap 4.2. 35 PCR cycli identiek aan stap 4.6 uitvoeren
    8. Het analyseren van de tweede PCR producten door agarose gelelektroforese. Zorg ervoor dat elke tweede PCR een amplicon van de verwachte grootte genereert. In het geval van inefficiënte of niet-specifieke amplifications, nieuwe inleidingen (in stappen van 2,5 – 2.12) opnieuw te ontwerpen en valideer hen (stappen 4.2 – 4.8).

5. voorbereiding en validatie van intracellulaire Patch-clamp oplossing

Opmerking: Het volgende protocol beschrijft de voorbereiding en validatie van een /gluconate K+gebaseerde interne oplossing, maar vrijwel elk type van patch-clamp oplossing kan worden gebruikt, zolang het geen belemmering voor de doelmatigheid van de RT-PCR vormt. Het dragen van handschoenen is verplicht om een RNase-vrije interne oplossing.

  1. Voorbereiden voor 60 mL interne patch-clamp opnameoplossing, gebruik 10 mL 0,1 M KOH.
  2. Los 11.4 mg EGTA (0.5 mM definitieve) in 0,9 mL 0,1 M KOH.
  3. Voeg 40 mL RNase-gratis water en los 2.02 g K-gluconaat (144 mM definitieve), 143 mg HEPES (10 mM laatste), en 180 µL van 1 M MgCl2 (laatste 3 mM).
  4. Breng de pH op 7,2 door toevoeging van ~ 6 mL 0,1 M KOH.
  5. Aanpassen van de osmolariteit tot 295 mOsm met ~ 13 mL RNase-gratis water.
  6. Aangezien de interne oplossing het ook als een buffer voor de omgekeerde transcriptie gebruikt wordt, zorgvuldig controleren Mg2 + concentratie. Een lagere Mg2 + concentratie in de oplossing van interne compenseren door MgCl2 daarna te bereiken van een definitieve concentratie van 2 mM in de RT-reactie toe te voegen.
  7. Toevoegen als u het label van de geoogste cel na patch-clamp opnemen, 2-5 mg/mL RNase-vrije biocytin aan de interne oplossing hierboven (stappen 5.1-5.5) beschreven.
  8. Filtreer (0,22 µm poriegrootte) de interne oplossing en opslaan bij-80 ° C als 100 – 250 µL aliquots.
  9. Voor het valideren van het gebruik van de interne oplossing voor eencellige RT-PCR, Voeg 0,5 µL van totale RNAs verdund op 1 ng/µL aan 6 µL van patch-clamp oplossing en laat het op de Bank voor ongeveer 30 min.
  10. Met een micropipet van 2 µL, voeg 2 µL van 5 x RT-mix, 0,5 µL van 20 x DDT, 0,5 µL RNase Inhibitor van de omwenteling en 0,5 µL RTase, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
  11. Draai de buis. Voeg water (q.s., 80 µL), 10 µL van 10 X buffer en 0,5 µL (2.5 U, 5 U/µL) van Taq polymerase op ijs.
  12. 40 cycli van PCR met behulp van een reeks gevalideerde inleidingen (stap 4.4 – 4.6) uit te voeren.
  13. Analyseren van de PCR producten door agarose gelelektroforese (zie stap 4.7) en controleer of dat ze de verwachte grootte hebben.
    Opmerking: De 0,5 µL van totale RNA weglaten en vervangen door 0,5 µL RNase-gratis water zal ervoor zorgen dat de interne oplossing vrij van RNA en/of DNA verontreinigingen is.

6. acute segment voorbereiding

Opmerking: Dit protocol beschrijft de segmenteringshulplijnen methode voor jeugdige (dat wil zeggenminder dan 28 postnatale dagen) mannelijke en vrouwelijke muizen. Andere oplossingen van snijden, zoals sucrose gebaseerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) zijn ook bruikbaar40.

  1. Bereiden van 2 L van aCSF met (in mM) 125 NaCl, 2,5 KCl 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO,3, 10 Glucose, en 15 Sucrose. Verklein glutamaterge activiteit tijdens de voorbereiding van het segment en bereid een snijden-oplossing door het toevoegen van 1 mM kynurenic zuur.
  2. Voordat hij snijden, stelt u een dissectie kit met chirurgische scharen, fijn iris schaar, twee spatels, pincet, een schijf van papieren filter en Cyanoacrylaat lijm.
  3. Gebruik ijskoud snijden oplossing verzadigd met O2/CO2 (95% / 5%) en koel neer het snijden kamer bij-20 ° C.
  4. Anesthetize de muis met een kleine papieren handdoek gedrenkt met Isofluraan. Na ~ 2 min, door ervoor te zorgen dat de muis onder diepe verdoving is door controle op de afwezigheid van reactie op paw snuifje.
  5. Decapitate snel de muis. Verwijderen van de hoofdhuid en de schedel te openen. Pak de hersenen zorgvuldig en plaatst u deze in een klein bekerglas gevuld met ijskoud (~ 4 ° C) snijden oplossing zuurstof met O2/CO2.
  6. Verwijder de snijden kamer van-20 ° C voorwaarden en vocht met een papieren handdoek.
  7. Zorgvuldig ontleden de hersenen te isoleren van de regio van belang, lijm deze op het snijden kamer en ijskoude snijden oplossing voor zuurstof met O2/CO2toevoegt.
  8. Snij 300 µm dikke sneden met behulp van een vibratome. Breng ze bij kamertemperatuur in een rust kamer gevuld met zuurstofrijk snijden oplossing en laten herstellen voor ten minste 0.5 uur.

7. eencellige RT-PCR na de opname van de Patch-clamp

  1. Reinigen van het systeem van de perfusie regelmatig met ~ 100 mL van 30% H2O2 oplossing en spoel uitgebreid met ~ 500 mL gedestilleerd water om te voorkomen dat bacteriën groei, want het is een over het hoofd gezien bron van RNase besmetting.
  2. Chlorine de gloeidraad met een patch pipet gevuld met geconcentreerd bleekmiddel dagelijks oogsten. Gebruik niet een micropipet te vullen de patch pipet maar eerder een 20 µL lange, fijne, flexibele tip gekoppeld aan een 1 mL spuit. Vervolgens spoel het uitgebreid met RNase gratis water en droog het met een stofdoek gas.
  3. Een kleine doos met 5 x RT-mix en 20 x DTT aliquots ijs bereiden. Bewaar de RTase en RNase remmer aliquots bij-20 ° C in een benchtop koeler.
  4. Pipetteer een segment in de zaal van de opname geperfundeerd op 1-2 mL/min met zuurstofrijk aCSF.
  5. Trek patch pipetten (1 – 2 µm open tip diameter, 3-5 MΩ) van borosilicaatglas terwijl het dragen van handschoenen en Vul één van hen met 8 μL van interne oplossing. Houd er rekening mee dat de knoppen van de trekker van de pipet een bron van verontreiniging zijn RNase zijn.
  6. Plaats de pipet in de pipet houder terwijl nieuwe handschoenen en niet aanraken van de gloeidraad met vingers.
  7. Aanpak van de patch-pipet met een positieve druk en het uitvoeren van geheel-cel opname karakteriseren de gerichte cel (Figuur 4).
  8. Om te bewaren de mRNAs, het beperken van de tijd in geheel-cel configuratie op 20 min.41.
  9. Aan het einde van de opname, bereiden een 500 µL PCR buis gevuld met 2 µL van 5 x RT Mix en 0,5 µL van 20 x DTT, draai het en sla het op ijs.
  10. Oogst het cytoplasma van de cel door toepassing van een zachte onderdruk (Figuur 4). Visueel besturingselement waarmee de inhoud van de cel binnen de pipet komt terwijl het handhaven van een goede afdichting.
    1. Vermijd zoveel mogelijk het verzamelen van de kern als sommige intron-minder genen worden geacht. In een dergelijk geval omvat altijd een reeks inleidingen gericht op het versterken van de gDNA sonde voor genomic besmetting.
    2. Als de kern dicht bij het uiteinde van de pipet komt, release de negatieve druk en verplaatst u het pipet uit de buurt van de kern. Zorgen dat de goede afdichting wordt bewaard en opnieuw opstarten om te verzamelen van het cytoplasma op de nieuwe locatie van de pipet.
  11. Stop het verzamelen wanneer geen meer materiaal komt en/of voor het verlies van de goede afdichting.
  12. Trekken de pipet zachtjes om te vormen van een buiten-out patch te beperken van verontreiniging door de extracellulaire puin (Figuur 4) en om de gunst van de sluiting van de celmembraan voor latere histochemische analyse.
  13. Houd er rekening mee dat knoppen, micromanipulators, computertoetsenbord of computermuis zijn potentiële bronnen van verontreiniging van de RNase. Als ze al aangeraakt tijdens de opname, wijzigen handschoenen.
  14. De pipet hechten aan de sojabonenkoeken en verdrijven de inhoud ervan in de PCR-buis door het toepassen van een positieve druk (Figuur 1).
  15. Het breken van het uiteinde van de pipet in de PCR-buis om te helpen de collectie van de inhoud.
  16. Kort centrifugeren van de buis, Voeg 0,5 µL van RNase remmer en 0,5 µL van RTase, meng voorzichtig, nogmaals centrifugeren en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
  17. Draai de buis en sla het op-80 ° C voor tot enkele maanden tot PCR analyse.
  18. De eerste amplificatie stap direct uitvoeren in de buis met de ~ 10 µL van RT producten door toevoeging van water (q.s., 80 µL), 10 µL van 10 x buffer en 0,5 µL (2.5 U) van Taq polymerase. Volg de instructies beschreven in stappen 4.8.2–4.8.8.

8. histochemische kleuring van de opgenomen cel (optioneel)

  1. Na het elektrofysiologische opnamen, het segment voor 20 min in zuurstofrijk aCSF om de verspreiding van biocytin in de boom axonale en dendritische te handhaven.
  2. Plaats het segment in een put van een 24-well plaat en de moeilijke situatie het overnachting bij 4 ° C met 1 mL 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer.
  3. Wassen van de segmenten 4 keer, 5 minuten elk, met 1 mL Phosphate Buffered Saline (PBS).
  4. In hetzelfde goed, permeabilize en het segment gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te verzadigen met 1 mL PBS aangevuld met 0,25% Triton X-100 en 0,2% gelatine van koud water vissen huid (PBS-GT).
  5. Na een nacht bebroeden met de een fluorescently geëtiketteerde avidin verdund 1/400 in 250-500 µL van PBS-GT.
  6. Wassen van 5 keer, 5 minuten elk, met 1 mL PBS en monteer de segmenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een representatieve validatie van multiplex RT-PCR is afgebeeld in Figuur 3. Het protocol is ontworpen om de sonde gelijktijdig de expressie van 12 verschillende genen. De vesiculaire glutamaat transporter vGluT1 werd opgevat als een positieve controle voor glutamaterge neuronen42. Het GABA synthese enzymen (GAD65 en GAD 67), Neuropeptide Y (NPY) en Somatostatine (SOM) werden gebruikt als markers van GABAergic interneuronen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single cell multiplex RT-PCR nadat patch-clamp kan gelijktijdig en betrouwbaar sonde de expressie van meer dan 30 genen in electrophysiologically geïdentificeerde cellen5. Analyse van genexpressie eencellige niveau vereist hoogefficiënte PCR inleidingen. Een van de meest beperkende maatregelen is de verzameling van de cel inhoud. Doeltreffendheid ervan is afhankelijk van de diameter van de patch Pipetteer tip, die zo groot mogelijk moet terwijl overeenkomen met de grootte van de cel. Pipetten met ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Dr. Alexandre Mourot voor zijn opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd gesteund door subsidies van het Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 en ANR-17-CE37-0010-03), BLG wordt ondersteund door de fellowship van de Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Wij danken het dier faciliteit van de IBPS (Parijs, Frankrijk).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MACAW v.2.0.5NCBIMultiple alignement voor primer design
DithiothreitolVWR443852ART
Random primersSigma-Aldrich (Merck)11034731001RT
dNTPsGE Healthcare Life Sciences28-4065-52RT en PCR
RNasin Ribonuclease InhibitorsPromegaN2511RT
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064014RT
Taq DNA PolymeraseQiagen201205PCR
Mineral OilSigma-Aldrich (Merck)M5904-5MLPCR
PCR primersSigma-Aldrich (Merck)PCR / ontzilt en verdund bij 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat capThermoFisher ScientificAB0350RT en PCR
BT10 Series - 10 µL Filter TipNeptune ScientificBT10RT en PCR
BT20 Series - 20 µL Filter TipNeptune ScientificBT20RT en PCR
BT200 Series - 200 µL Filter TipNeptune ScientificBT200RT en PCR
BT1000 Series - 1000 µL Filter TipNeptune ScientificBT1000.96RT en PCR
DNA Thermal CylcerPerkin Elmer CetusPCR
Ethidium BromideSigma-Aldrich (Merck)E1510-10MLAgarose gel elektroforese
Tris-Borate-EDTA bufferSigma-Aldrich (Merck)T4415-1LAgarose gel elektroforese
UltraPure AgaroseLife Technologies16500-500Agarose gel elektroforese
ΦX174 DNA-Hae III DigestNEB (New England BioLabs)N3026SAgarose gel elektroforese
EDA 290KodakAgarose gel elektroforese
Electrophoresis Power supply EPS 3500Pharmacia BiotechAgarose gel elektroforese
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13Sigma-Aldrich (Merck)Agarose gel elektroforese
Smooth paper with satin appearanceFisherbrand1748BPatch clamp interne oplossing
Potassium HydroxydeSigma-Aldrich (Merck)60377Patch clamp interne oplossing
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acidSigma-Aldrich (Merck)E3889Patch clamp interne oplossing
HEPESSigma-Aldrich (Merck)H4034Patch clamp interne oplossing
Potassium D-gluconateSigma-Aldrich (Merck)G4500Patch clamp interne oplossing
Magnesium chloride solutionSigma-Aldrich (Merck)M1028Patch clamp interne oplossing
5500 Vapor Pressure OsmometerWescorPatch clamp interne oplossing
BiocytinSigma-Aldrich (Merck)B4261Patch clamp interne oplossing
SucroseSigma-Aldrich (Merck)S5016Snede voorbereiding
D-(+)-Glucose monohydrateSigma-Aldrich (Merck)49159Snede voorbereiding
Sodium chlorideSigma-Aldrich (Merck)S6191Snede voorbereiding
Potassium chlorideSigma-Aldrich (Merck)60128Snede voorbereiding
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich (Merck)31437-MSnede voorbereiding
Sodium phosphate monobasicSigma-Aldrich (Merck)S5011Snede voorbereiding
Magnesium chloride solutionSigma-Aldrich (Merck)63069Snede voorbereiding
Calcium chloride solutionSigma-Aldrich (Merck)21115Snede voorbereiding
Kynurenic acidSigma-Aldrich (Merck)K3375Snede voorbereiding
IsofluranePiramal Healthcare UKSnede voorbereiding
VT 1000SLeica Biosystems14047235613Snede voorbereiding
Hydrogen peroxide solutionSigma-Aldrich (Merck)H1009Patch Clamp schoonmaak
Thin Wall Glass Capillaries with filamentWorld Precision InstrumentsTW150F-4Patch Clamp
PP-83NarishigePatch Clamp
Eppendorf MicroloaderEppendorf5242956003Patch Clamp
BX51WI Upright microscopeOlympusPatch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERASonyPatch Clamp
Axopatch 200B AmplifierMolecular DevicesPatch Clamp
Digidata 1440Molecular DevicesPatch Clamp
pCLAMP 10 software suiteMolecular DevicesPatch Clamp
10 mL syringeTerumoSS-10ESUitpersen
E Series with Straight Body (Holder)Phymep64-0997Uitpersen
Sodium phosphate dibasicSigma-Aldrich (Merck)S7907Histochemische onthulling
Sodium phosphate monobasicSigma-Aldrich (Merck)S8282Histochemische onthulling
ParaformaldehydeSigma-Aldrich (Merck)P6148Histochemische onthulling
Triton X-100Sigma-Aldrich (Merck)X100Histochemische onthulling
Gelatin from cold water fish skinSigma-Aldrich (Merck)G7041Histochemische onthulling
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugateThermoFisher ScientificS11223Histochemische onthulling
24-well plateGreiner Bio-One662160Histochemische onthulling
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13(2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Single cell RT PCRPatch clamp registratieMultiplex PCROogsten van cytoplasmaGenexpressieanalyseHot start PCRAgarosegelelektroforeseBereiding van hersensnijplatenElektrofysiologische registratie

Gerelateerde artikelen