Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Samenvatting

Dit witboek beschrijft een protocol voor ex vivo calcium beeldvorming van de hersenen van Drosophila . Bij deze methode, kunnen natuurlijke of synthetische verbindingen worden toegepast op de buffer voor het testen van hun vermogen om bepaalde neuronen in de hersenen activeren.

Samenvatting

Orgel-naar-orgel communicatie door endocriene signalering, bijvoorbeeld is vanuit de periferie naar de hersenen, essentieel voor het behoud van homeostase. Als een dier model voor endocriene onderzoek, wordt Drosophila melanogaster, die heeft verfijnde genetische hulpmiddelen en genoominformatie, steeds meer ingezet. Dit artikel beschrijft een methode voor de calcium-beeldvorming van Drosophila hersenen explantaten. Deze methode kan de detectie van de directe signalering van een hormoon aan de hersenen. Het is algemeen bekend dat vele peptide hormonen via de G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCRs) handelen, wiens activering een verhoging van de intracellulaire Ca^{2 +}concentratie veroorzaakt. Neurale activering verheft ook intracellulaire Ca^{2 +} niveaus, variërend van zowel Ca^{2 +} toestroom en de vrijlating van Ca^{2 +} opgeslagen in het endoplasmatisch reticulum (ER). Een calcium-sensor, GCaMP, kan deze Ca^{2 +} wijzigingen controleren. Bij deze methode GCaMP wordt uitgedrukt in de neuronen van belang, en de GCaMP-uiten larvale hersenen is ontleed en gekweekte ex vivo. De test-peptide wordt vervolgens toegepast op de hersenen explant, en de fluorescerende wijzigingen in GCaMP worden gedetecteerd met behulp van een draaiende schijf confocal microscoop uitgerust met een CCD-camera. Met behulp van deze methode, een in water oplosbare molecuul kan worden getest, en verschillende cellulaire gebeurtenissen die zijn gekoppeld aan de neurale activering kunnen worden beeld met behulp van de passende fluorescerende indicatoren. Bovendien, door aanpassing van de beeldvorming kamer, deze methode kan worden gebruikt om het imago van de organen van andere Drosophila of de organen van andere dieren.

Inleiding

Mededeling van de orgel-naar-orgel is een evolutionair geconserveerde strategie voor het behoud van de homeostase om te gaan met veranderingen in het milieu. Bij de mens, een scala aan hormonen arereleased van de endocriene klieren in de circulatie. Veel van deze hormonen richten de hypothalamus van de hersenen, die regelt metabole processen en fundamentele gedrag zoals het voederen van^1,2. Veel hormonen hebben ontdekt met behulp van zoogdieren modellen. Nochtans, de mechanismen van hun optreden, met name de interorgan netwerken waaraan zij deelnemen, grotendeels onduidelijk blijven.

Protocol

1. bereiding van larvale hersenen explantaten

1. Het maken van een imaging kamer.
   Opmerking: Stabiele opname vereist dat de hersenen explantaten worden aangebonden. Hier, een goedkope, handgemaakte imaging expositiekamer gebruik wordt gemaakt in de Ca^{2 +} imaging systeem.
   1. Met behulp van Tang, kras midden onder in een schotel van kunststof cultuur (35 x 10 mm) te maken van een deuk voor het ventrale ganglion van de larvale hersenen waardoor montage eenvoudiger (stap 1.3, Figuur 1).
   2. Met een tandenstoker, plaats een kleine daling van superlijm aan weerszijden van de deuk en een staaf van wolfraam (0,125....

Resultaten

Met behulp van dit protocol, werd de activering van de insuline-producerende hersencellen (IPCs) door de peptide hormonen, CCHa2, onderzocht. IPCs van de wild-type hersenen waren gelabeld met GCaMP6s met behulp van een combinatie van dilp2 -GAL4¹² (een geschenk van Dr. Rulifson) en UAS-GCaMP6s¹³ (een geschenk van Dr. Kim). Larvale hersenen explantaten werden behandeld met een synthetisch CCHa2 peptide, en de fluorescentie v.......

Discussie

De Ca^{2 +} beeldvorming van de hier beschreven methode is een nuttig systeem voor het testen van de functie van hormonen in de hersenen. In vivo, de hersenen ontvangt hormonen van verschillende endocriene organen. Daarnaast ziet de hersenen voortdurend oplopende zintuiglijke informatie, waardoor spontane neuronale activering. Dit systeem ex vivo elimineert deze ruis en levert een betere signaal/ruis-verhouding dan in vivo imaging. In dit systeem, kunnen de moleculen worden getest afzon.......

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Wolfraamstaaf	A-M systemen, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Parijs, Frankrijk	3049100	kits-achtige herbruikbare lijmen
Kijkglas, vierkant, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	Fosfaat gebufferde zouten
CCHa2	SCRUM Inc., Tokio, Japan		Op maat gemaakt peptide
Ghrelin	Peptide Institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptine	Peptide Institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland	Axio Imager A2	fluorescentiemicroscoop
Objectief W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland	420957-9900-000	objectieflens voor waterimmersie
P-725 PIFOC objectiefscanner met lange afstandsbereik	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Duitsland	N/A	piëzo-geactiveerde lensbeweger
Confocale scannereenheid CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokio, Japan	CSU-W1	confocale kop met draaiende schijf
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD-camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroische beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dichroische beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	emissiefilter
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	U. S. National Institutes of Health	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/

```