Licht vel microscopie voor driedimensionale visualisatie van menselijke Immune cellen

Summary

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren van immune cellen die zijn ingesloten in een matrix van de driedimensionale (3D) collageen met behulp van licht vel microscopie. Dit protocol wordt ook ingegaan hoe bijhouden van cel migratie in 3D. Dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten schorsing cellen in de 3D-matrix.

Abstract

In vivo, activering, proliferatie en functie van alle immuuncellen optreden in een driedimensionale (3D) omgeving, bijvoorbeeld in de lymfeklieren of weefsels. Up to date afhankelijk meeste in vitro systemen van tweedimensionale (2D) oppervlakken, bijvoorbeeld cel-cultuur platen of coverslips. Optimaal mimic fysiologische omstandigheden in vitrogebruiken we een eenvoudige 3D collageen-matrix. Collageen is een van de belangrijkste componenten van de extracellulaire matrix (ECM) en is wijd verbeid gebruikt voor het vormen van 3D-matrices. Voor 3D-beeldbewerking, wordt de technologie van de onlangs ontwikkelde licht vel microscopie (ook enkel vliegtuig verlichting microscopie genoemd) gekenmerkt met de overname van de hoge snelheid, grote indringingsdiepte, lage bleken en fototoxiciteit. Licht vel microscopie is bovendien bijzonder voordelige voor lange termijn meting. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde protocol hoe te zetten en behandelen van menselijke immune cellen, bijvoorbeeld primaire menselijke cytotoxische T-lymfocyten (CTL) en natural killer (NK) cellen in de matrix van de 3D collageen voor gebruik met de licht-blad microscopie voor levende cellen beeldvorming en vaste monsters. De procedure voor Beeldacquisitie en analyse van cel migratie worden gepresenteerd. Een bijzondere aandacht is besteed aan het wijzen op kritische stappen en factoren voor de bereiding van de monsters en data-analyse. Dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten schorsing cellen in een matrix van 3D collageen en is niet beperkt tot immune cellen.

Introduction

Meeste kennis over het migreren van cellen afkomstig van 2D experimenten^1,2,3, die normaal gesproken worden uitgevoerd in een glas of plastic oppervlak voor een cultuur/imaging schotel. Een fysiologische scenario vereist echter, in de meeste gevallen een 3D communicatie, die de extracellulaire matrix (ECM) een beslissende rol speelt. ECM biedt niet alleen de 3D structuur essentieel belang zijn voor het handhaven van de juiste cel morfologie maar biedt ook overleving signalen of directionele signalen voor een optimale werking van veel cellen^4,

Protocol

Onderzoek uitgevoerd voor deze studie met de menselijk materiaal (leukocyte reductie systeem chambers van menselijk bloeddonoren) is geautoriseerd door de lokale ethische Commissie (verklaring van 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) en de desbetreffende richtsnoeren volgt.

1. bereiding van geneutraliseerde collageen-oplossing (500 µL)

1. Breng 400 µL van gekoeld collageen stockoplossing (10.4 mg/mL) tot een steriele 1,5 mL koker onder de motorkap van cel cultuur. Voeg langzaam 50 µL van 10 x PBS (pH 7.0-7.3) tot 400 µL van gekoeld collageen stockoplossing gekoeld. Meng de oplossing door zachtjes het betegelen van de buis.

Results

Uitsteeksel formatie tijdens T-cel migratie is een uiterst dynamisch proces, dat actine afhankelijk is. Om te visualiseren uitsteeksel vorming van primaire menselijke CTL, transfected we Transient een mEGFP gesmolten eiwit om het cytoskelet actine in CTL zoals beschreven voor¹¹van een label. Een dag na de transfectie, werden de cellen ingesloten in de collageen-matrix. Afbeeldingsstapels werden verworven elke 40 s met een stap grootte van 1 µm bij 37 ° C met behulp.......

Discussion

Meeste in vitro tests worden uitgevoerd op een 2D oppervlak, bijvoorbeeld in celkweek platen, petrischalen of op coverslips, terwijl in vivo cellen, met name de immuuncellen, meestal een 3D communicatie ervaren. Opkomende bewijs toont aan dat migratiepatronen van immune cellen tussen 2D en 3D scenario's^{17 verschillen}. Bovendien zijn de expressieprofielen van tumorcellen ook verschillend in 2D - en 3D-gekweekte weefsels^18,19

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibricol, bovine collagen solution	Advanced Biomatrix	#5133-20ML	Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution	Merck	1091381000	for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose	Affymetrix	32821-10GM	Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit	Thermo Fisher	11348D	Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation	Thermo Fisher	11132D	Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2	Thermo Fisher	PHC0023	Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit	Lonza	V4XP-30XX	Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Thermo Fisher	A22284	IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Thermo Fisher	C10045	Fluorescent cell label
Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline	Thermo Fisher	14190250	IF
Bovine serum albumin	Sigma	A9418-100G	IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit	Thermo Fisher	A-11011	IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)	Zeiss	N.A.
Cell culture hood	Thermo Fisher	HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i	Thermo Fisher	N.A.
Centrifuge 5418 and 5452	Eppendorf	N.A.
Pippettes	Eppendorf	3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips	VWR	89079-444, 89079-436, 89079-452
15 mL tubes	Sarstedt	62.554.002
Capillaries 50 µL	VWR (Brand)	613-3373	Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries	VWR (Brand)	BRND701934	"Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips	Merck	1095430001	to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes	BD	Z230723 ALDRICH	Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)	Play-Doh	N.A.
Imaris file converter	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	Analysis of 3D and 4D imaging data