Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Fabricage van kleurovergang Nanopattern door thermische Nanoimprinting techniek en Screening van de reactie van menselijke Endothelial kolonie-vormende cellen

7.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57661

⸱

1 juli 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de fabricage van kleurovergang nanopattern platen via thermische nanoimprinting en de methode van het screenen van reacties van menselijke endotheliale voorlopercellen op de nanostructuren. Met behulp van de beschreven technologie, is het mogelijk om te produceren van een steiger die fysieke stimuli cel gedrag kunt bewerken.

Samenvatting

Nanotopography kan worden gevonden in verschillende extracellulaire matrices (ECMs) rond het lichaam en is bekend dat belangrijke regelgevende acties op cellulaire reacties. Het is echter moeilijk om te bepalen van de relatie tussen de grootte van een nanostructuur en de reacties van de cellen als gevolg van het gebrek aan goede screening tools. Hier, laten we de ontwikkeling van reproduceerbaar zijn en kosteneffectieve verlopende nanopattern platen voor het manipuleren van cellulaire reacties. Met behulp van anodic aluminium oxide (AAO) als een meester mal, verlopende nanopattern platen met nanopillars van toenemende diameter bereiken [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) en 280-360 nm (GP 280/360)] werden vervaardigd door een thermisch inprenting techniek. Deze verlopende nanopattern platen werden ontworpen om na te bootsen de verschillende maten van nanotopography in de ECM en werden gebruikt om het scherm van de antwoorden van menselijke endothelial kolonie-vormende cellen (hECFCs). In dit protocol beschrijven we de stapsgewijze procedure voor het fabriceren van de gradiënt nanopattern platen voor cel engineering, technieken voor het cultiveren van hECFCs uit menselijk perifere bloed en kweken van hECFCs op nanopattern platen.

Inleiding

Onlangs, heeft de reactie van cellen door de fysieke stimulatie van oppervlakte topografie schijnwerpers geweest op het gebied van cel engineering1,2,3,4. Daarom geweest meer aandacht gericht op driedimensionale nanostructuren op de oppervlakte van cel bijlage5. Er werd gemeld dat het integrine, oftewel het oppervlak erkenning apparaat van de cel, de fysieke prikkel gedreven door de structuren van de micro-nano voor ECM t/m mechano-transductie6 verzendt. Deze mechanische stimulatie cel gedrag via contact begeleiding7 reguleert en induceert cytoskeletal reorganisatie om vorm, naast focal verklevingen en stijfheid van cellen8te veranderen.

Menselijke endotheliale voorlopercellen (hEPCs) in het lichaam werken nauw met de communicatie van de omliggende ECM-9. Dit geeft aan dat de fysische toestand van de ECM als een belangrijke parameter voor specifieke cel-matrix hechting complexvorming fungeert zoveel schuifspanning afgeleid van bloed stroom10. Het is gemeld dat de oppervlakte nanotopography de in vitro -vorming van uitgebreide capillair netwerken van hEPCs11 verbetert en dat een ECM/bio-oplosbare factor gecombineerd systeem kunt hEPCs om te herkennen van dysfunctionele substraten en bevordert wond genezing12,13. De relatie tussen ECM en hEPCs is echter duidelijk niet begrepen.

Hoewel veel onderzoekers geprobeerd te verduidelijken van de relatie tussen cel reacties en fysieke signalen van verschillende substraten14,15,16, deze studies gebruikt alleen de vaste grootte van een nanostructuur of nanopatterns met onregelmatige regelingen die een beperking tot verheldering van de relatie tussen de grootte van de cel en nanostructuur gedrag hebben. Het probleem hier is een gebrek aan geschikte instrumenten voor het screenen van cellulaire reacties die bestaande vervelend en iteratieve benaderingen om te zoeken naar de optimale omvang van de nanostructuur kunnen vervangen. Daarom is een eenvoudige techniek is vereist voor het screenen van cel reacties op fysieke stimulaties zonder herhaling.

Hier beschrijven we een methode die wordt gebruikt in onze vorige verslagen17,18,19 te produceren een kleurovergang nanopattern waarin de diameter van de gearrangeerde nanopillars geleidelijk verhoogt. Bovendien, beschreven we ook hoe te cultiveren en analyseren het gedrag van hECFCs op kleurovergang nanopattern platen om te bepalen van het effect van fysieke stimuli op de cellen. Een milde anodisatie, geleidelijke etsen en anti-steken laag coating methode werden gebruikt om het fabriceren van kleurovergang AAO schimmel. Door het aannemen van een thermisch inprenting lithografie techniek, werden identiek polystyreen verlopende nanopatterns geproduceerd op een kosteneffectieve en facile manier. Kleurovergang nanopatterns gebruikt, is het mogelijk om te bepalen welke grootte van nanostructuur heeft een groot effect op het gedrag van de cel in een set van experiment. Wij verwachten dat dit verloop nanopattern zal nuttig zijn bij het begrijpen van de mechanismen van de interactie tussen bloed-afgeleide hECFC of andere cellen en verschillende maten van nanostructuren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele Review Board op Korea Anam universiteitsziekenhuis (IRB nr. ED170495). Alle procedures werden verricht overeenkomstig de verklaring van Helsinki en de latere wijzigingen ervan.

1. bereiding van aluminium (Al) substraat door het elektrolytisch polijsten

Let op: Elektrolytisch polijsten oplossing is bijtende en giftige. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen zoals nitril handschoenen, bril en laboratoriumjas. Voer deze stap uit in een zuurkast.

  1. Bereid elektrolytisch polijsten-oplossing door het mengen van ethyl alcohol (C2H5OH, 99,9%) en perchloorzuur (HClO4, 60%) in een bekerglas van 1 L dubbele mantel (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. De dubbele mantel bekerglas verbinden met een rondpompthemostaat en de temperatuur instellen bij 7 ° C. Zet het bekerglas dubbele mantel op een magneetroerder. Laat de oplossing onder roeren gedurende ten minste 30 minuten, totdat de temperatuur tot 7 ° C. daalt
  3. Dompel de plaat Al ultrazuiver (99,999%, 20 × 50 × 1 mm3) en koolstof teller-elektrode in de oplossing van de elektrolytisch polijsten crocodile clips en koperdraad gebruiken. Pas de positie van de Al-plaat en de koolstof teller elektrode aan tegenover elkaar staan.
    Opmerking: Het is nodig om te installeren van de clips zorgvuldig om niet te raken van de oplossing. Bij aanraking met de oplossing, kunnen de clips uit voortvloeiende onzuiverheden besmetten de plaat Al.
  4. De plaat Al verbinden met de positieve aansluitklem en koolstof teller elektrode naar de negatieve terminal, van een gelijkstroom (DC) voeding.
  5. Uitschakelen van de magnetische roerder en een voedingsspanning van 20 V. behouden deze staat voor 4 min van toepassing.
  6. Zet op de magneetroerder, en laat de huidige stroom voor een ander 6 min.
    Opmerking: De rusttoestand verwijdert de meeste van de onzuiverheden en de ruwheid van de Al-plaat, en de dynamische toestand verbetert de uiteindelijke kwaliteit van elektrolytisch polijsten.
  7. Uitschakelen van de voeding en de plaat Al van de clip handmatig te scheiden. Grondig wassen de plaat Al met gedeïoniseerd water te verwijderen van alle resterende oplossing.
  8. Droog de plaat Al met stikstof en opslag onder inert gas. Het gedrag van deze droogproces aan het einde van alle experimenten in stap 1 en 2.
    Opmerking: Bij het injecteren van perslucht, maken de luchtstroom van het gepolijste deel aan de andere kant. In het tegenovergestelde geval, kunnen onzuiverheden ontsnappen uit het gedeelte niet-gepolijst en besmetten de plaat Al.

2. fabricage van kleurovergang AAO schimmel met fosforzuur elektrolyt

Let op: Methylalcohol en de rook zijn oogbeschadigingen en/of giftig. Voortdurende blootstelling aan chroom kan leiden tot ernstige chroom vergiftiging. Voer deze stap uit in een zuurkast.

  1. Primaire anodisatie
    1. Om voor te bereiden 1 L van fosforzuur elektrolyt, 590 mL gedeïoniseerd water in een glazen fles te laden.
    2. Voeg 400 mL methylalcohol (CH3OH, 99%) en 10 mL fosforzuur (H3PO4, 85%) in de fles. Meng de oplossing goed door schudden handmatig of met magnetische roeren.
    3. Giet 500 mL van de elektrolyt in een bekerglas van 1 L dubbele mantel. Dompel de gepolijste Al plaat en koolstof teller elektrode in de oplossing met crocodile clips en koperdraad.
    4. Giet extra elektrolyt om te zoeken op de grens van elektrolytisch polijsten 2-3 mm boven het oppervlak van de oplossing.
      Opmerking: Als anodisatie wordt uitgevoerd met de grens van elektrolytisch polijsten aanraken van de oplossing, neiging de plaat Al om te branden tijdens de anodisatie.
    5. Installeer een verticale as op een U-vormige voetstuk. Sluit een Bovenroerder en waaier met metalen klemmen. Plaats de schroef van de waaier in de buurt van de onderkant van beide elektroden. Stel de rotatiesnelheid van de Bovenroerder tussen 200 en 300 rpm.
    6. De dubbele mantel bekerglas verbinden met een rondpompthemostaat en de temperatuur instellen bij-10 ° C. Verlaten van het systeem gedurende ten minste 1 uur onder roeren totdat de temperatuur tot-10 ° C. daalt
      Opmerking: Gebruik geen water als de koelvloeistof. Omdat het water bij lage temperaturen bevriest, zal het verkeer niet normaal werken. Het is aanbevolen om het gebruik van een mengsel van water en ethylalcohol op een verhouding van 1:1 als de koelvloeistof.
    7. Toepassing van een spanning van 195 V onder roeren voor 16 h.
      Opmerking: Als de huidige meer dan 50 stijgt mA binnen 2 of 3 h na het toepassen van de spanning, de kans dat verbranding plaatsvindt is zeer hoog. Onmiddellijk stoppen met het proces en de plaat Al vervangen door een nieuwe. Als dit probleem zich herhaaldelijk voordoet, Controleer of er geen afwijking in de temperatuurregeling van de rondpompthemostaat. Als er geen afwijking is, veranderen de elektrolyt.
    8. Stop de voeding en de plaat Al van de clip handmatig te scheiden. Wassen van de geanodiseerde plaat van het Al met gedeïoniseerd water te verwijderen van alle resterende oplossing.
  2. Aluminiumoxide etsen
    1. Bereiden chroomzuur etsen oplossing door ontbinding van 9.0 g chroom oxide (CrO3) en 20,3 mL fosforzuur (H3PO4, 85%) in 500 mL gedeïoniseerd water.
    2. Giet de etsen-oplossing in het bekerglas van 1 L dubbele mantel. Stel de temperatuur van 65 ° C.
    3. Dompel de geanodiseerde plaat van het Al in de ETS-oplossing voor ten minste 10 uur onder roeren. Het zegel van de bovenkant van het bekerglas af met aluminiumfolie.
    4. Spoel de geëtste plaat Al verschillende malen met gedeïoniseerd water.
  3. Secundaire anodisatie
    1. Stel de dezelfde proefomstandigheden als stap 2.1.1 tot en met 2.1.7.
    2. De geëtste plaat Al aan de anode van het systeem laden en toepassen van een spanning van 195 V voor 6 uur. Vervolgens schakelt u de stroomvoorziening en handmatig de plaat Al te scheiden van de clip. Onmiddellijk wassen de geanodiseerde plaat van het Al met gedeïoniseerd water.
      Opmerking: Wanneer de tijd van wassen is vertraagd, verhoogt de poriegrootte van AAO ongewild als gevolg van de resterende fosforzuur.
  4. Kleurovergang porie verbreding
    1. Bereid een porie verbreding oplossing door ontbinding 5.765 g van fosforzuur in 500 mL gedeïoniseerd water. Giet de oplossing in een bekerglas van 1 L dubbele mantel.
    2. De dubbele mantel bekerglas verbinden met de rondpompthemostaat en stel de temperatuur van 30 ° C. Plaats een lineaire bewegende stadium verticaal naast het bekerglas. Bevestig een beugel aan het bewegende deel van de lineaire fase.
    3. Stel het bewegende deel van de lineaire etappe op de home positie. Bevestig de clip aan de beugel en de geanodiseerde plaat van de Al te laden.
    4. Manipuleren de stand van de plaat Al handmatig zodat de plaat Al recht boven het oppervlak van de oplossing zal komen.
      Opmerking: In deze stap moet de plaat Al de oplossing niet aanraken. De porie verbreding proces begint zodra de plaat Al de oplossing bereikt.
    5. Geleidelijk het onderdompelen van de plaat Al in de oplossing bij een snelheid van 4.86 µm/s voor 120 min te maken van een mal AAO 35 mm met een grootte verloop van 120 nm tot 200 nm (GP 120/200). Start een stopwatch op het moment dat de plaat Al het oppervlak van de oplossing raakt.
    6. Onderdompelen om GP 200/280 en GP 280/360 mallen, het hele gebied van GP 120/200 schimmel in de porie verbreding oplossing voor 2 of 4 h, respectievelijk.
    7. Spoel de kleurovergang plaat Al verschillende malen met gedeïoniseerd water.

3. de afzetting van anti-steken laag op kleurovergang AAO mal met zelf geassembleerde enkelgelaagde

Opmerking: Voer stappen 3.2.1 aan 3.3.3 in een handschoenenkastje. Sluit een vacuümpomp en droge stikstof gas injector aan het handschoenenkastje. Plaats alle monsters, reagentia en toestellen in het handschoenenkastje voorafgaand aan het proces van de bevochtiging. Herhaal de evacuatie en stikstof gas injectie cyclus meer dan drie keer voldoende om vocht te verwijderen uit het handschoenenkastje. Laat de droge stikstof stromen door het experiment.

  1. Hydroxyl wijziging van AAO schimmel met Piranha behandeling
    1. Giet 140 mL zwavelzuur (H2SO4, 95%) in een bekerglas van polytetrafluorethyleen (PTFE). Voeg 60 mL waterstofperoxide dropwise (H2O2, 30%). Laat het gedurende 30 minuten tot de oplossing is afgekoeld.
      Let op: Wees uiterst voorzichtig bij het maken van Piranha-oplossing. Vanaf het moment van het toevoegen van waterstofperoxide, de oplossing krachtig kookt en genereert hoge temperaturen. Het experiment uit te voeren in een zuurkast.
    2. Dompel de AAO schimmel in de oplossing voor 30 s met behulp van een pincetten.
    3. Spoel de mal AAO verschillende malen met gedeïoniseerd water. Geniet van de schimmel in gedeïoniseerd water gedurende 30 minuten en zet het in methylalcohol voor een andere 30 min.
      Let op: Bij het verwijderen van de gebruikte Piranha-oplossing, Verdun de oplossing met een overvloedige hoeveelheid kraanwater.
    4. Volledig droog de AAO schimmel onder drukvermindering voor 3u.
  2. Voorbereiding van 20 × HDFS stockoplossing
    Opmerking: HDFS is een afkorting van (heptadecafluoro-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) dimethylchloro-siliciumwaterstof
    1. Vul een-derde van een fles 1 L n-hexaan met moleculaire zeven. Sluit de fles met paraffine film en op te slaan onder droge stikstof gedurende 24 uur.
    2. De 200 mL n-hexaan met behulp van een glazen injectiespuit en 0,2 µm PTFE spuit filter filteren.
    3. Giet de 80 mL van gefilterde n-hexaan in een 100 mL glazen fles. Voeg toe 2 mL HDFS.
  3. Zelf geassembleerde enkelgelaagde depositie
    1. Laden 57 mL van gefilterde n-hexaan in een bekerglas van 100 mL. De schimmel AAO onderdompelen in het oplosmiddel.
    2. Voeg 3 mL van de stockoplossing HDFS aan de n-hexaan om 2.9 mM HDFS oplossing te maken. Wacht 10 min. voor de reactie om verder te gaan.
    3. De schimmel AAO overbrengen in verse n-hexaan. Sluit en verzegel alle reagens flessen. Sluit de klep van de stikstof en monsters van het handschoenenkastje uitlichten.
      Opmerking: HDFS is zeer gevoelig voor vocht. Bewaar alle reagentia die HDFS in een exsiccator bevatten.
    4. Geniet van de mal AAO in 60 mL methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99%). Corrosiebestendige schoon de schimmel AAO in een bekerglas voor 10 s per één keer te verwijderen fysiek geadsorbeerde HDFS moleculen. Herhaal de schoonmaak procedure 10 keer.
      Opmerking: De schimmel AAO aan ultrasone bloot voor een lange tijd zonder intervallen beschadigt de oxide-laag.
    5. Volledig droog de AAO schimmel onder drukvermindering gedurende 24 uur.
      Opmerking: Een succesvol gedeponeerde anti-steken laag is super waterafstotende en stabiele maandenlang wanneer opgeslagen in een exsiccator. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

4. fabricage van kleurovergang Nanopattern platen door thermische inprenting

Opmerking: Voer stappen 4.2 tot 4,7 in een schone kamer.

  1. Snijd een 1.1 mm dikke polystyreen blad tot een grootte van 2.9 mm breed door 3.7 mm lang met behulp van een cutter printed circuit board (PCB).
  2. Snijd de AAO mal 35 mm vanaf de onderkant met behulp van een nipper. Markeren het monster naam en datum van fabricage op de achterkant.
  3. Schoon een 8.0" wafer met een kleine dosis van ethylalcohol. De polystyreen platen op de wafer zet, dan mount de AAO-schimmel.
  4. Zet de bodem film in de lade van een thermische imprinter. Sluit de bovenste film aan de pakking.
  5. Zet het zegel op de bodem film. Plaats de pakking op het zegel. Zorg ervoor dat er geen stof op de wafer.
  6. Sluit de lade van de thermische imprinter. Toepassen van 165 ° C van warmte en 620.52 kPa druk voor 100 s.
  7. Koel aan kamertemperatuur monster. Draai zachtjes de polystyreen blad om de AAO schimmel vrij te geven.

5. sterilisatie en hydrofiele wijziging van kleurovergang Nanopattern platen

  1. Plaats de nanopattern platen op een vierkante schotel. Giet 100 mL 70% ethylalcohol en blootstellen aan ultraviolet licht voor 30 min.
  2. Droog de nanopattern platen met stikstof. De nanopattern platen overbrengen in een generator van de plasma zuurstof.
  3. Evacueren van de zaal, totdat zij 1,33 tot Pa. Vervolgens, injecteren zuurstof met een snelheid van 30 cm3/min. een radiofrequentie stroomtoevoer van 60 W. behouden het plasma van de zuurstof voor 90 s.
    Opmerking: Het is aanbevolen om gebruik van plasma-behandeld nanopattern platen binnen 14 dagen.
  4. Bevestig de plaat van de nanopattern naar de onderkant van een cel cultuur schotel met behulp van een daling van tolueen.
  5. Zegel van de monsters in een zakje en steriliseren met lage-temperatuur plasma sterilisator.

6. teelt van hECFCs

Opmerking: Het gedrag van alle centrifuging procedures bij 4 ° C tenzij anders vermeld.

  1. Voor het isoleren van het perifere bloed Incubeer mononucleaire cellen (PBMCs), een collageen beklede 12-well cultuur schotel bij 37 ° C gedurende 1 uur.
  2. Wassen van de 12-well cultuur schotel met behulp van 1 × steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. Verzamel 50 mL van menselijk bloed met behulp van een buis van heparine-remmer.
  4. Zet 6 mL hydrofiele polysaccharide oplossing in een tube van 15 mL en voeg 8 mL bloed aan de hydrofiele polysaccharide oplossing.
    Opmerking: Pipetteer langzaam het bloed in de hydrofiele polysaccharide oplossing.
  5. Centrifugeer de buis bij 1020 x g gedurende 20 min naar de pellet van de cellen.
  6. Oogst van de ondoorzichtige cellaag en overbrengen naar een nieuwe tube van 15 mL.
  7. Toevoegen van 10% foetale runderserum (FBS)-opgenomen PBS en centrifugeer de buis bij 1020 x g gedurende 10 minuten aan het einde van de cellen.
  8. Verwijder het supernatant en voeg van rode bloedcellen lysis-buffermengsel. Houd op ijs gedurende 5 minuten.
  9. Voeg 10% FBS-opgenomen PBS en centrifugeer de buis bij 1020 x g gedurende 5 min naar de pellet van de cellen.
  10. Verwijder het supernatant en voeg van 10% FBS-opgenomen PBS. Centrifugeer de buis bij 1020 x g gedurende 5 min naar de pellet van de cellen.
  11. Verwijder het supernatant en voeg vervolgens 1 mL van endothelial cel expansie medium aangevuld met 10% FBS. Zaad 8.0 × 106 cellen per putje voor elk gerecht collageen-gecoat.
  12. Wijzig het kweekmedium elke dag voor 1 week. Wijzig vervolgens het kweekmedium om de 2 dagen.
    Opmerking: hECFCs na dag 10-14 cultuur kan worden gevonden. hECFCs Toon typische geplaveide-achtige morfologie en vormen een kolonie die kan worden waargenomen in fase contrast microscopie. Immunofluorescentie kleuring van vasculaire endothelial cadherine (CD144) en von Willebrand-factor (vWF) kan ook worden uitgevoerd voor de karakterisatie van de hECFCs na verdere uitbreiding van de cel.
  13. Gebruik om het hECFCs te cultiveren, endothelial cel expansie medium aangevuld met 5% FBS en penicilline/daar bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2. Vervang het medium eenmaal per dag.
  14. Na hECFC inductie, de cellen aan de passage 7 voor verdere experimenten te groeien.

7. cel zaaien en cultuur op de gradiënt Nanopattern platen

Opmerking: Stap 7 beschrijft de cultuur van de hECFCs op de gradiënt nanopattern plaat, maar andere bronnen van de cel kunnen ook worden gebruikt.

  1. Coat de kleurovergang nanopattern platen met 1 mL 0,1% eiwit coating oplossing in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: De 0,1% eiwit coating geldt niet voor de nanopillar functies.
  2. Maken een hECFCs suspensie van de cultuur-schotel door een standaard cel-splitsing methode met behulp van trypsine.
  3. Verdun de celsuspensie om de gewenste samenvloeiing. Beënt de hECFCs op de gradiënt nanopattern platen en platte control (bijvoorbeeld 1.0 × 104 cellen/cm2).
    Opmerking: Wanneer hECFCs worden overgeënt op 1.0 × 104 cellen/cm2 op kleurovergang nanopattern platen, bereikt de cel confluentie meestal tot 70-80% na 2 dagen.
  4. Cultuur de cellen op platte of verlopende nanopattern platen voor 2 dagen in de incubator.

8. observatie en analyse

  1. Scannende Elektronen Microscoop (SEM) imaging
    1. Fix hECFCs gekweekt op platte of verlopende nanopattern platen met 2,5% Glutaaraldehyde bij 4 ° C voor overnachting.
    2. Het behandelen van 1% osmium tetroxide gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Wassen monsters met PBS.
    3. Monsters met ethylalcohol van lage tot hoge concentratie (50%, 70%, 80%, 90% en 100%) gedurende 10 minuten per elke stap uitdrogen.
    4. Behandeling van hexamethyldisilazane (HMDS) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Daarna wassen monsters met verse HMDS en laat monsters onder de zuurkast minimaal 1 dag totdat de resterende HMDS volledig is verdampt.
    5. Jas van de monsters met platina sputter coater voor 5 min en onderzoeken van de monsters met een SEM.
  2. Transmissie elektronenmicroscoop (TEM) imaging
    1. Fix hECFCs gekweekt op platte of verlopende nanopattern platen met 2% paraformaldehyde en 2,5% Glutaaraldehyde mengsel in PBS bij 4 ° C voor overnachting.
    2. Na fixatie uitvoeren met behulp van 1% osmium tetroxide en monsters met behulp van de methode in 8.1.3 uitdrogen.
    3. Monsters in epoxyhars insluiten. 60 nm dik secties van blokken en een sectie op een TEM grid plaatst.
    4. Vlek van de sectie met het mengsel van 10 mg uranyl acetaat in 100 mL methylalcohol en 0,1 mg lood citraat in 100 mL gedestilleerd water. Het verkrijgen van beelden met een TEM.
  3. Fluorescentie kleuring
    1. Fix hECFCs gekweekt op platte of verlopende nanopattern platen met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    2. Permeabilize en blokkeren van monsters met 5% geit serum en 0,1% octylfenol ethoxylaat in PBS (PBST) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    3. Incubeer monsters met anti-menselijke vinculin primair antilichaam (1:500 in PBST) bij kamertemperatuur voor 2 h. Rinse monsters drie keer met PBST.
    4. Incubeer monsters met fluorescentie-geconjugeerde phalloidin (1:1, 000 in PBST), fluorescentie-geconjugeerde secundair antilichaam (1:1, 000 in PBST) bij kamertemperatuur voor 2 h. Rinse monsters drie keer met PBST.
    5. Incubeer monsters met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1,000 in PBST) bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    6. 10 µL van montage medium op het oppervlak van de gradiënt nanopattern neerzet. Plaats een dekglaasje aan op de drager van de montage.
    7. Leg het monster met ondersteboven op het podium van de steekproef en het verwerven van beelden met behulp van fluorescentie van de confocal microscoop.
  4. Beeldanalyse
    1. Opnames van de hECFCs naar een analysesysteem beeld overbrengen.
    2. Kies het willekeurige veld van phalloidin kleuring van de afbeelding. Pas de drempel en een binaire afbeelding waarin cellen staan los van de achtergrond maken.
    3. Contouren tekenen rond cellen te meten van de cel-oppervlakte en omtrek en handmatig tellen het aantal filopodia per cel.
    4. Kies het willekeurige veld van vinculin kleuring van de afbeelding. De drempel aanpassen en maken een binaire beeld van focal hechting gebieden.
      Opmerking: Aanpassen beeld drempel op de juiste manier om te voorkomen dat kunstmatige over - of onder - filling van focal hechting gebieden.
    5. Het aantal focal hechting van elke cel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten


Figuur 1 toont SEM beelden van de gefabriceerde kleurovergang AAO mallen volgens hun type en positie. Figuur 2 toont SEM beelden van kleurovergang nanopattern platen met regelmatige-afgerond nanopillars en Figuur 3 is kwantificering gegevens met de diameter van de nanopillar. Tabel 1 bevat de kenmerken van het gefabriceerde nanopillars.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Fabricage van een AAO vaak lijdt aan gebreken zoals scheuren, onregelmatige vormen van poriën, en branden. De belangrijkste reden voor deze gebreken heet een elektrolytische verdeling, die sterk wordt beïnvloed door de aard van de metalen substraten worden geanodiseerd en de soortelijke weerstand van de elektrolyt21. Aangezien de soortelijke weerstand van de elektrolyt hangt af van de temperatuur, is elimineren hitte voortdurend van elektroden het kritieke punt de locatiespecifieke om temperatuur ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van onderwijs, wetenschap en technologie (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] en Bio & medische technologie-ontwikkeling Programma van de NRF gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT & toekomst Planning [NRF-2017M3A9C6029563].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Perchloric acid 60%Daejung Chemicals & Metals6512-4100
Ethyl alcohol, absolute 99.9%Daejung Chemicals & Metals4118-4100
Phosphoric acid 85%Daejung Chemicals & Metals6532-4400
Methyl alcohol 99.5%Daejung Chemicals & Metals5558-4400
Chromium(VI) oxideDaejung Chemicals & Metals2558-4400
Sulfuric acid 95%Daejung Chemicals & Metals7781-4100
Hydrogen peroxide 30%Daejung Chemicals & Metals4104-4400
n-hexane 95%Daejung Chemicals & Metals4081-4400
Toluene 99.5%Daejung Chemicals & Metals8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilaneGelestSIH5840.4Gevoelig voor vocht
Methoxynonafluorobutane 99%Sigma aldrich464309
Collagen solutionStemcell#4902
GelatinSigma aldrichG1890Eiwitcoatingoplossing
Ficoll-PaqueGE Heathcare17-1440-03Hydrofiele polysacharideoplossing
EGM-2MVLonzaCC-3202Endothelecellenkweekmedium
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Phosphate buffered salineGibco10010031
Fetal bovine serumGibco12483-020
ParaformaldehydeSigma aldrichP6148
GlutaraldehydeSigma aldrichG5882-100ML
Osmium tetroxideSigma aldrich201030-1G
HexamethyldisilazaneSigma aldrich440191
Triton X-100Sigma aldrichX100-100MLOctylfenol ethoxylaat 
Goat serumGibco26050-088
anti-human vinculin primary antibody Sigma aldrichV9131
F-actin probeMolecular ProbesA12379Fluorescent geconjugeerd phalloidine
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibodyMolecular ProbesA11001Fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam 
4',6-diamidino-2-fenylindole Sigma aldrichD9542
MontagemediumDAKOS3023
Anti-human vWF primary antibody DAKOA0082
Anti-human CD144 primary antibody BD Biosciences#555661
Eponate 12™ Embedding Kit, met BDMATed Pella18012Epoxyhars
Uranyl Acetate, 25gTed Pella19481
Lead Citrate, Trihydrate, 10gTed Pella19312
Ultra pure aluminium plaatGoodfellow26050-088
Polystyreen plaatGoodfellowST313120
8.0" silicon waferSiltron29-01024-03Eénzijdig gepolijst, 725 µm dik
Vacuum desiccator, 4.4 LKartellKA.230
VacuumpompVacuumerV3.VOP100
VoedingUnicorntechUDP-3003
Magneetische roerderDaihan scientificSL.SMS03022
Overhead roerderDaihan scientificHT120DX
CirculatorDaihan scientificWCR-P12
Lineaire beweegbare standZaberA-LSQ300A-E01-KT07
Hoekbeugel, 90 gradenZaberAB90MAccessoire van de lineaire beweegbare stand
PMP pincet, 145 mmVitlab67995Nie-metaal tang
PTFE beker, 250 mLCowieCW007.25
Ultrasoon reinigerBransonB2510MTH
PCB snijderHozan Tool IndustrialK-110
Nanoimprint apparaatNanonexNX-2000
Zuurstofplasma generatorFemto ScienceCUTE
Lage temperatuur sterilisatorLowtemCrystal 50
CO2 IncubatorPanasonicMCO-18AC
Confoal laserscanningmicroscoopCarl ZeissLSM700
Scanning elektronenmicroscoopJEOLJSM6701
Transmissie elektronenmicroscoopHitachiH-7500

Referenties

  1. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
  2. Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
  3. Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
  4. Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101(2017).
  5. Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
  6. Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
  7. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  8. Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
  9. Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
  10. Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
  11. Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
  12. Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
  13. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  14. Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
  15. Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394(2012).
  16. Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
  17. Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
  18. Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632(2017).
  19. Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
  20. Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
  21. Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
  22. Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466(1995).
  23. Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126(1996).
  24. Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
  25. Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
  26. Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Anodisch aluminiumoxidefabricage van nanopilaarsscreening van celresponsmethode voor porusvergrotingzelfgeassembleerde monolagenpolystyreen substraatuitgroei van filopodia
Fabricage van kleurovergang Nanopattern door thermische Nanoimprinting techniek en Screening van de reactie van menselijke Endothelial kolonie-vormende cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.