Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes

7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57687

⸱

3 juni 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Population Health Sciences, Medical College of Georgia, Augusta University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een robuuste methode om te herprogrammeren primaire embryonale fibroblasten in functionele cardiomyocytes via overexpressie van GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 en miR-133 (GHMT2m) naast remming van TGF-β signalering. Ons protocol genereert kloppend cardiomyocytes zo spoedig 7 dagen na transductie met korting tot 60% efficiëntie.

Samenvatting

Trans-differentiatie van een somatische in een ander celtype heeft een enorm potentieel aan model en behandelen van ziekten bij de mens. Eerdere studies hebben aangetoond dat muis embryonale, dermale en cardiale fibroblasten kunnen worden geherprogrammeerd in functionele geïnduceerde-cardiomyocyte-achtige cellen (iCMs) via overexpressie van cardiogeen transcriptiefactoren, met inbegrip van GATA4, Hand2, Mef2c, en Tbx5 zowel in vitro als in vivo. Deze eerdere studies hebben echter aangetoond dat relatief lage efficiëntie. Om te herstellen na letsel hartfunctie, moeten mechanismen bestuur cardiale herprogrammering worden opgehelderd om efficiëntie en rijping van iCMs te verhogen.

Wij eerder aangetoond dat remming van pro-fibrotische signalering drastisch verhoogt de efficiëntie van de herprogrammering. Hier, detail we methoden een herprogrammering efficiëntie tot 60% te bereiken. Daarnaast beschrijven we verschillende methoden inclusief stroom cytometry, immunefluorescentie imaging en calcium imaging te kwantificeren herprogrammering efficiëntie en rijping van geherprogrammeerde fibroblasten. Met behulp van het protocol dat gedetailleerde hier, kunnen mechanistisch onderzoek plaatsvinden om te bepalen van de regelgevers van de positieve en negatieve cardiale te herprogrammeren. Deze studies kunnen identificeren signaalroutes die kunnen worden gericht om herprogrammering efficiëntie en rijping, die tot nieuwe celtherapieën leiden kan voor de behandeling van de ziekte van het hart van de mens te bevorderen.

Inleiding

Ischemische hartziekten is een belangrijke doodsoorzaak in de Verenigde Staten1. Ongeveer 800.000 Amerikanen ervaring een eerste of terugkerende myocardiaal infarct (MI) per jaar1. Na MI, de dood van cardiomyocytes (CMs) en cardiale fibrose, gestort door geactiveerde cardiale fibroblasten, afbreuk doen aan hart functie2,3. Progressie van hartfalen na MI is grotendeels onomkeerbaar te wijten aan de slechte regeneratief vermogen van volwassen CMs4,5. Terwijl de huidige klinische therapieën vertragen van de progressie van de ziekte en verminderen risico van toekomstige cardiale gebeurtenissen6,,7,,8,9, keren geen therapieën progressie van de ziekte als gevolg van het onvermogen om te regenereren CMs na infarct10. Nieuwe celtherapieën ontstaan voor de behandeling van patiënten na MI. teleurstellend, klinische proeven leveren van stamcellen naar het hart na MI tot nu toe hebben aangetoond onduidelijk regeneratief mogelijke11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

De generatie van mens-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) van fibroblasten door overexpressie van vier transcriptiefactoren, eerst gedemonstreerd door Takahashi & Yamanaka, opende de deur naar nieuwe doorbraken in cel therapie19. Deze cellen kunnen onderscheiden in alle drie kiem lagen19, en verscheidene zeer efficiënte methoden voor het opwekken van grote aantallen CMs is eerder gebleken dat20,21. HiPSC-afgeleide CMs (heupen-CMs) biedt een krachtig platform om te bestuderen van de cardiomyogenesis en kan belangrijke gevolgen hebben voor het hart na letsel herstellen. Echter, heupen-CMs momenteel hindernissen translationeel als gevolg van de bezorgdheid van Teratoom vorming22, en hun onvolwassen aard kan pro-arrhythmogenic23. Herprogrammering van de fibroblasten in hiPSCs leidde tot interesse in direct herprogrammering fibroblasten in andere celtypes. Ieda et al. aangetoond dat overexpressie van GATA4, Mef2c en Tbx5 (GMT) fibroblasten resulteert in directe herprogrammering aan cardiale afkomst, zij het op een lage efficiëntie24. Herprogrammering van efficiëntie is verbeterd met de toevoeging van Hand2 (GHMT)25. Sinds deze vroege studies, hebben veel publicaties aangetoond dat het veranderen van de herprogrammering factor cocktail met extra transcriptie26,27,28,29 factoren, chromatine modifiers30,31, microRNAs32,33, of kleine moleculen34 tot verbeterde leidt herprogrammering efficiëntie en/of rijping van geïnduceerde cardiomyocyte-achtige cellen (iCMs ).

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het genereren van iCMs van muis embryonale fibroblasten (MEFs) met een hoog rendement. Wij eerder toonde aan dat de GHMT cocktail is aanzienlijk verbeterd met de toevoeging van miR-1 en miR-133 (GHMT2m) en is verder verbeterd wanneer pro-fibrotische signaling pathways inclusief transformeren groeifactor β (TGF-β) signalering of Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) signaalroutes zijn geremde35. Met behulp van dit protocol, we laten zien dat ongeveer 60% van de cellen express cardiale troponine T (cTnT), ongeveer 50% express α-actinin en een groot aantal cellen van de afstraffing waarneembaar zo spoedig dag 11 na transductie van herprogrammering factoren en behandeling de TGF-β typ ik receptor remmer A-83-01. Bovendien, deze iCMs express gap junction eiwitten met inbegrip van connexin 43 en spontane contractie en calcium transiënten tentoon te stellen. Dit gemarkeerd verbetering in efficiëntie ten opzichte van eerdere studies herprogrammering toont het potentieel om te regenereren CMs van endogene cel populaties die in het na hartinfarct blijven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten waarbij dieren werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de UC Denver Anschutz medische Campus.

1. isolatie van MEFs

  1. Koop C57BL/6 zwangere muizen op E13. Schip 's nachts.
  2. De moeder volgens goedgekeurde IACUC protocollen euthanaseren (ex: ~1.3 L/min CO2 totdat dier dood verschijnt gevolgd door cervicale dislocatie)
  3. Spray de moeder met 70% ethanol en openen van de buikholte. Verwijderen van de baarmoeder hoorn met embryo's en plaatsen in een 10 cm schotel met steriel PBS.
  4. Maak een incisie in de embryo sac vrijgeven embryo. Overdracht van embryo om 10 cm schotel met steriel PBS schoon te maken. Spoel grondig.
  5. Snijd het lichaam onder de lever en negeren het hoofd en het bovenlichaam. Verwijderen van de inwendige organen en gooi deze weg. Het resterende weefsel overbrengen in een schone 10 cm schotel met steriel PBS en breng de plaat naar een bioveiligheid niveau 1 of 2 kabinet. Combineren weefsels van alle embryo's in een schone, droge 10 cm schotel en gehakt in fijne stukjes.
  6. 6 mL van 0,25% trypsine/1 mM EDTA aan gehakt embryo's toevoegen. Triturate meerdere malen Pipetteer te breken van weefsel. Incubeer gedurende 40 minuten bij 37 ˚C met 5% CO2.
  7. Resuspendeer de cellen in groeimedium (tabel 1). Het volume van media is aangepast op basis van het aantal embryo's geoogst. In het algemeen, een verhouding van ongeveer 25 mL groei media per 1.2 embryo's gebruiken.
  8. Plaat 25 mL geresuspendeerde cellen in een 15 cm schotel. Na 24u, gecombineerd de media en voeg 25 mL vers groeimedium aan elke plaat.
  9. Na 72 uur, voeg toe 2 mL van 0,25% trypsine/1 mM EDTA aan elke 15 cm schotel. Wanneer cellen van de cultuur-schotel loskoppelen, trypsine met 15 mL groeimedium inactivering en verzamelen van cellen in 50 mL polystyreen conische buisjes. Centrifugeer cellen gedurende 3 minuten op 160 x g bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet cel in groeimedium en filter door een 70 µm porie cel zeef.
  10. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en bevriezen van MEFs in 2 miljoen cellen aliquots in bevriezen medium (10% DMSO, 25% FBS in Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) / hoge glucose) bij-80 ° C. Overbrengen in cellen vloeibare stikstof na 24 h en de winkel tot klaar voor gebruik.
    Opmerking: Global genexpressie in MEFs werd geprofileerd geïsoleerd met behulp van dit protocol door RNA-sequentiebepaling (RNA-seq) om verificatie van de cel. RNA-seq gegevens uit coderen MEF cellen werden gedownload van NIH gen expressie Omnibus (GEO) met toetreding nummer GSE93454. RNA-seq gen expressie gegevens voor de MEFs door ons gebruikt werden neergelegd in NIH GEO bij toetreding nummer GSE71405. Deze twee gegevensverzamelingen werden samengevoegd volgens gemeenschappelijke gene symbolen. De expressie gegevens werden vervolgens log-omgevormd en een scatterplot van de gegevens van de expressie voor onze MEFs en CODEER MEFs werden gegenereerd en passen met een lineaire regressielijn (figuur 1A). MEFs geïsoleerd met behulp van dit protocol zijn moleculair vergelijkbaar zijn met die geïsoleerd door andere laboratoria.

2. productie van Retrovirus en transductie van MEFs

Opmerking: Alle stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd in een kast van bioveiligheid niveau 2. Aangezien dit protocol maakt gebruik van retrovirale signaaltransductie, zorgen dat de veiligheid voorzorgsmaatregelen worden getroffen, met inbegrip van behandeling die alle die virale media met 10% bleekwater voor ten minste 20 min. verwijs naar figuur 1B voor een tijdlijn afvalstoffen voor herprogrammering.

  1. Productie van Retrovirus met behulp van de cellijn Platinum E (PE)
    1. Handhaven van verkrijgbare PE cellen in PE medium (tabel 1) met blasticidin en puromycin selectie markers om expressie van gag-pol en env genen voor efficiënte retrovirale deeltje productie36 . De cellen van de passage op 1:4 of 1:5 om de twee dagen. Zorg om te voorkomen dat overbevolking van cellen zoals dit retrovirale productie rendementen kan verminderen.
    2. Op de dag -1, seed ongeveer 5 x 106 cellen per 10 cm schotel in het groeimedium (tabel 1) 16-20 h vóór transfectie (Zie tabel 2 voor de plating dichtheden voor andere standaard cel cultuur schotel maten). Zachtjes heen en weer meerdere malen rock gerechten en zorgvuldig plaats in een 37 ° C, 5% CO2 incubator zelfs plating verdeling (Zie Figuur 1 c voor optimale plating dichtheid vóór transfectie).
      Opmerking: zorg plaat PE cellen in het medium gratis selectie markeringen vóór transfectie om opslagmedium met gegenereerde retrovirale deeltjes doodt niet MEFs.
    3. Op de dag 0, voorbereiden op DNA transfectie. Voor 10 cm schotel transfectie, voeg 2 µg voor elke herprogrammering factor — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 en miR-133 (GHMT2m) — tot een 1,5 mL koker.
      Opmerking: Raadpleeg tabel 2 op de schaal van de hoeveelheid DNA die nodig zijn voor andere standaard cel cultuur schotel maten transfect.
    4. In een aparte 1,5 mL-buis, 360 µL verminderde serum media hebt toegevoegd. Voeg dan 36 µL transfectiereagens rechtstreeks aan verminderde serum media. Zachtjes flick van de buis en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
      Opmerking: Om te voorkomen dat de verminderde transfectie efficiëntie, zorgvuldig transfectiereagens rechtstreeks toevoegen aan de verminderde serum media.
    5. Verminderde serum media/transfectie reagens mengsel toevoegen aan GHMT2m DNA cocktail. Zachtjes flick van de buis en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Doen niet vortex.
    6. Het reactiemengsel ontkleuring aan PE cellen toevoegen, zachtjes swirl van media voor 10-15 s en plaatsen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
      Opmerking: Volgens de fabrikant, PE cellen genereren een gemiddelde titer van 106 tot 107 besmettelijke eenheden/mL. Dit protocol genereert ongeveer 2 x 106 infecties eenheden/mL door 24 h en 6 x 106 infecties eenheden/mL door 48 h gemiddeld MOI van 4. De transfectie van GFP/DsRed kan ook worden gebruikt als een surrogaat voor Transfectie/transductie efficiëntie indien gewenst; efficiëntie van de transfectie wordt verwacht dat hoger is dan 90% door 48 h (Figuur 1 c).
  2. Transductie van MEFs
    1. Jas gerechten met collageen en breng dit in een 37 ° C, 5% CO2 incubator voor ten minste 2 uur op de dag 0.
    2. MEFs verwijderen van vloeibare stikstof en dooi. Plaat 0,2 x 106 cellen per 60 mm schotel in het groeimedium. Zachtjes rock platen om ervoor te zorgen zelfs plating distributie en plaats in de incubator (Zie Figuur 1 c voor optimale plating dichtheid en tabel 2 voor de plating dichtheden voor andere standaard cel cultuur schotel maten).
      Opmerking: Deze beplating dichtheden hebben getest over meervoudige batches van geïsoleerde MEFs; tenzij MEFs display gecompromitteerd aanzienlijk levensvatbaarheid, is cel zaaien dichtheden aanpassen niet nodig.
    3. Op de dag 1, 24 h na transfectie, kunt een 30 mL spuit retrovirale medium gegenereerd door PE cellen verzamelen. Het medium passeren door een 0,45 µm poriegrootte filter in een conische buis van 50 mL. Hexadimethrine bromide transfectiereagens toevoegen om een eindconcentratie van 6 µg/mL. Voeg 10 mL verse groeimedium aan PE cellen door pipetting media op de wand van de schotel cultuur om te voorkomen dat de verplaatsing van de cellen.
    4. Het medium van MEFs gecombineerd en 4 mL vers geoogste retrovirale voedingsbodem toevoegen aan elk gerecht. MEFs terugkomen in de incubator. 10% bleekwater toevoegen aan alle materialen in contact met het virale medium te neutraliseren retrovirale deeltjes.
    5. Op de dag 2, 48 h na transfectie, herhaal stap 2.2.2 en 2.2.3. PE cellen worden verwijderd na de 2nd -collectie van het retrovirale medium.
      Opmerking: Voeg 10% bleekwater toe aan afgedankte PE cellen voor ten minste 20 min. te neutraliseren van ongewenste retrovirus.
    6. Op dag 3 gecombineerd medium uit MEFs en vullen met 4 mL iCM medium (tabel 1) met de 0,5 µM A-83-01, een TGF-β controletype I receptor remmer. Aanvullen iCM opslagmedium met A-83-01 om de 2 dagen.
      Opmerking: Als GFP als een transductie-besturingselement gebruikt, de expressie naar verwachting meer dan 90% door dit punt van tijd (Figuur 1 c).

3. Stroom Cytometry voor cardiale Markers

  1. Aspirate medium uit dag 9 geherprogrammeerd MEFs en wassen (1 x) met 1 x PBS om dode cellen en puin te verwijderen.
  2. Voeg 1 mL 0,25% trypsine/EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ˚C. Controleer met behulp van een lichte Microscoop cellen staan en schud nu schotel; Als cellen aangesloten blijven, incubeer 5 meer min op 37 ˚C tot cellen los.
  3. Cellen in 1 x PBS met 5% FBS en filter door een 70 µm porie cel zeef wassen.
  4. Centrifugeer bij 160 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en aspirate vloeistof uit de pellet.
    Opmerking: Het vergroten van de opbrengst van de cel, laat ongeveer 50 µL vloeistof boven de cel-pellet.
  5. Spoel de cellen met 500 µL 1 x PBS met 1% BSA.
  6. Fix cellen met 0,2 mL/1 miljoen cellen fixatie oplossing voor 20 min op ijs.
  7. Voeg 1 mL 1 x ijskoude perm/afwas buffer.
    Opmerking: De fabrikant oplossing is 10 x.
  8. Centrifugeer cellen bij 160 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en supernatant gecombineerd.
  9. Herhaal stap 3.7 en 3.8 een extra tijd. Na de 2nd wash, ga direct naar volgende stap of houden cellen bij 4 ° C's nachts.
  10. Blokkeren met 100 µL van de serum van 5% geit en ezel serum in 1 x perm/afwas buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  11. Voeg 100 µL van verdunde primair antilichaam.
    Opmerking: Voor dit protocol, cellen waren gelabeld met Muis Troponine T (1:200) en muis α-actinin (1:200) te kwantificeren van het percentage cellen positief voor belangrijke onderdelen van de cardiale Sarcomeer. Primair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
  12. Centrifugeer cellen bij 160 x g gedurende 5 m bij 4 ° C, gecombineerd supernatant en 2 x met ijskoude perm/afwas buffer wassen.
  13. Voeg 100 µL van verdunde secundair antilichaam.
    Opmerking: Voor dit protocol, cellen waren gelabeld met anti-muis 647 nm secundair antilichaam (1:200). Incubeer secundair antilichaam gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur op een eind over buis rotator. Beschermen cellen tegen licht door buizen in folie wikkelen.
  14. Centrifugeer cellen bij 160 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, gecombineerd supernatant en 2 x met ijskoude perm/afwas buffer wassen.
  15. Voeg 1 mL van de 1% BSA in PBS en FACS onmiddellijk uit te voeren.
    Opmerking: Genereer een voorwaartse vs kant scatter scatterplot naar gate levensvatbare cellen eerst bij het uitvoeren van FACS. Ook gebruiken een commercieel beschikbare live/dode cel vlek vóór de vaststelling van de cellen dood cel populaties te identificeren live.

4. immunokleuring van geherprogrammeerde MEFs

  1. Aspirate medium uit dag 14 geherprogrammeerd MEFs en wassen (1 x) met 1 mL 1 x ijskoude PBS.
    Opmerking: Voor immunokleuring, herprogrammering werd uitgevoerd in 12 goed platen om te minimaliseren van antilichaam oplossing volumes. 24 goed platen kunnen ook worden gebruikt; gewoon half alle volgende volumes.
  2. Gecombineerd en herstellen van cellen met 500 µL 2% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Gecombineerd en wassen van cellen 3 keer met 1 mL 1 x PBS (5 min per wasbeurt bij kamertemperatuur).
  4. Permeabilize cellen met 500 µL 0,2% permeabilization-reagens in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Gecombineerd en blokkeren in 500 µL 10% paard serum in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Gecombineerd en incubeer met 500 µL van de verdunde primair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Voor dit protocol, cellen waren gemarkeerd met Muis Troponine T of α-actinin (elke 1:400) en mede gemarkeerd met Connexin 43 (1:400) of troponine I (1:400).
  7. Gecombineerd primair antilichaam en spoel driemaal met PBS van de 1 x 1 mL (5 min per wasbeurt bij kamertemperatuur).
  8. Gecombineerd en met 500 µL verdunde secundair antilichaam Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Voor dit protocol, cellen waren gelabeld met anti-muis 555 nm secundair antilichaam (1:800) te herkennen troponine T of α-actinin en anti-konijn 488 nm secundair antilichaam (1:800) te herkennen Connexin 43 of troponine I. Bovendien, kernen werden gekleurd met Hoechst (1:10, 000). Beschermen cellen tegen licht door het broeden in het donker.
  9. Het secundaire antilichaam gecombineerd en spoel driemaal met PBS van de 1 x 1 mL (5 min per wasbeurt bij kamertemperatuur). Wikkel de plaat in folie cellen beschermen tegen licht te bewaren bij 4 ° C.
  10. Beeld met behulp van drie-kanaals epifluorescence microscopie.

5. calcium Imaging

Opmerking: Als denkbaar ter 10 X vergroting, standaard cel cultuur gerechten en platen zijn geschikt voor calcium imaging. Beeldvorming bij hogere vergroting vereist dat cellen worden verguld op glas coverslips of glazen bodem gerechten.

  1. Gecombineerd middellange en voeg toe 2 mL (voor een 6 goed plaat) bewerkt Tyrode de oplossing (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, glucose van 10 mM, 10 mM HEPES, 0,1% BSA en 1% pyruvaat, pH 7.4) met 5 µM Fura-2 ben en 0.1% Pluronic F-127 te verslaan (D14 t o D20) iCMs. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
    Opmerking: Beschermen cellen tegen licht om te voorkomen dat het blussen van fluorescerende indicator.
  2. Wassen van cellen in 2 mL Tyrode de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om ambtshalve verestering van Fura-2 AM.
  3. Afbeelding met draaiende schijf confocale microscopie bij 340 nm en 380 nm met behulp van Slidebook 5.5 Ca2 + beeldbewerkingssoftware. Het uitvoeren van de beeldvorming bij kamertemperatuur.
  4. Calcium transiënten zijn berekend op basis van de verhouding tussen de intensiteit van de fluorescentie bij 340 nm over de intensiteit van de fluorescentie op 380 nm.
  5. Desgewenst behandelen iCMs met 1 of 2 µM isoproterenol of 10 µM Nifedipine te manipuleren calcium behandeling na imaging basislijn calcium transiënten. Lokaal verbindingen aan cellen en afbeelding toevoegen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van de herprogrammering strategie geschetst boven en in figuur 1B, we genereerden iCMs met ongeveer 70% van de cellen uiten van cardiale troponine T en ongeveer 55% van de cellen, uiting van cardiale α-actinin, gekwantificeerd door stroom cytometry op dag 9 volgende transductie van GHMT2m (figuur 2A en B). Bovendien, de meerderheid van de cellen express cardiale troponine T, troponine I, en cardiale α-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De huidige studie schetst een hoogrenderende strategie om rechtstreeks het herprogrammeren van fibroblasten in functionele iCMs via de levering van GHMT2m factoren gecombineerd met onderdrukking van pro-fibrotische signaalroutes herprogrammering. Met behulp van stroom cytometry, immunefluorescentie beeldvorming, calcium imaging, en het verslaan van de graven van de cel, tonen we de meerderheid van de cellen in dit protocol ondergaan succesvolle herprogrammering en aannemen van CM lineage lot. Wij hebben eerder aangetoond...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gesteund door fondsen uit van de Stichting van de Boettcher Webb-Waring biomedische Research Program, American Heart Association wetenschapper ontwikkeling Grant (13SDG17400031), Universiteit van Colorado Vakgroep Geneeskunde uitstaande vroege carrière Geleerde Program, Universiteit van Colorado divisie van cardiologie Barlow Nyle endowment en NIH R01HL133230 (naar KS). A.S.R werd gesteund door de NIH/NCATS Colorado CTSA Grant nummer TL1TR001081 en een-gepromoveerde beurs van de Universiteit van Colorado-Consortium voor fibrose onderzoek & vertaling (CFReT). Dit onderzoek werd ook ondersteund door de kanker Center ondersteuning Grant (P30CA046934), de huid ziekten Cores onderzoeksbeurs (P30AR057212) en de Stroom Cytometry kern op de Universiteit van Colorado Anschutz medische Campus.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
C57BL/6 MuizenCharles River's Laboratory027Voor MEF isolatie
Platinum E (PE) CellenCell Biolabs, INCRV-101Voor retrovirus productie
DMEM High GlucoseGibcoSH30022.FSOnderdeel van iCM, PE en Groei media
Medium 199Life Technologies11150-059Onderdeel van iCM media
Fetaal RundserumGemini100106Onderdeel van iCM, PE en Groei media
Donor PaardenserumGemini100508 500Onderdeel van iCM media
MEM Essentiële Aminozuren, 50XLife Technologies11130051Onderdeel van iCM media
Natrium Pyruvaat Oplossing, 100XLife Technologies11360070Onderdeel van iCM media en voor calcium beeldvorming
MEM Niet-Essentiële Aminozuren, 100XLife Technologies11140050Onderdeel van iCM media
MEM Vitamine Oplossing, 100XLife Technologies11120-052Onderdeel van iCM media
Insuline-Transferrine-SeleniumGibco41400045Onderdeel van iCM media
B27Gibco17504-044Onderdeel van iCM media
Penicilline-StreptomycineGibco15140-122Onderdeel van iCM, PE en Groei media
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement)Gibco35050-061Onderdeel van iCM, PE en Groei media
Blasticidin-HClLife TechnologiesA11139-03Onderdeel van PE media
Puromycin dihydrochlorideLife TechnologiesA11138-03Onderdeel van PE media
0.25% Trypsine/EDTAGibco25200-056Voor het losmaken van cellen uit kweekschalen
A-83-01R&D Systems - Tocris2939/10Behandel cellen om TGF-β signalering te remmen - bevordert hoge efficiëntie herprogrammering. Gebruik op 0.5 µM
DMSOThermo Scientific85190Voor het verdunnen en opslaan van A-83-01 en onderdeel van Freeze Medium
SureCoatCellutronSC-9035Voor het coaten van schalen om MEFs te plateren
FuGENE 6 Transfectie ReagensPromegaE2692Transfectie Reagens
Opti-MEM Verminderd Serum MediaGibco11058-021Transfectie Reagens
pBabe-X Myc-GATA4Plasmid bevattende herprogrammeringsfactor
pBabe-X Myc-Hand2Plasmid bevattende herprogrammeringsfactor
pBabe-X Myc-Mef2cPlasmid bevattende herprogrammeringsfactor
pBabe-X Myc-Tbx5Plasmid bevattende herprogrammeringsfactor
pBabe-X miR-1Plasmid bevattende herprogrammeringsfactor
pBabe-X miR-133Plasmid bevattende herprogrammeringsfactor
pBabe-X GFPPlasmid bevattende herprogrammeringsfactor
Polybrene (Hexadimethrine bromide)SigmaH9268-5GVoor virale inductie. Gebruik op een concentratie van 6 µg/mL
Vacuum Filter + flessen (0.22 µm poriën)Nalgene 569-0020 Voor het filteren van media
SpuitenBd Vacutainer Labware 309654Voor virale filtratie
0.45 µm FiltersCelltreat229749Voor virale filtratie
70 µm cel zeeversFalcon 352350Voor MEF isolatie en Flow Cytometrie
Cytofix/Cytoperm OplossingBD554722Voor fixatie en permeabilisatie van cellen voor flow cytometry
perm/wash buffer BD554723Voor het wassen van cellen voor flow cytometry
DPBS 1XGibco14190-250Voor het wassen van cellen
Rundserum AlbumineVWR0332-100gVoor flow cytometry en calcium beeldvorming
GeitenserumSigma G9023Voor het blokkeren van cellen voor Flow Cytometrie
EzelsserumSigmaD9663-10mgVoor het blokkeren van cellen voor Flow Cytometrie
Muis Troponin TThermo Scientificms-295-p1:400 IF, 1:200 Flow Cytometrie
Muis α-actinineSigmaA7811L1:400 IF, 1:200 Flow Cytometrie
Konijn Connexin 43Sigma C62191:400 IF
Konijn Troponin IPhosphoSolutions2010-TNI1:400 IF
HoechstLife Technologies622491:10000 IF
Alexa 488, konijnLife TechnologiesA-110341:800 IF
Alexa 555, muisLife TechnologiesA-214221:800 IF
Alexa 647, muisLife TechnologiesA-315711:200 Flow Cytometrie
27-kleurig ZE5 Flow Cytometer Bio-RADVoor FACS
ParaformaldehydesigmaP6148-500mgVoor het fixeren van cellen voor IF
Triton X-100PromegaH5142Voor het permeabiliseren van cellen voor IF
EVOS™ FL Kleur BeeldvormingssysteemThermo ScientificAMEFC4300Voor IF
NaClRPIS23020-5000Vo

Referenties

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
  3. Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
  7. Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
  8. The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
  9. Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
  10. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
  11. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  12. Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
  13. Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
  14. Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
  15. Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
  16. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
  17. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  18. Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
  19. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  20. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  21. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  23. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
  24. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
  25. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  26. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
  27. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  28. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  29. Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678(2014).
  30. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  31. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577(2013).
  32. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
  33. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
  34. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
  36. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
  37. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  38. Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
  39. Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
  40. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  41. Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Cardiale herprogrammeringflowcytometrieimmunofluorescente beeldvormingcalciumbeeldvormingretrovirale transductieTGF b ta inhibitieGHMT2M cocktailvorming van gap junctions
Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.