Method Article

Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen

DOI:

10.3791/57637

⸱

May 18th, 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol te ontwikkelen en karakteriseren van tolerogenic dendritische cellen (TolDCs) en evalueren van hun immunotherapeutische nut.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het immuunsysteem werkt door een strakke evenwicht tussen coördinerende reacties tegen buitenlandse antigenen en handhaven van een niet-reagerende staat tegen zelf-antigenen en antigenen afkomstig van commensale organismen. De verstoring van deze immuun homeostase kan leiden tot chronische ontsteking en voor de ontwikkeling van auto-immuniteit. Dendritische cellen (DC's) zijn de professionele presentatie van antigeen cellen van het aangeboren immuunsysteem betrokken bij het activeren van de naïeve T cellen om te starten van de immuunrespons tegen vreemde antigenen. DCs kunnen echter ook worden onderscheiden in TolDCs die handelen te handhaven en T cel tolerantie te bevorderen en te onderdrukken effector cellen bij te dragen tot de ontwikkeling van beide voorwaarden van auto-immuunziekten of chronische ontsteking. De recente vooruitgang in ons begrip van TolDCs suggereert dat DC tolerantie kan worden bereikt door het moduleren van de voorwaarden van hun differentiatie. Dit verschijnsel heeft geleid tot een enorme groei in TolDC therapieën voor talrijke immuun aandoeningen veroorzaakt door te breken in immuun tolerantie te ontwikkelen. Succesvolle studies in preklinische autoimmuniteit lymfkliertest modellen hebben verder de immunotherapeutische nut van TolDCs in de behandeling van auto-immune aandoeningen gevalideerd. TolDCs hebben tegenwoordig een veelbelovende immunotherapeutische hulpmiddel in de kliniek voor herstel van immuun tolerantie in verschillende immuun aandoeningen door pathogene auto-immune reacties zich te richten terwijl protectieve immuniteit intact blijven. Hoewel een array van strategieën heeft voorgesteld door meerdere labs voor het opwekken van TolDCs, is er geen consistentie in het karakteriseren van de cellulaire en functionele fenotype van deze cellen. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor de ontwikkeling van beenmerg-afgeleide DCs in grote aantallen, een unieke methode die wordt gebruikt om hen te onderscheiden in TolDCs met een synthetische triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic zuur-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), en de technieken gebruikt om te bevestigen hun fenotype, met inbegrip van analyses van essentiële moleculaire signaturen van TolDCs. Tot slot laten we zien een methode om te beoordelen van de TolDC functie door het testen van hun immunosuppressieve reactie in vitro en in vivo in een preklinische model van multiple sclerose.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritische cellen (DC's) werden zijn een integraal onderdeel van het aangeboren immuunsysteem en eerst ontdekt en gekenmerkt door Ralph Steinman en Zanvil Cohn in 1973 als primaire professionele antigeen presentatie1 cellen. DCs is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de immuunactivatie door de presentatie van verwerkte antigeen aan T-cellen en B cellen via grote comptabiliteit complexen (MHC) in secundaire lymfoïde organen te koppelen van de aangeboren en adaptieve immuunsysteem2. In de zoogdieren immuunsysteem zijn er ten minste twee categorieën van DCs die worden omschreven als myeloïde DCs en plasmacytoid DCs (PDC's)3. Myeloïde DCs, ook bekend als conventionele DCs (cDCs), worden gekenmerkt door de uitdrukking van CD11c en kan worden gedifferentieerd als onvolwassen DCs (iDCs) in vitro van voorlopercellen van het beenmerg of perifere bloed monocyten gebruiken granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) en IL-4 bij lymfkliertest of menselijke diersoorten, respectievelijk4.

Activeren 'gevaar' signalen, zoals pathogen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP) of schade-geassocieerde moleculaire patronen (VOCHTIGE), rijdt iDCs rijping richting immunogene DCs als volwassen DCs (mDCs) via verschillende patroon erkenning receptoren bindt de DC-oppervlakte5. Immunogene DCs verder prime naïef T-celproliferatie en differentiatie via opregulatie van MHCII2, costimulatory liganden (CD80, CD86 en interactie CD40)6, cytokines en andere oplosbare bemiddelaars7. Een cascade van pro-inflammatoire mediator productie van immunogene DCs is essentieel voor de cytokine gemedieerde T celdifferentiatie. Bijvoorbeeld, zowel IFN-γ en IL-12 zijn nodig voor de Th1 differentiatie8 en IL-1, IL-6, en IL-23 zijn kritisch voor de naïeve T cel polarisatie naar Th17 cellen9. Hoewel volwassen DCs op vreemde antigenen reageren, kan ongecontroleerde DC activering door zelf-antigenen leiden tot tolerantie ablatie en bevordering van de ontwikkeling van auto-immune ziekten door het genereren van autoreactieve T cellen waarvan Activering tot weefselvernietiging10 leidt .

Recente rapporten hebben verstrekt duidelijk bewijs van DC plasticiteit, wordt geïllustreerd door hun vermogen om te communiceren met verschillende aanwijzingen binnen hun communicatie weefsel en te onderscheiden in verschillende effector/suppressorgenen DC subsets. De anti-inflammatoire mediatoren, zoals IL-10,11, TGF-β12en HO-113 hebben aangetoond dat een belangrijke rol spelen bij immuun onderdrukking door inducerende tolerogenic DCs (TolDCs). Deze TolDCs verwerven van de regelgevende taken en onderdrukken van T-cel proliferatie14. Bovendien, het gebrek aan co-stimulatie door DCs en de productie van anti-inflammatoire mediatoren van TolDCs zowel bijdragen tot de inductie van regulatoire T-cellen (Tregs) en ook effectief remmen zowel Th1 en Th17 differentiatie en uitbreiding15. In afgelopen twee decennia, is de therapeutische mogelijkheden van TolDCs gemeld door verschillende onderzoekers. In deze studies, het beheer van ex-vivo TolDCs niet alleen verbeterd pathologische symptomen gegenereerd in verschillende preklinische modellen van auto-immune ziekten16 , maar ook geleid tot de ontwikkeling van immune tolerantie bij patiënten17 ,18. Interessant is dat vandaag de TolDCs therapie heeft beschouwd als een alternatieve of adjuvante aanpak voor auto-immune ziekten in verschillende klinische proeven, met inbegrip van type 1 diabetes mellitus19, reumatoïde artritis20, 21, multiple sclerose (MS)22,23,24, en de ziekte van Crohn ziekte25.

Er zijn een verscheidenheid van protocollen die hebben gewerkt aan het ontwikkelen van TolDCs en verschillende laboratoria methoden hebben gemeld voor generatie en fenotypische karakterisering van TolDCs. Deze methoden kunnen worden gebruikt voor het genereren van reproducibly TolDCs in vitro van hematopoietische progenitorcellen en stabiel om ze te bewaren in een tolerogenic staat in vivo26,27,28,29. De iDCs kan worden omgezet in TolDCs door blootstelling aan verschillende immunomodulerende farmacologische agenten of anti-inflammatoire cytokines. Vitamine D3 is bijvoorbeeld een bekende farmacologische agent bekend te vergroten van de productie van de IL-10 en onderdrukken van IL-12 secretie van DCs en te stimuleren waardoor hun immunosuppressieve functie30. Bovendien, wanneer DCs worden blootgesteld aan krachtige inflammatoire stimuli, zoals lipopolysacchariden (LPS), verschillende farmacologische stoffen zoals dexamethason31, rapamycin32en33 van de corticosteroïden is gebleken voor het opwekken van de TolDC fenotype doordat DC oppervlakte expressie van CD40, CD80, CD86 en MHCII34. IL-10 en TGF-β zijn de meest bestudeerde anti-inflammatoire cytokines voor het opwekken van DC tolerantie35 en de daarmee gepaard gaande blootstelling aan beide van deze cytokines voor het opwekken van het fenotype van een tolerogenic in DCs36is gebleken.

Sinds de tolerogenic die DC wordt bepaald door functionele eigenschappen in plaats van door fenotypische markers, er is behoefte een grote een consistente methode voor cellulaire en functionele karakterisering van TolDCs te ontwikkelen. Bovendien een strenge en consequente protocol moet worden vastgesteld voor de consistente beoordeling en de karakterisering van het tolerogenic DC fenotype als wij gaan effectief en reproducibly vergelijken het vermogen van de nieuwe agenten voor het opwekken van het fenotype van de TolDC in de laboratorium. Hier voorzien wij een gedetailleerd protocol met stapsgewijze methoden beschreven om te isoleren iDCs van hematopoietische progenitorcellen van muizen en vervolgens analyseren van de werkzaamheid van nieuwe agenten onder evaluatie voor hun capaciteit iDCs omzetten in TolDCs, die bieden een robuuste functionele en fenotypische karakterisatie van TolDCs zowel in vitro als in vivo. Deze beschrijving bevat een uitgebreide methode karakteriseren de TolDCs door hun oppervlakte liganden, cytokine profiel en immunosuppressieve functies in vitro. We bieden ook een voorbeeld van een methode om te verkennen van de mogelijke therapeutische toepassing van deze TolDCs in een preklinische model van MS, experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE). Deze gangbaar protocol helpt onderzoekers om de capaciteit van de nieuwe agenten ter bevordering van de inductie van TolDCs en vergemakkelijkt de inspanning uit te breiden het bereik van TolDC therapeutische ontwikkeling.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle studies werden uitgevoerd met inachtneming van de procedures door de Case Western Reserve University School of Medicine van institutionele Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd.

1. Prepareer het beenmerg-afgeleide dendritische cellen (BMDCs)

  1. Alle chirurgische instrumenten via autoclaaf steriliseren en het uitvoeren van het experiment in klasse II biologische veiligheidskast met geëigende veiligheidsprocedures.
  2. C57BL/6 muizen 8-10 weken oud met behulp van CO2 kamer euthanaseren. Plaats de muis op een ontleden bord en spoel met 70% ethanol. Accijnzen tibia kuitbeen en dijbeen botten met behulp van een chirurgische scissor en plaats ze met 70% ethanol in een 10 cm cultuur schotel.
  3. Chirurgische messen en pincet gebruiken om te ontleden weefsel weg zoveel mogelijk op het deksel van de 10 cm schotel cultuur en isoleren zijn verbeend en dijbeen te plaatsen met 70% ethanol in een 6 cm cultuur schotel.
  4. Hiermee kunt u dat chirurgische messen trim beide uiteinden van zijn verbeend en dijbeen. Gebruik 3 mL PBS in 3 ml injectiespuit met een naald 23G voor het spoelen van de inhoud van het merg van het ene eind van botten aan een conische buis met 12 ml PBS. Herhaal deze stap 3 x voor beide uiteinden van de botten.
  5. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min.
  6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel met 1 ml ACK lysing buffer voor 5 mins aan het verwijderen van rode bloedcellen.
  7. Voeg 9 ml PBS om te verdunnen ACK lysing buffer en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten.
  8. Verwijder het supernatant en resuspendeer met 10 ml gestolde voedingsbodem (RPMI-1640 plus L-glutamine, 10% FBS, 1% niet-essentiële aminozuur (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoethanol en 5% penicilline/streptomycine).
    Opmerking: Endotoxine niveau moet minder dan 0.1 EU/ml in FBS.
  9. De celsuspensie passeren door een zeef van de cel 40 μm en nemen 20 µl celsuspensie en meng met 80 µl van trypan blauw aan tellen het aantal levende cellen met behulp van cytometer.
  10. Aanpassen van de cel nummer 1 x 106 cellen/ml met 15 ng/ml GM-CSF en 10 ng/ml IL-4.
  11. 3 ml 1 x 106 cellen/ml in elk putje van 6-well plaat plaat en Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid in de CO2 incubator.
    Opmerking: De beenmergcellen van één muis is ongeveer 3-5 x 107 cellen, die aangeeft dat het kan worden geplaatst van 2 naar 3 6-Wells-platen.
  12. Op dag 3, verwijder alle 3 ml gestolde voedingsbodem uit elk putje, voeg 2 ml verse PBS in elk putje en vervolgens voorzichtig swirl de plaat om ervoor te zorgen dat alle niet-aanhanger cellen verwijderen.
  13. 3 ml verse kweekmedium vervangen door 15 ng/ml GM-CSF en 10 ng/ml IL-4 in elk putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid in de CO2 incubator.
  14. Op dag 5, direct een andere 3 ml verse kweekmedium met 15 ng/ml GM-CSF en 10 ng/ml IL-4 in elk putje toevoegen. Incubeer de cellen bij 37° C en 5% CO2, 95% vochtigheid in de CO2 incubator.
    Opmerking: Het totale volume in elk putje is nu 6 ml.
  15. Op dag 7, kunt u de hele plaat gezet door ijs voor 10 minuten. Pipetteer zachtjes het kweekmedium in elk putje te verjagen van de losjes-aanhanger BMDCs als iDCs in suspensie.
    Opmerking: Het aanhangend macrofagen zijn nog steeds gekoppeld aan de plaat. Lage temperatuur en zachtjes procedures zijn de sleutel tot het voorkomen van DC activering om invloed op verdere experimenten.
  16. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten en resuspendeer met verse voedingsbodem voor verdere experimenten.
    Opmerking: BMDCs kan worden geïdentificeerd met fluorescentie-label CD11c antilichaam aan stroom cytometry en toonden we onze gating strategie van BMDCs voor verdere experimenten in Figuur 1.

2. het karakteriseren van TolDC gen- en eiwit profiel

  1. Plaat 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml per putje in 6 goed-plaat met gestolde voedingsbodem in de aanwezigheid of afwezigheid van 100-400 nM, CDDO-DFPA voor 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid in de CO2 incubator aan het broeden.
    Opmerking: CDDO-DFPA, een synthetische triterpenoid, is een nucleaire factor (erythroid afkomstige 2) - zoals - 2 factor (Nrf2) inductor en nucleaire factor-recombination (NF-recombination) remmer. Andere agenten voor inductie van TolDCs uit iDCs, zoals IL-10, vitamine D3, dexamethason of BAY 11-7085, toepassen en wijzigen van deze stap naar een optimale voorwaarde voor elke agent.
  2. Het toevoegen van 10 of 100 ng/ml van LPS voor 4-24 uur om te induceren mDCs (incubatietijd verschilt als gevolg van de meting van mRNA of eiwitten) aan het broeden.
  3. Zachtjes Pipetteer het kweekmedium in elk putje en oogst van de celsuspensie met behulp van 1 ml pipet. Centrifugeer bij 300 x g voor 5 mins aan het verzamelen van de cellen en het supernatant, respectievelijk.
  4. Analyseren van de oppervlakte liganden van de cel pellets door stroom cytometry, zoals stimulerend liganden: interactie CD40 CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL of remmende liganden: PD-L1 PD-L2, ILT3, ILT4.
  5. Isoleren van RNA van de cel pellets en analyseren van het RNA en supernatant monsters voor de cytokine profiel en gen- en eiwit niveaus door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) en ELISA, respectievelijk.
    Opmerking: als u bijvoorbeeld inflammatoire cytokines: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12, en IL-23 of anti-inflammatoire cytokines: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 en HO-1.

3. de functie van TolDCs wordt geëvalueerd In Vitro en In Vivo

  1. T-cel Syngeneic proliferatie Assay
    1. Alle chirurgische instrumenten via autoclaaf steriliseren en het uitvoeren van het experiment in klasse II biologische veiligheidskast met geëigende veiligheidsprocedures.
    2. Bereiden MACS buffer met behulp van 0,5% bovien serumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA in 500 ml PBS. Het steriliseren van de buffer door het filteren door middel van een 0,2 µm filter.
      Opmerking: Houd de buffer op het ijs tijdens het volgende experiment.
    3. Verkrijgen van CD4+ T cellen, euthanaseren OT-II T-cel receptor (TCR) transgene muizen met behulp van CO2 kamer 8-10 weken oud. Plaats de muis op een ontleden bord en spoel met 70% ethanol. Het isoleren van de milt vanaf de linkerkant van de buik met behulp van chirurgische schaar en pincet.
    4. Zet de milt met 2 ml PBS in een 6 cm cultuur schotel en gebruik de achterkant van de push-stick van 3 ml spuit mild met de milt door het passeren van een 40 μm cel zeef.
    5. Het verzamelen van de celsuspensie en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten.
    6. Resuspendeer de pellet cel in 400 μl van MACS buffer.
    7. Voeg 100 µl van CD4+ T cel Biotine-antilichaam Cocktail bij 4° C gedurende 5 minuten.
      Opmerking: Het antilichaam cocktail bindt op andere celtypes behalve CD4+ T cellen, zoals CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC klasse II, Ter-119, en TCRγ/δ.
    8. Voeg 300 μl van MACS buffer en 200 μl van anti-Biotine kralen (Tabel of Materials) bij 4° C gedurende 10 minuten.
    9. Plaats de kolom samengesteld van Ferromagnetische bollen (Tabel van materialen) en Filter van de pre scheiding samen in het magnetische veld en spoel het met 3 ml MACS buffer.
    10. Voeg 9 ml MACS buffer in de cellen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten.
    11. Resuspendeer de pellet cel in 3 ml MACS buffer en toepassen op de kolom. Verzamel doorstroomtest met CD4+ T cellen.
    12. Was de kolom met een andere 3 ml MACS buffer en verzamelen ook de doorstroming.
    13. Voor het verkrijgen van milt pan DCs, euthanaseren C57BL/6 muizen 8-10 weken oud met behulp van CO2 kamer. Plaats de muis op een ontleden bord en spoel met 70% ethanol. Het isoleren van de milt vanaf de linkerkant van de buik met behulp van chirurgische schaar en pincet. Zet de milt in een 6cm cultuur schotel met collagenase D oplossing 2 ml (2 mg/ml collagenase D opgelost in HBSS met calcium, magnesium).
    14. 1 ml van collagenase D oplossing tot de milt twee keer met een spuit van 1 ml en een 25G naald injecteert. De milt in kleine stukjes gesneden met een kleine schaar.
    15. Schudden en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten.
    16. Voeg toe 500 μl van EDTA 0.5 M bij kamertemperatuur voor 5 minuten.
      Opmerking: De stappen van 3.1.13-3.1.14 zijn essentieel voor het verhogen van het rendement van DCs.
    17. Gebruik nu de achterkant van de push-stick van 3 ml spuit mince de milt drijfmest door het passeren van een 40 μm cel zeef te verzamelen van de celsuspensie door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten.
    18. Resuspendeer de pellet cel in 350 μl van MACS buffer 50 µl van FcR blokkeren reagens en 100 µl van Pan dendritische cel Biotine-antilichaam Cocktail bij 4° C gedurende 10 minuten.
      Opmerking: Het antilichaam tegen antigenen die niet worden uitgedrukt door DCs cocktail.
    19. De cellen door toevoeging van 9 ml van MACS buffer en centrifuge bij 300 x g gedurende 5 minuten wassen.
    20. Resuspendeer de pellet cel in 800 μl van MACS buffer en voeg 200 μl van anti-Biotine kralen bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
    21. Herhaal de stappen van de 3.1.9-3.1.11 voor het verzamelen van DCs.
    22. Was de kolom met een andere 3 ml MACS buffer tweemaal en verzamelen ook de doorstroming.
    23. Behandelen van de 2 x 10-5 DCs/ml in de aanwezigheid of afwezigheid van 100-400 nM CDDO-DFPA bij 37 ° C gedurende 1 hr. apart, label CD4+ T-cellen (1 x 107/ml) met 1 μM CFSE bij 37 ° C gedurende 15 minuten, wassen met PBS , en passen het volume om de definitieve concentratie van 2 x 106 T cellen/ml.
    24. Vervolgens in een 96-wells-plaat, cultuur samen 100 µl van de behandelde dendritische cellen met hetzelfde volume van CFSE-label CD4+ T cellen, beide verzameld uit de bovenstaande stappen om 1:10 verhouding. Voeg nu 100 ng/mL ovoalbumine (OVA) peptide 323-329 per goed en meet de intensiteit van de CFSE van de T-cellen door stroom cytometry na 2-3 dagen incubatie.
      Opmerking: De cel nummers en verhouding van DCs en T cellen uit onze eerdere werk37zijn geoptimaliseerd.
  2. Induceren van passief EAE door het injecteren van de BMDCs Pulsed met myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) (35-55)
    1. Plaat 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml per putje in 6 goed-plaat met gestolde voedingsbodem in de aanwezigheid of afwezigheid van 100-400 nM CDDO-DFPA voor 1 uur aan het broeden.
    2. Voeg 10 ng/ml LPS voor drachtige 24 uur.
    3. Voeg 100 μg/ml MOG (35-55) voor drachtige 4 uur.
    4. Oogst de celsuspensie en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten.
    5. Resuspendeer de pellet cel met PBS en cellen tellen.
    6. Subcutaan injecteren 200 μl van 2 x 106 cellen met 8-10 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen (100 µl in elke achterpoot).
    7. Op de dag van BMDC injectie en de 48 uur. later, injecteren 200 ng pertussis toxine (PTX) in elke muis.
    8. Herhaal stappen 3.2.6-3.2.7 eenmaal per week voor 4 opeenvolgende weken.
    9. De klinische symptomen van EAE dagelijks evalueren met behulp van de criteria van de kwaliteitsnorm37 (0.5-limp staart, staart 1-limp, 2-matig hind-limb zwakte, 3-ernstige hind-limb zwakte, hind-limb 4-volledige verlamming, 5-tetraplegie of stervende state, 6-dood).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De differentiatie en de selectie van BMDCs:

Het beenmerg voorlopercellen werden gekweekt in volledige RPMI medium in het bijzijn van GM-CSF en IL-4 te onderscheiden in iDCs gedurende 7 dagen (figuur 1A). Op dag 1, cellen waren klein in omvang en toonde sferische morfologie. Wassen met PBS voordat de vervanging van verse medium op dag 3 cellen hielp vorm clusters en ook steeg de bevo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit witboek beschrijft een efficiënt protocol dat kan worden gebruikt voor reproducibly voor het genereren van iDCs en vervolgens om hen te onderscheiden in TolDCs, en wij stellen voor dat dit kan worden toegepast om te evalueren van de capaciteit van de nieuwe moleculaire doel agenten voor het opwekken van de TolDC fenotype. Zoals beschreven in dit verslag, we hebben een reeks waarin we eerst geanalyseerd TolDC uitdrukking van oppervlakte liganden door stroom cytometry, gevolgd door een evaluatie van het DC cytokine pro...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Reata Pharmaceuticals voor het verstrekken van CDDO-DFPA. We erkennen ook de steun van de Jane en Lee Seidman stoel in Pediatric Cancer innovatie (John Letterio). Dit werk werd gesteund door het ministerie van defensie [W81XWH-12-1-0452]; de Angie Fowler Adolescent en jong volwassen kanker onderzoeksinitiatief op de zaak uitgebreid Cancer Center; en de Callahan Graduate geleerde Award voor Hsi-Ju Wei van F.J. Callahan Foundation.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CDDO-DFPA (RTA-408)Reata Pharmaceuticalsin house syntheseCelcultuur
Mouse GM-CSFPeprotech Inc.315-03BMDC differentiatie
Mouse IL-4Peprotech Inc.214-14BMDC differentiatie
Lipopolysaccharides (LPS)Sigma Aldrich Inc.L2880Celcultuur
β-mercaptoethanolSigma Aldrich Inc.516732Celcultuur
Pertussis toxine (PTX)R&D systems3097EAE-inductie
MOG (35–55) peptide21stCentury Biochemicalsin house syntheseEAE-inductie
Trypan blauwGibco, Life Technologies15250-061Celcultuur
RPMI-1640 plus L-glutamineThermoFisher Scientific11875-093Celcultuur
Niet-essentieel aminozuur (100X)ThermoFisher Scientific11140050Celcultuur
HEPESThermoFisher Scientific15630080Celcultuur
penicilline/streptomycineThermoFisher Scientific15140122Celcultuur
40 μm celzevenerCorning352340Celisolatie
PE-geconjugeerd CD80BD Biosciences557227Flowcytometrie
PE-geconjugeerd CD86BD Biosciences555665Flowcytometrie
PE-geconjugeerd PD-L1BioLegend124307Flowcytometrie
APC-geconjugeerd MHCIIMiltenyi Biotec Inc.130-112-388Flowcytometrie
APC-geconjugeerd CD11cBD Biosciences340544Flowcytometrie
Isotype-gematcht PEMiltenyi Biotec Inc.130-091-835Flowcytometrie
Isotype-gematcht APCMiltenyi Biotec Inc.130-091-836Flowcytometrie
CFSEBioLegend423801T-celproliferatie-assay
Pan dendritische cel-isolatiekitMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T-celproliferatie-assay
FcR Blocking ReagentMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T-celproliferatie-assay
Pan Dendritische Cel Biotin-Antilichaam CocktailMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T-celproliferatie-assay
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T-celproliferatie-assay
CD4+ T-celisolatiekitMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T-celproliferatie-assay
CD4+ T-cel Biotin-Antilichaam CocktailMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T-celproliferatie-assay
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T-celproliferatie-assay
ACK-lyse bufferThermoFisher ScientificA1049201BMDC differentiatie
1 ml-seringBD Biosciences309626T-celproliferatie-assay
3 ml-seringBD Biosciences309588BMDC differentiatie
25G-naaldBD Biosciences309626T-celproliferatie-assay
23G-naaldBD Biosciences309588BMDC differentiatie
BSASigma Aldrich Inc.A2058T-celproliferatie-assay
EDTAThermoFisher Scientific15575020T-celproliferatie-assay
LS-kolomMiltenyi Biotec Inc.130-042-401T-celproliferatie-assay
Pre-scheidingsfilterMiltenyi Biotec Inc.130-095-823T-celproliferatie-assay
collageenase DSigma Aldrich Inc.11088858001T-celproliferatie-assay
HBSSThermoFisher Scientific14025076T-celproliferatie-assay
ovalbumine (OVA) peptide 323–329Sigma Aldrich Inc.O1641T-celproliferatie-assay
Mouse IFN-γ TaqMan-sondeThermoFisher ScientificMm01168134_m1qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan-sondeThermoFisher ScientificMm00434165qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISAR&D systemsDY419-05ELISA
Mouse EDN-1 ELISARayBiotechELM-EDN1-1ELISA
TNF-α TaqMan-sondeThermoFisher ScientificMm00443258qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA KitR&D systemsMTA00BELISA
IL-6 TaqMan-sondeThermoFisher ScientificMm00446190qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA KitR&D systemsM6000BELISA
IL-23a TaqMan-sondeThermoFisher ScientificMm01160011qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISAR&D systemsDY1887-05ELISA
IL-4 TaqMan-sondeThermoFisher ScientificMm99999154_m1qRT-PCR
IL-10 TaqMan-sondeThermoFisher ScientificMm01288386_m1qRT-PCR
TGF-β TaqMan-sondeThermoFisher ScientificMm01178820_m1qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1-antilichaamAbcamab13248Western blotting
Anti-β-actine-antilichaamAbcam

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287(2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886(2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tolerogenic Dendritic CellsBone Marrow Derived DCsCDDO DFPA TreatmentFlow Cytometry AnalysisT Cell Proliferation AssayMagnetic Cell SortingCytokine Gene ExpressionPro Inflammatory ReductionAutoimmune Encephalomyelitis ModelImmunosuppressive Response Testing

Related Articles