Voorbereiding van de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsel voor moleculaire en analyse van Immunohistochemical in Drosophila

Summary

Hier presenteren we een protocol om te stagen en ontleden olfactorische weefsel van Drosophila diersoorten te ontwikkelen. Het ontleed weefsel kan later worden gebruikt voor moleculaire analyses, zoals kwantitatieve RT-PCR (Reverse transcriptie-Polymerase Chain Reaction) of RNA sequencing (RNAseq), evenals in vivo analyses uitgevoerd, zoals immunohistochemistry of in situ hybridisatie.

Abstract

De olfactorische systeem van Drosophila is een veelgebruikt systeem in developmental neurobiologie, systemen neurowetenschappen, evenals neurofysiologie, gedrag en gedrags evolutie. Drosophila olfactorische weefsels huis de olfactorische receptor neuronen (ORNs), die vluchtige chemische signalen naast hydro - en thermo-sensoriële neuronen detecteren. In dit protocol beschrijven we de dissectie van de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsel van de volwassen Drosophila soorten. Eerst beschrijven we hoe stagen en leeftijd Drosophila larven, gevolgd door de dissectie van de antennal schijf van vroege pop stadia, gevolgd door de dissectie van de antennes van medio-pop podia en volwassenen. We tonen ook methoden waar de voorbereidingen in moleculaire technieken, zoals de RNA extractie voor qRT-PCR, RNAseq of immunohistochemistry kunnen worden gebruikt. Deze methoden kunnen ook worden toegepast op andere soorten Drosophila na soortspecifieke pop ontwikkelingstijd worden bepaald, en de respectieve fasen worden berekend voor passende veroudering.

Introduction

De olfactorische systeem van Drosophila is een veelgebruikt systeem in developmental neurobiologie, systemen neurowetenschappen, evenals neurofysiologie, gedrag studies en gedrags evolutie^{1,2,3, 4}. Drosophila olfactorische weefsels huis de olfactorische receptor neuronen (ORNs) die vluchtige chemische signalen naast hydro - en thermo-sensorische neuronen^1,5,6te detecteren. Het algemene doel van dit manuscript is om aan te tonen ho....

Protocol

Het volgende protocol is in overeenstemming met de richtsnoeren van de ethiek door het Duke University onderzoek ethisch comité vastgesteld.

1. de weefsels voorbereiding en Developmental enscenering van Drosophila melanogaster Verpopping

1. Kies eerst hoeveel vliegen nodig zal zijn voor de dissectie. Voor RT-PCR en RNAseq, 100-200 antennal schijven en antennes van individuen die nodig in prepupal, 8 h APF, 40 h APF, en volwassen stadia zijn te verzamelen. Ontleden voor immunohistochemistry, 10-20 individu.
2. Alle materialen, met inbegrip van hersendissectie pads en pincet, doekjes met 70% reinigen EtOH. Als de ontlee....

Results

De ontleed ontwikkelende olfactorische weefsels voor RNA extractie gevolgd door RT-PCR kan worden gebruikt voor het beoordelen van de genexpressie of via de protocollen van immunohistochemistry kan worden genomen om te bepalen zijn expressiepatroon, en de sub cellulaire lokalisatie van genen van belang. In deze sectie presenteren wij representatieve resultaten uit beide protocol. Figuur 1 is de vertegenwoordiger kwantitatieve RT-PCR de transcriptie van cel op.......

Discussion

Dit protocol is een nuttige bron voor labs geïnteresseerd in het identificeren van de genetische en transcriptionele programma's actief in het ontwikkelen van Drosophila olfactorische weefsel, evenals een vergelijkende analyse van deze programma's over Drosophila soorten. Het is vooral nuttig als systemen-niveau transcriptionele profielen uit verschillende ontwikkelingsstadia nodig zijn als een primer voor toekomstige studies. Het protocol beschreven hier laat zien hoe stagen en isoleren olfactorische w.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Phosphate-buffered Saline	Gibco	70011-044	Dilute to 1X in RNase free water
CO2 tank	Air Gas	CD R200
Two sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	RNA isolation solutions
Dissecting Microscope
Small bucket with ice
P20 and P200 micropipettes and tips
1.7 mL Microfuge tubes			Purchase nuclease free for best results
0.2 mL PCR tubes
Paraformaldehyde powder	Polysciences	380
10% Triton X-100	Teknova	T1105	Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS
2" petri dishes
55mm filter paper	Whatman	1001-055	Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist
25 C incubator
deionized H2O			Purchase nuclease free or treat with DEPC
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers.
MicroWell Mini Trays with lids	Nunc	438733	Lids can be used to make silicone dissection pads
Rabbit anti-GFP antibody	MBL international corpor	PM005	primary antibody
Mouse anti RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	primary antibody
ADL195 (anti lamin, mouse)	Dev studies hydoma ban	ADL195-s	primary antibody
Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)	invitrogen	A11008	Secondary antibody
Cy3 Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	Secondary antibody
Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered	CALBIOCHEM	648463	detergent
Lab Rotator	Thermo scientific		Rotator
Nuclease Free Water	Growcells.com	NUPW-0125	Water
Light-Duty Tissue Wipers	VWR	82003-822	For cleaning dissection supplies
Superscript II	invitrogen	18064014	Reverse Transcriptase
QIAshredder (50)	RNA extraction	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	life technologies	18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)	RNA extraction	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix	qPCR	NEB	M0541S