Opname ruimtelijk beperkte schommelingen in de Hippocampus gedragen muizen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de opname van het lokale veld potentieel met multi schacht lineaire silicon sondes. Conversie van de signalen met behulp van de huidige Bronanalyse dichtheid kan de wederopbouw van lokale elektrische activiteit in de hippocampus muis. Met deze techniek, kunnen ruimtelijk beperkte hersenen oscillaties in vrij bewegende muizen bestudeerd worden.

Samenvatting

Het lokale veld potentieel (LFP) blijkt uit ion bewegingen over neurale membranen. Aangezien de spanning opgenomen door LFP elektroden de opgeteld elektrisch veld van een groot volume van hersenweefsel weerspiegelt, is extraheren van informatie over lokale activiteit uitdagend. Bestuderen van neuronale micro schakelingen, vereist echter een betrouwbaar onderscheid tussen echt lokale evenementen en volume-uitgevoerd signalen van oorsprong uit verre hersengebieden. Huidige Bronanalyse dichtheid (CSD) biedt een oplossing voor dit probleem door het verstrekken van informatie over huidige wastafels en bronnen in de nabijheid van de elektroden. In de hersengebieden met laminaire cytoarchitecture zoals de hippocampus, kan eendimensionale CSD worden verkregen door de schatten van de tweede ruimtelijke afgeleide van de LFP. Hier beschrijven we een methode om record multilaminar LFPs met behulp van lineaire silicon sondes de dorsale hippocampus ingeplant. CSD sporen worden berekend langs individuele shanks van de sonde. Dit protocol beschrijft dus een procedure om het oplossen van ruimtelijk beperkte neuronale netwerk schommelingen in de hippocampus vrij verplaatsen van muizen.

Inleiding

Trillingen in de LFP zijn kritisch betrokken bij informatieverwerking door neuronale circuits. Zij bestrijken een breed spectrum van frequenties, variërend van langzame golven (~ 1 Hz) tot snelle rimpel oscillaties (~ 200 Hz)¹. Verschillende frequentiebanden worden geassocieerd met cognitieve functies, zoals geheugen, emotionele verwerking en navigatie^2,3,4,5,6,7. Stroom over neuronale membranen vormt het grootste deel van de LFP signaal⁸. Caties invoeren van de cel (bijvoorbeeld via activatie van glutamaterge excitatory synapsen) vertegenwoordigen een actieve huidige wastafel (zoals gratis het extracellulaire medium verlaat). Netto stroom van positieve lading naar de extracellulaire medium, bijvoorbeeld door activering van GABAergic inhiberende synapsen, toont daarentegen een actieve stroombron op die locatie. In neuronale dipolen, zijn huidige putten gekoppeld met passieve bronnen en vice versa toe te schrijven aan de schadeloosstelling van de stromingen beïnvloeden membraan tenlastelegging op verre locaties.

Het elektrische veld geproduceerd door externe neurale processen kan ook leiden tot grote spanning verlegging op een opname-elektrode en aldus ten onrechte kan worden beschouwd als een lokaal evenement. Dit volume geleiding vormt een serieuze uitdaging voor de interpretatie van de LFP signalen. CSD analyse geeft informatie over lokale huidige wastafels en bronnen onderliggend LFP signalen en bestaat dus uit een middel om de impact van volume geleiding⁸te verminderen. In gelaagde structuren zoals de hippocampus, kunnen eendimensionale CSD signalen worden verkregen door de tweede ruimtelijke afgeleide van de LFP geregistreerd vanaf equidistante elektroden gerangschikt loodrecht naar de laminaire vliegtuigen⁹. De komst van verkrijgbare lineaire silicon sondes hebben onderzoekers gebruik maken van de CSD-methode voor de studie van lokale trilling activiteit in de hippocampus. Bijvoorbeeld, is gebleken dat verschillende gamma oscillaties naar voren in een laag-specifieke wijze in de CA1 gebied^{10 komt}. Bovendien heeft CSD analyse onafhankelijke hot spots van gamma activiteit in de belangrijkste cellaag van de getand gyrus¹¹vastgesteld. Deze bevindingen werden nog belangrijker is, alleen herkenbaar in lokale CSD maar niet in LFP signalen. CSD analyse biedt dus een krachtig hulpmiddel om inzicht in de activiteiten van de microcircuit van de hippocampus te krijgen.

In dit protocol bieden wij een uitgebreide gids voor eendimensionale CSD signalen met silicium sondes. Deze methoden kunnen gebruikers gelokaliseerde trilling gebeurtenissen in de hippocampus van gedragend muizen onderzoeken.

Protocol

Alle methoden waarbij levende dieren zijn goedgekeurd door het Regierungspräsidium Freiburg overeenkomstig de German Animal Welfare Act.

1. voorbereiding

1. Ontwerpen en bouwen van een instrument van de passende invoeging Transient de silicium-sonde en de elektrode-connector uitvoering tijdens het proces van de innesteling. Zie afbeelding 1 voor een voorbeeld van aangepaste gebouwde invoeging tool.
2. Zorgvuldig laat de silicon sonde en elektrode connector van de verpakking met behulp van keramiek-tipped pincet.
3. Til de verbindingslijn bestuur en veilig repareren met een krokodil klem gekoppeld aan een stand.
4. Met behulp van een stereoscoop, afgestemd op de sonde met de invoegpositie gereedschap keramiek-tipped pincet. Het toepassen van een ~ 2 mm laag van paraffine gesmolten met een cauterizer te lijmen van de sonde naar de invoegpositie tool. Wees voorzichtig niet te raken van de sonde Schenkels tijdens deze procedure.
5. Vaststellen van de elektrode-connector aan de schacht van de tool van de invoegpositie met behulp van standaard plakband. Merk op dat afhankelijk van de fabrikant, draden moet mogelijk worden vastgesoldeerd aan de aansluiting van het bestuur van de elektrode vóór. Verwijder de isolatie uit twee korte stukken van vernis-geïsoleerde koperdraad met behulp van tin-soldeer toegepast met een soldeerbout (400 ° C). Soldeer de draden aan de juiste sleuven in de elektrode connector bestuur.
6. Verwijder de isolatie van twee extra stukken van koperdraad. Wikkel elke kale koperdraad driemaal rond een RVS schroef (1 mm diameter, 2 mm-lengte). Toepassing van flux geschikt voor het solderen van staal en soldeer de koperen draad aan de onderkant van de schroefdop. Zorg ervoor dat de onderste helft van de schroefdraad blijft vrij van tin-soldeer.
7. Gebruik een standaard multimeter om elektrisch contact tussen draad en schroef te controleren.
8. Desinfecteren van de schenkels van de silicium-sonde en de grond schroeven door onderdompeling in 70% ethanol (10 s).
9. Een beschermhoes voorbereiden door de sonde implantaat door het hoofd van een plastic pipet van Pasteur doormidden snijden.

2. implantatie chirurgie

1. Steriliseren chirurgische instrumenten (boete-tipped pincet, schaar, chirurgische klemmen) met een sterilisator hete kraal. Veeg alle oppervlakken met 70% ethanol.
2. Induceren anesthesie met 3% Isofluraan in zuurstof afgeleverd op ~ 1 L/min.
   1. Voor onderhoud, gebruikt u 1-1,5% Isofluraan. Merk op dat de concentratie van de Isofluraan vereist om chirurgische tolerantie van dier op dier variëren kan.
   2. Stabiele chirurgische tolerantie wordt bereikt wanneer het dier niet reageert op de teen-knijpen. Het ademhalingstarief van de muis controleren en aanpassen van de concentratie van Isofluraan indien nodig.
   3. Zalf toepassen door de ogen van het dier te voorkomen uitdroogt.
3. Monteer de muis in een stereotaxic frame oor bars voorzichtig in de gehoorgang invoegt. Zodra het hoofd van de muis wordt gestabiliseerd door de tralies oor, plaatst u een mondstuk op de snuit voor continue Isofluraan levering. Plaatst u de muisaanwijzer op de handdoek of pad op een verwarming pad en buprenorfine subcutaan injecteren (0.05 - 0.1 mg/kg lichaamsgewicht) om postoperatieve analgesie.
4. Scheren van het hoofd met een standaard scheerapparaat en desinfecteren van de huid met 70% ethanol. Met behulp van chirurgische scharen, maken van een incisie in de huid langs de middellijn van de schedel en open de huid met behulp van chirurgische klemmen.
5. Hiermee lijnt u de kop van het dier met de hulp van een stereotaxic uitlijning tool om niveau bregma en lambda. Er moet minder dan 50 µm van hoogte verschuiving tussen bregma en lambda. Bovendien gedefinieerd niveau het hoofd langs de as van de mediolateral door het meten van de diepte van bregma op de schedel oppervlakte op afstanden links en rechts (bijvoorbeeld 1 mm links en rechts van de bregma). Pas de kantelen van het hoofd indien nodig.
6. Schoon het hoofd met 3% waterstofperoxide en veeg droog met steriele katoen doekjes.
7. Bepaal de locatie van de craniotomy ten opzichte van bregma met behulp van een geschikte stereotaxic atlas¹².
8. Met behulp van een 0,9 mm boorkop, boorgaten twee schroef in het been over het cerebellum te plaatsen van de grond en verwijzing schroeven. Bovendien, zijn 1-3 gaten voor verankering schroeven wenselijk om het implantaat te stabiliseren. De locatie van anker schroeven zal afhangen van de locatie van de craniotomy. Voor implantatie in de hippocampus, plaatst u anker schroeven op de contralaterale pariëtale en ipsilaterale frontale cortex. Plaats de schroeven in het bot met behulp van een geschikte schroevendraaier. Wees voorzichtig niet te doordringen in de hersenen.
9. Uitvoeren van de craniotomy door langzaam het uitdunnen van de schedel met de boor in een rechthoekig gebied rond de innesteling kant. Vaak Bevochtig de bone met gesteriliseerde fosfaatbuffer (PB). De resterende verdunde schedel kan voorzichtig worden doorboord en verwijderd met behulp van een fijne (27G) injectie naald en een paar pincet.
10. Zorgvuldig de dura mater te doorboren met een dunne (27G) injectie naald. Vormen een kleine haak door het buigen van de punt van de naald met een pincet en trek de dura voor verwijdering. Toepassing PB om te voorkomen dat de hersenen oppervlak uitdrogen.
11. Monteren van de elektrode inbrengen tool op de houder van een stereotaxic, nul van de sonde op bregma en beweeg de sonde naar de coördinaten van de stereotaxic over de craniotomy. Penetreren langzaam de hersenen oppervlak. Zorg ervoor dat de sonde schachten niet knikken. Voorkomen implanteren via bloedvaten.
12. Langzaam lager de sonde tot ~ 200 µm boven de gewenste diepte. Dekking van de craniotomy en de schenkels van de sonde van de silicium met gesteriliseerde Vaseline voor bescherming. Toepassing tandheelkundige cement om op te lossen van de basis van de sonde naar de verankerende schroef in de schedel.
13. Direct na toepassing van cement, de sonde langzaam naar de doeldiepte verplaatsen. Het bevorderen van de laatst ~ 200 µm na toepassing van het cement vermindert de zijdelingse beweging van de sonde en zorgt voor een minimale weefselschade in het doelgebied. Bedenk dat de uithardingstijd van het cement gebruikt deze stap van het protocol kan beïnvloeden. Met snel uithardend cement, weglaten deze stap en direct de sonde naar de doeldiepte implantaat om te voorkomen dat schade aan de silicium-sonde.
14. Nadat de cement is uitgehard, laat de sonde van de invoegpositie tool door het smelten van de was met een cauterizer.
15. Vrijgeven van het bestuur van de aansluiting van het apparaat van de invoegpositie en plaats deze op een geschikte plaats op de schedel met behulp van een krokodil klem gekoppeld aan het handvat van de invoegpositie. In het geval van de implantatie van de sonde in de hippocampus, het bestuur van de connector op het contralaterale pariëtale bot te plaatsen. Het bestuur van de connector op de schedel met tandheelkundige cement vast te stellen.
16. Soldeer de draden van het grond- en referentie van het bestuur van de verbindingslijn aan de draden aangesloten op de twee schroeven over het cerebellum.
17. Trim de beschermhoes naar de juiste hoogte en plaats deze over de silicium-sonde. Bevestig de cover aan de verbindingslijn bestuur en schedel met tandheelkundige cement, het vermijden van de huid rond de blootgestelde schedel. Wordt de huid rond de implantatie-site is meestal niet vereist.

3. herstel na de operatie

1. Toepassing van passende pijnstillende behandeling gedurende ten minste 2 dagen (bijvoorbeeld subcutane injecties van buprenorfine elke 6 uur overdag en in het drinkwater 's nachts gecombineerd met carprofen (4-5 mg/kg lichaamsgewicht) subcutaan elke 24 h). Single-behuizing wordt aanbevolen ter voorkoming van schade aan het implantaat.
2. Toestaan ten minste een week voor herstel. Overleg met lokale dierenwelzijn richtsnoeren.

4. data-acquisitie

1. Record LFPs vrij bewegen muizen met behulp van een geschikte data-acquisitiesysteem verbonden door middel van een commutator. Gebruiken om te krijgen LFPs, een sampling-frequentie van 1-5 kHz. Hogere samplingfrequenties (20-30 kHz) zijn vereist als single-eenheid lozingen daarvan samen met de LFP worden geregistreerd.
2. Het opslaan van opnamebestanden van de raw van de afzonderlijke kanalen voor off line analyse.

5. histologie

1. Na voltooiing van de opname, anesthetize diep het dier (bv 2 g/kg lichaam gewicht urethaan geïnjecteerd intraperitoneally). Bevestig de verdoving staat door gebrek aan respons tot teen knijpen.
2. Perfuse de transcardially van de muis met ijskoude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (~ 1 min) gevolgd door 4% paraformaldehyde (~ 10 min) met behulp van standaard intracardial perfusie methoden¹³. Voordat perfusie, misschien elektrolytische lesioning van de opname-sites door uitgevoerd (bijvoorbeeld door het toepassen van 10-20 V van constante spanning voor maximaal 1 s). Als alternatief, fluorescente kleurstoffen toegepast op de schacht tips voordat implantatie kan worden gebruikt voor het bijhouden van identificatie. Testen van de verschillende methoden voor de identificatie van de elektrode posities om optimale resultaten te verkrijgen met verschillende soorten silicium sondes wordt aanbevolen.
3. Knip hersenen secties (~ 100 µm) en vlekken van de plakjes met 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 µg/mL) gevolgd door drie wassen stappen in PB (elke 10 min bij kamertemperatuur).
4. Plaats van de secties op een microscoopglaasje, een druppel medium te embedding toepassen en dekking van de sectie met een cover slip. Laat het 's nachts insluiten middellange droog, bij kamertemperatuur.
5. Gebruik een epifluorescence of confocale laser scanning microscoop om vast te stellen de locatie van de sites van de opname.
6. Om het repareren van de silicium-sonde voor verder gebruik, houd de sonde met een krokodil klem en laat de sonde van de scull door zorgvuldig smelten de tandheelkundige cement met een soldeerbout (400 ° C). Wees voorzichtig niet te raken van de sonde Schenkels tijdens deze procedure!
7. Wassen van de sonde in hete gedestilleerd water (~ 80 ° C, 15 min) gevolgd door enzymatische oplossing (1% Tergazyme in gedistilleerd water, 30 minuten bij kamertemperatuur) en een andere wassen stap in gedistilleerd water (15 min). Merk op dat het succestarief van sonde herstel laag is.

6. CSD analyse

1. Met behulp van een geschikte analyse omgeving (bijvoorbeeld Python) converteren LFP gegevens van een individuele Schenkel aan CSD door onderlinge aanpassing van de tweede ruimtelijke afgeleide langs de schacht als
   
   LFP_{n, t} is de LFP-signaal op de electrode^th nop tijdstip t waarbij Δz is de afstand tussen elektrode. Merk op dat als gevolg van de n-1 en n+ 1 acties, de CSD van de elektroden van de eerste en de laatste van de schacht kan niet worden geschat, die genomen moet worden overwogen tijdens de plaatsing van de sonde. De formule van de onderlinge aanpassing met behulp van een korte segment van code die de CSD-signaal voor elke elektrode berekent terwijl doorlopen na verloop van tijd (Zie aanvullende codebestand) implementeren.
2. Het verkregen CSD signaal voor verdere analyse (bijvoorbeeld, het bestuderen van specifieke frequentiebanden van hersenen oscillaties door band pass filters toe te passen) gebruiken.

Resultaten

Figuur 1 illustreert de invoeging-instrument dat wordt gebruikt voor de inplanting van silicium sondes. Opnames van chronisch geïmplanteerde silicium probes gericht op de CA1-gebied en de submodule cellaag van de getand gyrus zijn afgebeeld in Figuur 2. We LFPs van de sonde Schenkels opgenomen tijdens vrije verkeer in de homecage. Om te minimaliseren van het effect van volume geleiding, werden de verkregen signalen omgebouwd tot ...

Discussie

Toenemende bewijzen duiden dat hersenen oscillaties in hippocampal neuronale schakelingen in discrete ruimtelijke domeinen^{10,11,16 voorkomen}. CSD analyse vermindert drastisch de invloed van volume geleiding, een cruciale voorwaarde voor de studie van lokale trilling gebeurtenissen. Met deze video bieden wij een gids voor het implanteren van siliconen sondes in de hippocampus muis voor de analyse van de CSD-gegevens. Representati...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Crocodile clamp with stand	Reichelt Elektronik	HALTER ZD-10D
Silicon probe	Cambridge Neurotech	P-series 32
Stereoscope	Olympus	SZ51
Varnish-insulated copper wire	Bürklin Elektronik	89 F 232
Ground screws	Screws & More GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
Flux	Stannol	114018
Ceramic-tipped forceps	Fine Science Tools	11210-60
Paraffine Wax	Sigma-Aldrich	327204
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00
Soldering iron	Kurtz Ersa	OIC1300
Multimeter	Uni-T	UT61C
Ethanol	Carl Roth	9065.1
Pasteur pipettes	Carl Roth	EA65.1
Heat sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Stereotaxic frame	David Kopf	Model 1900
Stereotaxic electrode holder	David Kopf	Model 1900
Isoflurane	Abbvie	B506
Oxygen concentrator	Respironix	1020007
Buprenorphine	Indivior UK Limited
Electrical shaver	Tondeo	Eco-XS
Heating pad	Thermolux	463265/-67
Surgical clamps	Fine Science Tools	18050-28
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009
Sterile cotton wipes	Carl Roth	EH12.1
Drill	Proxxon	Micromot 230/E
21G injection needle	B. Braun	4657527
Phosphate buffer/phosphate buffered saline
Stereotaxic atlas	Elsevier	9.78012E+12
Surgical scissors	Fine Science Tools	14094-11
Surgical forceps	Fine Science Tools	11272-40
27G injection needles	B. Braun	4657705
Vaseline
Dental cement	Sun Medical	SuperBond T&M
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50mg/ml
Recording amplifier	Intan Technologies	C3323
USB acquisition board	Intan Technologies	C3004
Recording cables	Intan Technologies	C3216
Electrical commutator	Doric lenses	HRJ-OE_FC_12_HARW
Acquisition software	OpenEphys (www.open-ephys.org)	GUI	maakt platformonafhankelijke data-acquisitie mogelijk
Computer for data acquisition
Analysis environment	Python (www.python.org)		maakt platformonafhankelijke data-analyse mogelijk
Urethane	Sigma-Aldrich
Vibratome	Leica	VT1000
Microscope slides	Carl Roth	H868.1
Cover slips	Carl Roth	H878.2
Embedding medium	Sigma-Aldrich	81381-50G
Distilled water	Millipore	Milli Q	Tabelbladmachine voor de productie van gedestilleerd water
Tergazyme	Alconox	Tergazyme