Immunostimulerende Agent evaluatie: Lymfoïde weefsel extractie en injectie Route-afhankelijke dendritische cel activeren

Samenvatting

Experimentele procedures voor de verdere winning van lymfatische weefsels voor het testen van lymfoïde dendritische cel activatie worden beschreven na behandeling van een immuniteitsverhoging nanomateriaal.

Samenvatting

Voor de evaluatie van een nieuwe therapeutische agent voor immunotherapie of vaccinatie is analyse van immuun cel activatie in het lymfatische weefsel essentieel. Hier, we onderzochten immunologische effecten van een immunostimulant roman lipide-DNA in nanoparticle vorm van beheer van de verschillende routes in de muis: orale, subcutane, intranasale struikrover, intraperitoneaal en intraveneuze. Deze injecties zal direct invloed uitoefenen op de immuunrespons en oogsten van lymfatische weefsels en analyse van de activering van dendritische cellen (DC) in de weefsels zijn cruciale onderdelen van deze evaluaties. De winning van mediastinale lymfklieren (mLNs) is belangrijk maar vrij complex vanwege de grootte en de locatie van dit orgel. Een stapsgewijze procedure voor het verzamelen van de inguïnale lymfeklieren (iLN), de mLN, en de milt en het analyseren van DC activering door stroom cytometry wordt beschreven.

Inleiding

Immunologie en nanomaterialen vooruitgang hebben geleid tot een overvloed aan potentiële nieuwe therapeutische strategieën voor toepassingen in biologie, met inbegrip van de drug delivery en immunostimulation. Optimalisatie van de route van de administratie is een essentieel element beïnvloeden de effectiviteit van immunostimulerende agenten. Een immunostimulerende nanoparticle (INP) bestaande uit DNA is een nieuw ontwikkelde nano-immuun adjuvans zelf geassembleerd door microphase scheiding vanwege de amfifiele structuur van lipide-DNA¹. Daarom, protocollen voor INP met betrekking tot beheer van de materiële¹ in vivo via verschillende routes en drie procedures voor oogsten van passende weefsels zoals de inguïnale lymfeklieren (iLN), mediastinale LN (milj.), en de milt, zijn beschreven. Ten slotte, deze weefsels werden geanalyseerd voor dendritische cellen (DC) activeren, de meest krachtige presentatie van antigeen cellen in het immuunsysteem. Dit protocol kan ook worden toegepast voor de beoordeling van de antigenen, antilichamen of andere immuun hulpstoffen².

We testten de INP formulering, want het is een agent die heeft aangetoond grote belofte. INP is een Toll-like receptor 9 (TLR9) adjuvante materiaal dat bevat van nucleïnezuren, voor welke beoordeling van immunostimulation doeltreffendheid vereist is om te testen verschillende injectie methoden³. In dit verband is de stimulatie van DCs een potente eindpunt voor in vivo evaluatie. Nadat het antigeen of immunostimulerende moleculen zijn in de perifere weefsels of bloed door DCs phagocytosed, migreren deze cellen naar lymfoïde organen zoals de milt en de LNs^4,5. Dus, DC activering werd geanalyseerd in de milt, iLN en mLN van de geïnjecteerde dieren. Goed oogsten van deze weefsels is daarom ook belangrijk voor de evaluatie van de immuunrespons op een roman adjuvante of ziekteverwekkers⁵. Dergelijke weefsel oogsten is ook belangrijk voor de ontwikkeling van een nieuwe immunologische methodologie als een kankertherapie. Bovendien, dit protocol kan worden gebruikt om te controleren of de efficiëntie van andere drugs, zoals anti-menselijke immunodeficiency virus therapeutics⁶.

Protocol

Alle experimentele procedures, met inbegrip van dierlijke behandeling, offer en orgel isolatie werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de regels van de internationale Animal Care en gebruik Comité bij Shanghai volksgezondheid klinische Center en Asan Medical Center. Het studie-protocol is goedgekeurd door de respectieve commissies op de ethiek van dier experimenten op Shanghai volksgezondheid klinische Center (muis protocolnummer: SYXK-2010-0098) en Asan Medical Center (2016-02-168).

1. bereiding van materiaal

Opmerking: Een nano-adjuvans, INP, bestaat uit een drager van zelf geassembleerde lipide-DNA, namelijk U4T, en apr-motief met oligonucleotide, eCpG, was werkzaam in de huidige studie voor het testen van de route van de passende injectie voor immunotherapie en vaccinatie in muizen² . Nog belangrijker is, andere potentiële therapeutische moleculen zoals antigenen en antistoffen adjuvans agenten kunnen worden vervangen voor INP en getest met behulp van dezelfde methode die hieronder worden beschreven.

1. INP formulering,^2,,^4,7
   1. Gloeien U4T (160 µM, vervoerder) met eCpG (80 µM, met een opeenvolging van de agonist TLR9) in aanwezigheid van 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4) en MgCl₂ (2 mM). De standaard volume voor gloeien is tussen de 50 en 110 µL in een PCR-buis. Verwarm het mengsel tot 95 ° C gedurende 10 minuten en vervolgens langzaam afkoelen (1 ° C/16 min) tot 25 ° C, met behulp van een thermocycler. De onthardende protocol vereist ongeveer 2 h.
      Let op: De U4T-bevattende vloeistof is zeer schuimende en moet zorgvuldig worden behandeld.
   2. Maken van 50 µL aliquots van het INP-preparaat; gebruik 50 µL van het materiaal voor elke injectie.
      Opmerking: In het geval van 100 µL per injectie, herhaal stap 1.1 met juiste berekening van de ingrediënten.

2. algemene dier Procedures

Opmerking: Alternatieve methoden voor de behandeling van de muizen kunnen afhankelijk van de vereisten van het laboratorium en de goedgekeurde dierlijke protocollen⁸worden gebruikt. Het type van muizen gebruikt is 6-week-oude C57BL/6 en vrouwelijke muizen.

1. Materiaallijst
   1. De vloeibare verdoving (Isofluraan), verdoving machine, kooldioxide (CO₂) inademing chamber, gesteriliseerd gaas, pincet, muis afdekking, handschoenen, verslaafd pincet, 1-inch ontleden schaar, 2-inch ontleden schaar, alcohol voor te bereiden sterilisatie, en insuline spuiten.
2. Inhalant anesthesie
   Opmerking: Anesthesie is verplicht voor intranasale, subcutane, struikrover, en intraveneuze injecties van muizen⁹. Een inductie-kamer met een vaporizer-machine en zuurstof-tank aangesloten wordt gebruikt voor deze procedure.
   1. Plaats het dier in de kamer van de inductie en zorg ervoor dat strak sluit het deksel.
   2. Stromen van de zuurstof op 1 L/min en de vaporisator instellen op een niveau van de inductie van 4% voor Isofluraan.
   3. Variëren de belichtingstijd van dieren in de kamer afhankelijk van dierlijke gewicht; echter, meer dan 10 s van blootstelling en het toezicht op elke 5 min voor anesthesie¹⁰noodzakelijk is.
      Opmerking: Geen pedaal reflex geeft succesvolle anesthesie.
   4. Uitschakelen van de spoel Isofluraan en stromen van 1 L/min. van zuurstof om te voorkomen dat personeel Isofluraan gas.
3. Offer
   1. Voorbereiden op een kamer CO₂ inademing offer volgens de NIH "richtsnoeren voor euthanasie van knaagdieren met behulp van kooldioxide"¹¹.
4. Test gag reactie om te bevestigen dat het dier volledig wordt opgeofferd.
   1. Controleer of dat de muis correct wordt opgeofferd door knijpen op het uiteinde van de voet en de bevestiging van geen grap-reactie. Als er een reactie, herhaal stap 2.2.
5. Desinfectie
   1. Desinfecteer alle oppervlaktes gebruikt voor injecties of dissecties met alcohol spray en gesteriliseerd gaas.
6. Orgel-opslag
   1. Gebruik pincet te verwijderen alle vet en bloed rond de geoogste organen. Deze geoogste weefsels individueel opslaan in een petrischaal gevuld met 3 mL PBS. De container en de media kunnen verschillen afhankelijk van de vereisten van de vervolgprocedure.

3. injectie Routes

1. Gebruik de zes injectie methoden te onderzoeken van injectie-afhankelijke immuunrespons: orale, subcutane, intranasale struikrover, intraperitoneaal, en intraveneuze^8,12,13.

4. isolatie van lymfklieren en de milt

Opmerking: Gebruik jong en gezond mager muizen (6 weken oud) voor deze procedures, omdat de vetten die meestal opgebouwd rond de lymfklieren in oudere muizen moeilijk te zijn verwijderen en kunnen voorkomen dat goede visualisatie van het orgel.

1. Vooraf oogsten stappen
   Opmerking: Deze sectie beschrijft het na injectie oogsten van de iLN, milt en mLN van muizen voor het analyseren van immuun stimulatie. Verwijzen naar stappen 2.3-2.5 voor offer, gag respons, en ontsmetting methoden.
   1. De ledematen van de muis op het bord van de chirurgische schuim PIN en steriliseren van de ventrale zijde van de muis met 70% ethanol.
   2. Kies een locatie 2 cm boven de schaamstreek en gebruik verslaafd Tang te trekken van de buitenhuid cover zoals een tent. Maken van een vermindering van ongeveer 1 cm op deze locatie en schuif de schaar (2-inch) onder de huid, waardoor verdere dissectie bezuinigingen.
   3. Voor de omhulling, snijden verticaal door de buitenhuid met beide takken van de schaar (2-inch). De inwendige organen bedekt met buikvlies bloot.
   4. PIN de buitenste laag van de huid.
2. Isolatie van de inguïnale lymfeklieren (iLN)
   1. Zoek de iLN aan de linker kant van het been na de combinatie van het bloedvat naar beneden het linker been, die wordt weergegeven als een gekantelde letter 'Y'.
      Opmerking: Voor subcutaan ingespoten muizen, kiest u een iLN op dezelfde kant van de locatie van de injectie.
   2. Ontdek de laag met twee pincet te rippen van de overdekte lipide-laag en de oogst van de bleke geel iLN (Boon vorm, 2 mm). Zie stap 2.6 voor latere bewerking en opslag van het weefsel wordt.
3. Isolatie van de milt ¹⁴
   1. Maak een tent in het midden van het buikvlies via verslaafd pincet in de ene hand en gebruik kleine dun schaar (1 inch) in de andere hand te snijden het buikvlies.
   2. Gebruik verslaafd pincet in de linkerhand wegknipt het over te vinden van de rode bean-achtige milt (lengte van ongeveer 14 mm) gekoppeld aan de linker bovenzijde van de buik van de muis te begrijpen van de darm.
   3. Trek voorzichtig uit de milt met een andere set van pincet in de rechterhand terwijl het loskoppelen van andere organen met het verslaafd pincet. Volg stap 2.6 voor het opslaan van de milt.
      Opmerking: Zorg is vereist bij het verzamelen van de milt, zoals het is een gemakkelijk beschadigd zachte orgaan.
4. Isolatie van de mediastinale lymfeklieren (milj.)
   Opmerking: De mLN is ongeveer 1 cm onder de ribben gelegen en is verzekerd door andere organen zoals het hart en de longen. Vanwege de locatie en de kleine grootte is het belangrijk om zorgvuldig de omgeving met behulp van Tang en schaar (1-inch) bloot te stellen.
   1. Knip het middenrif en het loskoppelen van de ribben. Houd het lichaam van de ribben met een tang en snijd vervolgens de linker- en rechterzijde van de ribben met een schaar (1 inch). PIN de cutoff ribben over de schouder van de muis op het recht op het blootstellen van het hart en de longen.
      Opmerking: Wees voorzichtig niet te knippen om het even welk van de bloedvaten rond het hart en de longen, zoals lekken van bloed maakt het erg moeilijk om te vinden van de kleine doorschijnend mLN. Als bloedvaten zijn afgesneden, zachtjes absorberen het bloed in het gebied met gaas.
   2. Met behulp van verslaafd pincet in de rechterhand, spiegelen het hart en de longen zachtjes naar rechts totdat de ruggengraat wordt blootgesteld. Gebruik een paar normale pincet in de linkerhand te verwijderen van de iLN met de verslaafd pincet in de rechterhand om te helpen met deze oogsten.
   3. Pak de longen en spiegelen ze totdat de ruggengraat wijd wordt blootgesteld. De mLN (een doorschijnend boonvormige structuur van ongeveer 2 mm groot) is gelegen tussen de longen en de wervelkolom.
   4. Gebruik maken van de verslaafd verlostang om het gebied rond de mLN bloot te stellen en de andere verlostang uitpakken van het weefsel.
      Opmerking: De mLN is omgeven door talrijke andere weefsels die zorgvuldig moeten worden verwijderd met een tang vóór oogst.
   5. Zie stap 2.7 voor instructies over het opslaan van de geoogste mLN.

5. bereiding van de monsters voor stroom cytometry

Opmerking: Om de activering van DCs in de geoogste iLN, milt en mLN assay, eencellige schorsingen van deze weefsels zijn gekleurd met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen als DC-specifieke markers, co-stimulatory moleculen, en grote histocompatibility complex moleculen en geanalyseerd door stroom cytometry.

1. Voorbereiding van eencellige schorsingen: milt
   1. Voeg 5 mL van de verse kweekmedium (CM) in 6-mm cultuur schotel en plaats de monsters op ijs.
   2. Verwijder van omliggende weefsels van bloed en vet en plaats het weefsel in het deksel van de schotel cultuur.
   3. Snijd van de weefsels in kleine fragmenten (< 1 mm) met een gebogen schaar. Opschorten van de fragmenten in PBS gevolgd door spinnen omlaag het weefsel met behulp van een centrifuge op 646 × g gedurende 5 minuten en de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
   4. Opschorten van de monsters weer in 3 mL CM en verteren de fragmenten met 200 µL van oplossing van 2% foetale runderserum (FBS) aangevuld met collagenase IV voor 20 min.
   5. Voorzichtig schudden en Incubeer het monster bij 37 ° C voor 1 h. filteren de verteerd weefsels via nylon gaas (100 nm) en draai ze naar beneden. Wassen van de afzonderlijke cellen in 5 mL PBS en verwijder de bovendrijvende vloeistof door middel van centrifugeren.
   6. Resuspendeer de cellen in 5 mL cel isoleren oplossing. Re-vracht naar een andere laag van 5 mL cel wissen isolatie-oplossing voor het vormen van een waterige laag-voor-laag stapel.
   7. Centrifugeer het preparaat van de cel bij 2012 × g voor 10 min. verkrijgen het supernatant, oftewel de lichtere fractie dichtheid (< 1.077 g/cm³), voor latere stroom cytometry analyse.
   8. Het aantal cellen met een hemocytometer.
2. Voorbereiding van eencellige schorsingen: lymfeklier
   1. Volg stap 5.1.1-5.1.2.
   2. Voeg 5 mL van de CM met behulp van een pipet 10 mL tot schorsing van de cellen door pipetteren 3 - 4 keer. Na grondig schorsing gebruiken de gewenste cellen, steriele nylon gaas voor het filteren van de cellen voor collectie in een conische buis 15 mL.
   3. Draai de cellen naar beneden bij 646 ×g gedurende 7 minuten bij 4 ° C en de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
   4. Voeg een extra 5 mL van CM in 10 mL pipet op te schorten beter de cellen door pipetteren.
   5. Wassen met PBS en het aantal cellen tellen.
3. Stroom cytometry analyse
   1. Aliquot 0,5-1 × 10⁶ cellen in elke fluorescentie-activated cell sorting (FACS) buis.
   2. Centrifugeer bij 646 × g bij 4 ° C gedurende 5 minuten en het supernatant gecombineerd.
   3. 5 µL van elk verdund fluorescentie-geconjugeerde antilichaam voorbereiding aan de cellen resuspendeer de pellet van de cel en de vortex toevoegen.
      Opmerking: Het is belangrijk dat de cel pellet van lichte blootstelling zoveel mogelijk beschermen omdat fluorescently gelabelde antilichamen lichtgevoelig zijn. Genereren van een antilichaam master mix en altijd Fc blok toevoegen.
   4. Bereiden FACS buffer met behulp van 100 µL van PBS, 1% van de warmte-geïnactiveerd regelmatige FBS en 0,1% natriumazide.
   5. Leg het monster in de buis bij 4 ° C gedurende 30 min. spoelen de cellen met 2-4 mL FACS buffer en Centrifugeer het monster van 1700 toeren per minuut gedurende 7 minuten bij 4 ° C.
   6. Resuspendeer de cellen in 500 µL van FACS buffer in het donker. Het analyseren van de cellen door stroom cytometry.

Resultaten

Om te beoordelen van passende injectie routes van INP voor lymfatische weefsel DC activering, de DC-bevolking als geslacht werd gedefinieerd als ^-CD11c⁺ cellen in de milt, iLN en mLN en de niveaus van de expressie van co-stimulatory moleculen geanalyseerd. Behandeling van INP door onderhuidse (sc) en intraveneuze (IV) injectie bevorderd aanzienlijke stijgingen van de interactie CD40 CD80 en CD86 uitdrukking in de milt en iLN DCs (

Discussie

Veel vooruitgang in nanotechnologie en immunologie hebben bereikt door middel van therapeutische onderzoek voor drug delivery en immunostimulation. Zorgvuldige selectie van de injectie-methode is bekend als belangrijk voor immunostimulation, die was de focus van de huidige studie.

Verschillende injectie routes werden geëvalueerd voor een natuurlijk niet-giftige en biologisch afbreekbare op basis van DNA materiaal, INP (immunostimulerende nanoparticle), om te bepalen welke route het beste resul...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materiaal
fosfaat bufferoplossing zout	Corning	21-040-CVR	Organen wassen
(PBS, pH 7,4)
isofluraanoplossing	Aesica Queenborough limited	26675-46-7	Anesthesieproces
Tuberculin 1mL spuit -	Junglim	N/A	Injectie
50 mL conische buis	S.P.L	50050	Anesthesieproces
1mL Insuline spuit	(BD Ultra-FineTM­II)_korte naald	324826	Intramusculaire injectie
DMEM Hoge Glucose	Hyclone	SH30081.01	Organen opslaan
Histopaque	Sigma-Aldrich	10771	FACS analyse
Ethyl alcohol anhydrisch 99,5 %	Daejung	4022-4110	Ontsmettingsmiddel
Apparatuur
FineCycler C100 (Thermocycler)	Ssufine	-	Anealing
Centrifuge			Centrifuge
FACS buis	FALCON	2052	FACS analyse
Geautomatiseerde hoge prestatie flowcytometer	BD (USA), FACSVerse	-	FACS analyse