Onderzoek naar Teliospore kieming met behulp van Microrespiration analyse en Microdissection

Samenvatting

Smut schimmels veroorzaken vele verwoestende landbouw ziekten. Zij worden verspreid als slapende teliospores die in antwoord op het milieu signalen ontkiemen. Duidelijk naar voren komt twee methoden voor het onderzoek naar moleculaire veranderingen tijdens kieming: meten van verhoging van de ademhaling voor het detecteren van metabole activering en beoordelen van moleculaire gebeurtenissen wijzigen door het isoleren van teliospores in verschillende morfologische stadia.

Samenvatting

Smut schimmels zijn de etiologische agenten van verschillende verwoestende landbouw ziekten. Ze worden gekenmerkt door de productie van teliospores, die verspreiding dikwandige agenten. Teliospores kunnen slapende blijven voor decennia. De rustperiode wordt gekenmerkt door lage stofwisseling, onderbroken macromoleculaire biosynthese en sterk verlagingen van de ademhaling. Na ontvangst vereist Milieusignalen, ontkiemen teliospores te produceren haploïde cellen, die dit leiden nieuwe rondes van infectie tot kunnen. Teliospore kiemkracht wordt gekenmerkt door de hervatting van de macromoleculaire biosynthese, verhoogde ademhaling en dramatische morfologische veranderingen. Om te precies meten veranderingen in cellulaire ademhaling tijdens de vroege stadia van kiemkracht, hebben we een eenvoudig protocol met een Clark-type respirometer ontwikkeld. De latere stadia van kiemkracht worden onderscheiden door specifieke morfologische veranderingen, maar kiemkracht asynchroon is. We ontwikkelden een techniek van de microdissection waarmee we kunnen verzamelen van teliospores in verschillende kiemkracht stadia.

Inleiding

De vuiligheid schimmels (Ustilaginales) bestaan uit meer dan 1600 soorten die grassen met inbegrip van de belangrijke graan, maïs, gerst en tarwe infecteren, waardoor miljarden dollars in gewas verliezen jaarlijks¹. Deze schimmels worden gekenmerkt door de productie van teliospores, die hebben darkly gepigmenteerde celwanden en de versnippering agenten. Teliospores functie voor het beschermen van genetisch materiaal tijdens de stress van verspreiding tussen waardplanten, en in een slapende toestand van jaar²kan aanhouden. Zo, zijn teliospores een essentieel onderdeel van de verspreiding van de ziekte.

Om te kunnen studeren teliospore biologie, ons laboratorium maakt gebruik van de model smut schimmel Ustilago maydis (U. maydis), oftewel het oorzakelijke agens van de ziekte 'gemeenschappelijk vuiligheid van maïs'. Oudere U. maydis teliospores worden gekenmerkt door groei arrestatie, verminderde cellulaire metabolisme en lage niveaus van cellulaire ademhaling³. In gunstige milieu-omstandigheden (bijv., de aanwezigheid van specifieke suikers), U. maydis teliospores ontkiemen en voltooien van meiose, produceren basidiospores, die dit leiden nieuwe rondes van infectie tot kunnen. Kieming wordt gekenmerkt door de verhoogde ademhaling, de terugkeer naar de metabole activiteit en de progressie door waarneembare morfologische stadia van kiemkracht⁴.

De eerste fase van kiemkracht omvat verhoogde ademhaling en metabole functie, er zijn echter geen morfologische aanwijzingen van verandering. De oorspronkelijke metingen van respiratoire verandering in U. maydis werden uitgevoerd meer dan 50 jaar geleden, meten van zuurstofverbruik manometrically met een Warburg kolf apparaat⁵. We hebben een nieuwe, eenvoudige methode voor het bestuderen van de precieze veranderingen in de ademhaling tijdens de kieming van het teliospore door het meten van zuurstofverbruik over een tijdsverloop van kieming met behulp van een Clark-type microrespirometer ontwikkeld. Wij eerder gebruikt deze methode bij het bestuderen van de veranderingen in respiratoire tarief tussen wild-type U. maydis haploïde cellen en mutanten met defecte mitochondriën⁶, en hebben het protocol hier aangepast om veranderingen in teliospore ademhaling tijdens studie kieming. Dit biedt een manier om de timing van ademhaling verandering nauwkeurig te identificeren zodat we teliospores op het juiste moment na de inleiding van kieming richten kunnen te onderzoeken van vroege moleculaire gebeurtenissen. De progressie van kieming kan microscopisch worden gevolgd, zodra de promycelia naar voren uit de teliospore komt, maar de asynchrone aard geremd het isolement van genoeg teliospores op een gegeven moment voor onderzoek. Wij ontwikkelden een microdissection techniek vergelijkbaar met die voor in vitro bevruchting gewend fysiek teliospores te verzamelen in verschillende morfologische stadia van kiemkracht.

Protocol

1. corn Cob infectie

1. Zea mays (cv. Golden Bantam) groeien totdat cobs worden gevormd en zijn begonnen met zijde (ongeveer 60 dagen).
2. Cultuur compatibel haploïde U. maydis stammen gebruikt standaard protocollen zoals eerder beschreven⁷.
3. Maïskolven met behulp van standaardprotocollen zoals eerder beschreven⁷infecteren.

2. teliospore oogsten

1. Autoclaaf apparatuur (Büchner trechters, Büchner kolven, blenders, centrifuge flessen van 250 mL, platte spatels en water) met behulp van een standaard droge cyclus met ten minste 30 min sterilisatie bij 121 ° C (vloeibare standaardcyclus voor water).
2. Verwijder besmette cobs van planten (ongeveer 28-35 dagen post infectie) met behulp van een scheermes en de cobs instellen op een dienblad bedekt met de beschermer van de Bank.
3. Verwijder de tumoren uit kolven met een scheermesje en verzamelen in een bekerglas.
4. Vul een 250 mL laboratorium blender beker met tumoren tot ongeveer 1/3 vol en voeg gesteriliseerde met autoclaaf dH₂O totdat de blender beker ongeveer 3/4 is volledige. De tumoren verstoren door de blender aan lage, pulserende tot gehomogeniseerd.
5. Sluit de vacuümpomp aan een val van water, en dan over in een maatkolf van 1 L Büchner.
6. Plaats grote Büchner trechter in de kolf en lijn de bodem van de trechter Büchner met vier lagen voor kaasdoek.
7. Zet de vacuümpomp aan.
8. Giet een gedeelte van de gehomogeniseerde tumoren door de kaasdoek en schraap met een spatel.
9. Giet wat dH₂O in de kaasdoek om te spoelen van de teliospores door.
10. Herhaal totdat de dH₂O komen door de Kaasdoek is duidelijk.
11. Wringen uit de kaasdoek met het gehomogeniseerde tumor materiaal in het filter om ervoor te zorgen maximale teliospore herstel.
12. Wanneer de Büchner maatkolf van 1 L wordt steeds dicht bij volledige, leeg te maken in een grote erlenmeyer en zet het opzij.
13. Een nieuw stuk kaasdoek gestoken in het filter en herhaalt u de stappen (2.7-2.12) totdat alle van de tumoren hebben verstoord en gefilterd.
14. Giet de gefilterde teliospores in gesteriliseerde met autoclaaf 250 mL centrifuge flessen en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min en decanteren van de bovendrijvende substantie.
15. Herhaal stap 2.14 totdat alle van de gefilterde teliospores zijn Ingehuld door centrifugeren.
16. Schorten de korrels in een kleine hoeveelheid water en overdracht aan 50 mL centrifuge buizen.
17. Centrifugeer de buizen bij 1.000 x g gedurende 5 min en decanteren van de bovendrijvende substantie.
18. Suspendeer de pellet in ongeveer 50 mL dH₂O, centrifugeren van de buizen bij 1.000 x g gedurende 5 min en decanteren van de bovendrijvende substantie. Zachtjes Schraap de grijze bovenlaag met een spatel en de afzet daarvan. Herhaal totdat er niet langer een grijze laag bovenop is.
19. Droog de monsters overnachting in een vacuüm exsiccator.
20. Gedroogde teliospores bij 4 ° C bewaren tot gebruik.
21. Indien gewenst, behandelen de teliospores met kopersulfaat⁸ voordat inducerende te ontkiemen. Indien niet behandeld, voer dan grondige microscopische analyse van de teliospores om het monster vertegenwoordigt pure teliospores en is verstoken van bacteriële of andere verontreinigingen te bevestigen.
    1. Weeg ongeveer 50 mg teliospores in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
    2. Ongeveer 1,0 mL 0,75% CuSO₄ aan de tube van de 1,5 mL-microcentrifuge met de teliospores toevoegen. Pipetteer omhoog en omlaag om op te schorten de teliospores in de CuSO₄ oplossing gevolgd door schudden van het monster gedurende 3 uur.
    3. Centrifugeer het monster bij 2.500 x g gedurende 5 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie. Resuspendeer de pellet teliospore met steriel water, herhaal het centrifugeren en verwijder de bovendrijvende substantie.
    4. Herhaal stap 2.21.3 twee meer tijden.

3. teliospore levensvatbaarheid en kiemkracht Test

1. Weeg ongeveer 10 mg van U. maydis teliospores in een tube microcentrifuge 1,5 mL te beoordelen hun levensvatbaarheid en de timing van kiemkracht.
2. Bereiden in een kabinet bioveiligheid, aardappel dextrose Bouillon (VOB, 24 g/L) aangevuld met streptomycine sulfaat (160 µg/mL).
3. Opschorten van de teliospores in 500 µL van het VOB. Pipetteer zachtjes breken alle klontjes van teliospores te mengen.
4. Spoel de suspensie van teliospore tot een gesteriliseerde met autoclaaf 250 mL conische kolf met 10 mL van het VOB.
5. Incubeer de kolf bij 28 ° C schudden bij 90 t/min voor 12-16 h.
6. Verwijder in een kabinet bioveiligheid, 20 µL eenmonstervan de teliospores geïnduceerde te ontkiemen en bereiden een microscoopglaasje.
7. Met behulp van een Microscoop, visueel beoordelen stadia van kiemkracht die aanwezig zijn en de aanwezigheid van bacteriële besmetting.
   1. Het aantal teliospores in stadia ik via V met behulp van een hemocytometer en het bepalen van het percentage dat zijn ontkiemd.
   2. Als enige fase I teliospores aanwezig zijn, blijven broeden de kolf voor een totaal van 24 h vóór teliospore kieming te beoordelen. Incubatie gedurende maximaal 48 uur voordat het monster niet-levensvatbare die blijven.
   3. Als bacteriële besmetting aanwezig is, vullen van het VOB met kanamycine sulfaat (50 µg/mL) en streptomycine sulfaat (160 µg/mL) en herhaalt u vervolgens stap 3.1 tot en met 3.7. Als bacteriële besmetting aanhoudt, teliospores met koper sulfaat te behandelen en herhaal stap 3.1 tot en met 3.7.

4. de inductie van kiemkracht voor de controle van de ademhaling

1. Weeg gelijke hoeveelheid (bv., 50 mg) van de teliospores voor elke ademhaling-experiment.
2. In een kabinet bioveiligheid, voegt u teliospores toe aan een gesteriliseerde met autoclaaf ademhaling kamer.
3. Vul de zaal met VOB (24 g/L) aangevuld met streptomycine sulfaat (160 µg/mL) en kanamycine sulfaat (50 µg/mL).
4. Pipetteer omhoog en omlaag als u wilt maken van de opschorting van een teliospore.
5. Plaats het deksel van de kamer in de kamer maken luchtdicht zegel.

5. het verkrijgen van zuurstof verbruik tarief (OCR) metingen

1. Plaats het Parlement in het zaal-rek in een waterbad (voorverwarmd tot 28 ° C).
2. Plaats de O₂ sonde binnen de opening van de kamer.
3. Controleren van de gegevenspunten weergegeven in real time op het programma "SensorTrace Rate", en laat de sonde stabiliseren (~ 3 min nadat de sonde is geplaatst in de zaal).
4. Klik op "Maatregel" voor het meten van O₂ niveaus voortdurend voor 6 h met metingen opgenomen 2 s tussenpozen.
5. Stoppen van de meting en herhaalt u stappen 4.1-5.4 voor elk monster te analyseren.
6. De gegevens exporteren naar Microsoft Excel door te klikken op "bestand | Exporteren | Opslaan als xls".

6. de gegevensanalyse

1. Berekenen van OCR
   1. Opnemen in het geëxporteerde Excel-bestand onder het tabblad "Within_Rates", de "Rate" voor elke kamer meting (nmol/h).
   2. Voor elk experimenteel monster, aftrekken van de "Rate" van de lege kamer van de "Rate" van de experimentele monsterkamer om een gecorrigeerde OCR-waarde te verkrijgen, en neem de absolute waarde van dit nummer.
   3. Bereken de totale OCR per mg teliospores door de gecorrigeerde waarde voor absolute OCR te delen door de mobiele massa gebruikt.
   4. Gemiddelde repliceren "OCR per mg teliospores" waarden voor elke stam.
2. Analyseren van de gegevens met behulp van geschikte statistische methode (bv., student t-test, variantie-analyse) met behulp van Microsoft Excel van andere statistische software.
3. Grafiek van de ruwe gegevens te berekenen van het percentage zuurstof resterende voor elk tijdstip dat u wenst te grafiek. Verdelen van de eerste lezing door zelf en vermenigvuldig met 100 (100% zuurstof resterende), vervolgens elke latere lezing verdelen door de eerste lezing en vermenigvuldig met 100 om het percentage zuurstof in de kamer blijft.

7. de inductie van Teliospore kieming te isoleren van Teliospores in verschillende stadia van kiemkracht

1. VOB (24 g/L) aangevuld met streptomycine sulfaat (160 µg/mL) in een kabinet bioveiligheid voor te bereiden.
2. Plaats ongeveer 10 mg van U. maydis teliospores in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
3. Opschorten van de teliospores in 500 µL van het VOB. Pipet zachtjes te mengen zolang er geen klontjes van teliospores in het medium niet zijn.
4. Breng de teliospore een gesteriliseerde met autoclaaf 250 mL-kolf met VOB aangevuld met streptomycine sulfaat.
5. Incubeer de kolf 's nachts bij 28 ° C schudden bij 90 t/min.

8. bereiding van de petrischaal en Micromanipulator

1. Voorbereiden op een petrischaal (57 cm²) door pipetting rijen van druppeltjes microcapillary voorbereiding en sample collectie.
   1. Pipetteer 5 µL (x 4) dH₂O druppels aan de bovenkant van de petrischaal.
   2. Pipetteer 2 µL (x3) van RNA stabilisatie oplossing op de petrischaal voor sample collectie moet worden gebruikt.
   3. Pipetteer 5 µL (x 30) druppels met teliospores op de petrischaal ontkiemen.
2. Voeg 15 mL minerale olie tot de petrischaal. Zorg ervoor dat alle druppels olie alvorens vallen.
3. Bereid een microcapillary met een 15 µm inwendige diameter, 1 mm flens, 55 mm lengte en een hoek van 20° tip door plaatsen in de microcapillary houder en dompelen het in de minerale olie waar capillaire actie zorgt ervoor dat de minerale olie om in te voeren van de microcapillary. Laat de druk in de microcapillary alvorens het naar de druppel water. Gecombineerd om voor te bereiden van het microcapillary met water.

9. isolatie van fase-specifieke ontkiemen Teliospores

1. Met behulp van de besturingselementen van de micromanipulator, de bereid microcapillary naar één van de kiemkracht druppels verplaatsen. Doordringen de druppel, verlaag de microcapillary en brengen van de monding van de microcapillary tot een kiemende teliospore het stadium van kieming van belang.
2. Langzaam gecombineerd om vast te leggen van de ontkiemende teliospore. Stoppen met zuigen zodra de teliospore is de microcapillary. Herhaal totdat er ongeveer vijf teliospores in de microcapillary zijn.
3. Verhogen van de microcapillary met de micromanipulator en breng het aan de collectie druppel van RNA stabilisatie oplossing. Doordringen van de druppel en injecteren van de teliospores in de druppel.
4. Herhaal stap 8.1 naar 8.3 tot ongeveer 1000 teliospores zijn vastgelegd.

10. invordering van collectie druppel

1. Pipetteer van de collectie druppel en het overbrengen naar het deksel van een tube RNase/DNase-gratis 2,0 mL microcentrifuge. Verwijder voorzichtig de minerale olie met een pipet zonder verstoring van de collectie druppel.
2. Gebruik de teliospores voor downstream toepassingen zoals RNA isolatie.

Resultaten

Met behulp van de Clark-type microrespirometer gebaseerde methode voor het meten van veranderingen in de ademhaling tijdens de rustperiode van de teliospore en de kiemkracht, bevestigd we dat slapende teliospores een lage niveau van de ademhaling (~ 1.075 µmol/h/mg vertonen) vergeleken met ontkiemen teliospores (~ 2.614 µmol/h/mg; Figuur 1A). Dit betekent een ~2.4-fold verandering in gemiddelde snelheid van de ademhaling tussen slapende teliospores en teliosp...

Discussie

Lange biotrophic plant ziekteverwekkers worden jaarlijks miljarden dollars in gewas verliezen veroorzaken. De overgrote meerderheid van deze ziekteverwekkers produceren teliospores, die integraal deel van de schimmel versnippering en geslachtelijke voortplanting uitmaken. Verkrijgen van kennis van de ontwikkeling en de kiemkracht van teliospores is van cruciaal belang voor het begrip van de verspreiding van de verwoestende ziekten veroorzaakt door deze schimmels. Teneinde de moleculaire veranderingen op belangrijke contr...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Streptomycin Sulfate	BioShop	STP101
Kanamycin Sulfate	BioShop	KAN201
Potato Dextrose Broth	BD Difco	254920
1 L Waring Laboratory blender	Waring	7011S
Cheesecloth	VWR	470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2)	Unisense	OX10
MicroOptode Meter Amplifier	Unisense	N/A
MR-Ch Small	Unisense	MR-Ch
SensorTrace Rate Software	Unisense	N/A
MicroRespiration Rack	Unisense	MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer	Unisense	MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope	Zeiss
Coarse Manipulator	Narishige	MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-202ND
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004