Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen

Summary

Hier presenteren we een protocol te ontwikkelen en karakteriseren van tolerogenic dendritische cellen (TolDCs) en evalueren van hun immunotherapeutische nut.

Abstract

Het immuunsysteem werkt door een strakke evenwicht tussen coördinerende reacties tegen buitenlandse antigenen en handhaven van een niet-reagerende staat tegen zelf-antigenen en antigenen afkomstig van commensale organismen. De verstoring van deze immuun homeostase kan leiden tot chronische ontsteking en voor de ontwikkeling van auto-immuniteit. Dendritische cellen (DC's) zijn de professionele presentatie van antigeen cellen van het aangeboren immuunsysteem betrokken bij het activeren van de naïeve T cellen om te starten van de immuunrespons tegen vreemde antigenen. DCs kunnen echter ook worden onderscheiden in TolDCs die handelen te handhaven en T cel tolerantie te bevorderen en te onderdrukken effector cellen bij te dragen tot de ontwikkeling van beide voorwaarden van auto-immuunziekten of chronische ontsteking. De recente vooruitgang in ons begrip van TolDCs suggereert dat DC tolerantie kan worden bereikt door het moduleren van de voorwaarden van hun differentiatie. Dit verschijnsel heeft geleid tot een enorme groei in TolDC therapieën voor talrijke immuun aandoeningen veroorzaakt door te breken in immuun tolerantie te ontwikkelen. Succesvolle studies in preklinische autoimmuniteit lymfkliertest modellen hebben verder de immunotherapeutische nut van TolDCs in de behandeling van auto-immune aandoeningen gevalideerd. TolDCs hebben tegenwoordig een veelbelovende immunotherapeutische hulpmiddel in de kliniek voor herstel van immuun tolerantie in verschillende immuun aandoeningen door pathogene auto-immune reacties zich te richten terwijl protectieve immuniteit intact blijven. Hoewel een array van strategieën heeft voorgesteld door meerdere labs voor het opwekken van TolDCs, is er geen consistentie in het karakteriseren van de cellulaire en functionele fenotype van deze cellen. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor de ontwikkeling van beenmerg-afgeleide DCs in grote aantallen, een unieke methode die wordt gebruikt om hen te onderscheiden in TolDCs met een synthetische triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic zuur-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), en de technieken gebruikt om te bevestigen hun fenotype, met inbegrip van analyses van essentiële moleculaire signaturen van TolDCs. Tot slot laten we zien een methode om te beoordelen van de TolDC functie door het testen van hun immunosuppressieve reactie in vitro en in vivo in een preklinische model van multiple sclerose.

Introduction

Dendritische cellen (DC's) werden zijn een integraal onderdeel van het aangeboren immuunsysteem en eerst ontdekt en gekenmerkt door Ralph Steinman en Zanvil Cohn in 1973 als primaire professionele antigeen presentatie^{1 cellen}. DCs is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de immuunactivatie door de presentatie van verwerkte antigeen aan T-cellen en B cellen via grote comptabiliteit complexen (MHC) in secundaire lymfoïde organen te koppelen van de aangeboren en adaptieve immuunsysteem². In de zoogdieren immuunsysteem zijn er ten minste twee categorieën van DCs die worden omschreven als myeloïde DCs en plasmacytoid D....

Protocol

Alle studies werden uitgevoerd met inachtneming van de procedures door de Case Western Reserve University School of Medicine van institutionele Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd.

1. Prepareer het beenmerg-afgeleide dendritische cellen (BMDCs)

1. Alle chirurgische instrumenten via autoclaaf steriliseren en het uitvoeren van het experiment in klasse II biologische veiligheidskast met geëigende veiligheidsprocedures.
2. C57BL/6 muizen 8-10 weken oud met behulp van CO₂ kamer euthanaseren. Plaats de muis op een ontleden bord en spoel met 70% ethanol. Accijnzen tibia kuitbeen en dijbeen botten met behulp van een c....

Results

De differentiatie en de selectie van BMDCs:

Het beenmerg voorlopercellen werden gekweekt in volledige RPMI medium in het bijzijn van GM-CSF en IL-4 te onderscheiden in iDCs gedurende 7 dagen (figuur 1A). Op dag 1, cellen waren klein in omvang en toonde sferische morfologie. Wassen met PBS voordat de vervanging van verse medium op dag 3 cellen hielp vorm clusters en ook steeg de bevo.......

Discussion

Dit witboek beschrijft een efficiënt protocol dat kan worden gebruikt voor reproducibly voor het genereren van iDCs en vervolgens om hen te onderscheiden in TolDCs, en wij stellen voor dat dit kan worden toegepast om te evalueren van de capaciteit van de nieuwe moleculaire doel agenten voor het opwekken van de TolDC fenotype. Zoals beschreven in dit verslag, we hebben een reeks waarin we eerst geanalyseerd TolDC uitdrukking van oppervlakte liganden door stroom cytometry, gevolgd door een evaluatie van het DC cytokine pro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CDDO-DFPA (RTA-408)	Reata Pharmaceuticals	in house synthesis	Cell culture
Mouse GM-CSF	Peprotech Inc.	315-03	BMDC differentiation
Mouse IL-4	Peprotech Inc.	214-14	BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS)	Sigma Aldrich Inc.	L2880	Cell culture
β-mercaptoethanol	Sigma Aldrich Inc.	516732	Cell culture
Pertussis toxin (PTX)	R&D systems	3097	EAE induction
MOG (35–55) peptide	21stCentury Biochemicals	in house synthesis	EAE induction
Trypan blue	Gibco, Life Technologies	15250-061	Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine	ThermoFisher Scientific	11875-093	Cell culture
Non-essential amino acid (100X)	ThermoFisher Scientific	11140050	Cell culture
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080	Cell culture
penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122	Cell culture
40 μm cell strainer	Corning	352340	Cell isolation
PE-conjugated CD80	BD Biosciences	557227	Flow cytometry
PE-conjugated CD86	BD Biosciences	555665	Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1	BioLegend	124307	Flow cytometry
APC-conjugated MHCII	Miltenyi Biotec Inc.	130-112-388	Flow cytometry
APC-conjugated CD11c	BD Biosciences	340544	Flow cytometry
Isotype matched PE	Miltenyi Biotec Inc.	130-091-835	Flow cytometry
Isotype matched APC	Miltenyi Biotec Inc.	130-091-836	Flow cytometry
CFSE	BioLegend	423801	T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	T cell proliferation assay
ACK lysing buffer	ThermoFisher Scientific	A1049201	BMDC differentiation
1 ml syringe	BD Biosciences	309626	T cell proliferation assay
3 ml syringe	BD Biosciences	309588	BMDC differentiation
25G needle	BD Biosciences	309626	T cell proliferation assay
23G needle	BD Biosciences	309588	BMDC differentiation
BSA	Sigma Aldrich Inc.	A2058	T cell proliferation assay
EDTA	ThermoFisher Scientific	15575020	T cell proliferation assay
LS Column	Miltenyi Biotec Inc.	130-042-401	T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter	Miltenyi Biotec Inc.	130-095-823	T cell proliferation assay
collagenase D	Sigma Aldrich Inc.	11088858001	T cell proliferation assay
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025076	T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329	Sigma Aldrich Inc.	O1641	T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe	ThermoFisher Scientific	Mm01168134_m1	qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe	ThermoFisher Scientific	Mm00434165	qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA	R&D systems	DY419-05	ELISA
Mouse EDN-1 ELISA	RayBiotech	ELM-EDN1-1	ELISA
TNF-α TaqMan probe	ThermoFisher Scientific	Mm00443258	qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit	R&D systems	MTA00B	ELISA
IL-6 TaqMan probe	ThermoFisher Scientific	Mm00446190	qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit	R&D systems	M6000B	ELISA
IL-23a TaqMan probe	ThermoFisher Scientific	Mm01160011	qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA	R&D systems	DY1887-05	ELISA
IL-4 TaqMan probe	ThermoFisher Scientific	Mm99999154_m1	qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe	ThermoFisher Scientific	Mm01288386_m1	qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe	ThermoFisher Scientific	Mm01178820_m1	qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody	Abcam	ab13248	Western blotting
Anti-β-actin antibody	Abcam	ab8226	Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Inc.		qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer	BD Biosciences		Flow cytometry