Method Article

Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

DOI:

10.3791/57719

⸱

May 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Science, Plant Genomics and Breeding Institute, College of Agriculture and Life Science, Seoul National University, 2Department of Bioindustry and Bioresource Engineering, Sejong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriën, een van de belangrijkste oorzakelijke agens van diverse plantenziektes, afscheiden een aantal effector eiwitten in de plant gastheercel te ondermijnen van het immuunsysteem van de plant. Tijdens de infectie cytoplasmatische effectoren afgeleverd bij het cytosol host via een type III secretie systeem (T3SS). Na de levering in de cel van de plant, de effector(s) is gericht op de specifieke compartment(s) om te moduleren host cel processen voor overleving en replicatie van het pathogene agens. Hoewel er al wat onderzoek op de subcellular localisatie van effector eiwitten in de cellen van de gastheer om hun functie in pathogeniteit te begrijpen met behulp van fluorescente proteïnen, onderzoek van de dynamiek van de effectoren direct ingespoten van bacteriën heeft zijn uitdagend als gevolg van de incompatibiliteit tussen de T3SS en de fluorescente proteïnen.

Hier beschrijven we onze recente methode van een geoptimaliseerde split superfolder groen fluorescent proteïne systeem (sfGFPOPT) te visualiseren van de lokalisatie van de effectoren geleverd via de bacteriële T3SS in de gastheercel. De sfGFP11 (11th β-onderdeel van sfGFP)-tagged effector uitgescheiden via het T3SS kan worden gemonteerd met een specifieke organel gericht sfGFP1-10OPT (1-10th β-onderdeel van sfGFP) voorloop fluorescentie uitstoot op de site. Dit protocol wordt een procedure beschreven om te visualiseren het gereconstitueerde sfGFP fluorescentie signaal met een effector eiwit van Pseudomonas syringae in een bepaalde organel in het Arabidopsis en Nicotiana benthamiana planten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Planten zijn sessiele organismen die talrijke invasie ziekteverwekkers zoals bacteriën, schimmels, virussen, insecten en nematoden gedurende hun hele levenscyclus optreden. Onder de planteziekteverwekkers, infecteren de gram-negatieve bacteriële pathogenen zoals Pseudomonas spp. en Ralstonia spp., hun waardplanten door te voeren door middel van wonden of natuurlijke openingen, zoals de stoma en de Waterporie1. Om met succes koloniseren gastheerplanten, zijn bacteriële pathogenen geëvolueerd om een verscheidenheid van virulentie factoren2. Wanneer bacteriën een waardplant binnenvallen, zij een reeks van virulentie eiwitten injecteren — bekend als effectoren — rechtstreeks in de plantencellen te bevorderen hun pathogeniteit. Deze effectoren onderdrukken of het moduleren van de plant aangeboren immuniteit en manipuleren van de host cellulaire processen om te leiden tot bacteriële survival3.

Pathogene bacteriën maken hoofdzakelijk gebruik van een T3SS om effector eiwitten leveren rechtstreeks in gastheer cellen4. De T3SS lijkt op een moleculaire injectiespuit met een naald-achtige kanaal verbinding maakt vanaf een steiger eiwitstructuur via de binnenste en de buitenste bacteriële membranen op de site van de injectie van de ontvangende cel5. Dit T3SS-gemedieerde effector (T3E) secretie mechanisme is zowel goed geconserveerde in verschillende gram-negatieve bacteriële pathogenen van de plant als menselijk. Één van de representatieve plant pathogenen, de P. syringae pv. Tomaat DC3000 hrcC mutant die heeft meestal een defecte T3SS, heeft de groei van planten die waarschijnlijk te wijten aan het onvermogen van deze mutant volledig onderdrukken de plant immuniteit (door het injecteren van effector eiwitten)6beperkt. Bij translocatie in de cellen van de gastheer richten effectoren verschillende host eiwitten die belangrijk voor het hostsysteem cel zijn, met inbegrip van plant verdediging reacties, gene transcriptie celdood, proteasoom, blaasje mensenhandel en hormoon trajecten7 , 8 , 9 , 10. Daarom, bijhouden van de cellulaire lokalisatie van de effector eiwitten in de cellen van de gastheer is een aantrekkelijk doelwit te begrijpen hun taken met betrekking tot de modulatie van de immuniteit van de plant.

De meeste van de studies van de lokalisatie van de T3Es hebben Agrobacterium -gemedieerde overexpressie met een grote fluorescentie-eiwit in de plant host9werkzaam. Echter is de methode heterologe expressie voor genen die worden ingevoerd in andere soorten gebleken te zijn mis gelokaliseerde of af en toe niet-functionele11,12,13. Verschillende studies bleek bovendien dat bacteriële effectoren wijziging voor juiste targeting in de ontvangende cellen14,15,16,17ondergaat. Daarom uitgedrukt Transient effectoren in het cytosol van de plant cellen mogelijk niet functioneel of kwantitatief identiek aan de effectoren die worden geleverd door de T3SS op pathogen infectie18. Bovendien, de fusie van grote fluorescerende labels aan effector eiwitten kan het verstoren van de juiste effector levering en visualisatie18,19. Daarom kunnen deze benaderingen te assay de T3E functie niet volledig overeen met de inheemse lokalisatie van de T3SS-uitgescheiden effectoren.

Een groen fluorescente proteïne (GFP) bestaat uit een 11-stranded β-vat bijvoeging van een centraal onderdeel waarin een chromofore20. Waldo et al. een nieuwe split-GFP-systeem dat uit een klein onderdeel bestaat gemeld (GFP β onderdeel 11; GFP11) en een grote aanvullende fragment (GFP β deel 1-10; GFP1-10)21. De fragmenten niet zelf lichten maar lichten op hun zelfstandige vereniging wanneer beide fragmenten in de directe nabijheid met elkaar zijn. Voor de optimalisatie van de opvouwbare efficiëntie van eiwit, werden robuuste opvouwbare varianten van het GFP, dat wil zeggen, sfGFP en sfGFPOPT, later ontwikkeld voor de split GFP systeem20,21,22. Onlangs, één aminozuur gemuteerd varianten van sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT en sfCFP1-10OPT- dat kan reconstrueren met een fragment van de sfGFP11, en Toon geel en cyaan fluorescentie respectievelijk werden gegenereerde23 . Bovendien, sfCherry, een afgeleide van mCherry, kan worden opgesplitst in sfCherry1-10 en sfCherry11 fragmenten op dezelfde wijze als sfGFP23.

Dit systeem is aangepast label en bijhouden van de effectoren van de T3SS in HeLa cellen tijdens de infectie met behulp van de effectoren van Salmonella24. Echter, het was eerder niet geoptimaliseerd voor het hostsysteem plant-bacteriële pathogenen. Onlangs, geoptimaliseerd we het split GFP systeem op basis van de verbeterde sfGFP1-10OPT te controleren de subcellular localisatie van de T3Es verlost van P. syringae in plantaardige cellen25. Ter vergemakkelijking van de studies van de lokalisatie van de T3Es naar verschillende subcellular compartimenten in de plantencellen, een set van transgene Arabidopsis thaliana werden planten gegenereerd om uit te drukken van sfGFP1-10OPT in de diverse compartimenten van subcellular 25. Bovendien, de uitvoering van een verscheidenheid van plasmiden organel-gerichte sfGFP1-10OPT voor de Agrobacterium-gemedieerde voorbijgaande overexpressie en de sfGFP11-gelabeld vectoren voor de T3SS gebaseerde effector levering ook werden gegenereerd. De zaden van verschillende transgene Arabidopsis lijnen en de plasmiden wil de T3Es van belang kunnen worden verkregen uit bronnen die zijn vermeld in de Tabel van materialen26,27.

In het volgende protocol beschrijven we een geoptimaliseerde systeem voor het controleren van de dynamiek van de effectoren geleverd door bacteriën in de cellen van de gastheer met behulp van de split sfGFP-systeem. Infectie van planten uiting van sfGFP1-10OPT met transgene Pseudomonas uitvoering van recombinante sfGFP11 plasmide resulteert in een levering van de sfGFP11-gelabeld effector van Pseudomonas in de gastheercel. Daarom deze eiwitten worden gereconstitueerd en translocate aan de specifieke effector doel compartment(s). De Pseudomonas syringae pv. tomaat CUCPB5500 stam waarin 18 effectoren zijn verwijderd, werd gebruikt omdat deze soort toonde weinig of geen celdood in zowel A. thaliana en N. benthamianas28. Alle materialen en stappen die hier worden beschreven kan echter worden vervangen of gewijzigd om aan te passen van het systeem van de split-sfGFP voor onderzoek van andere biologische vragen of optimalisatie in de gegeven laboratoriumomstandigheden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld.

1. bereiding van plantaardige materialen (4 weken)

  1. Voorbereiding voor het planten van de N. benthamiana
    1. 2 zaaien van N. benthamiana op het bodemoppervlak van elke pot, bedek het dienblad met een kunststof koepel, en zaden ontkiemen in een 25 ° C, 60% vochtigheid groei kamer met een 16/8-h licht/donker fotoperiode cyclus toestaan.
    2. Na twee weken, uitzoeken en negeren de kleinste zaailing in elke pot blijven groeien planten onder dezelfde voorwaarden groei als de kiemkracht vermeld in stap 1.1.1 aangevraagd. Voeg 1 liter water per lade om de twee dagen.
      Opmerking: De voorwaarden van de groei voor planten kunnen labs varieert. Daarom volgen het reguliere drenken protocol om te groeien de planten in een gezonde toestand.
    3. In een week, de planten overdragen aan een nieuwe lade en schik ze met voldoende ruimte voor verdere groei. Blijven groeien de planten onder de voorwaarden beschreven in stap 1.1.1 totdat ze klaar zijn om op leeftijd van 4 weken worden geïnfiltreerd.
      Opmerking: Plantengroei kan verschillen afhankelijk van de conditie van de groei labs. Meestal vinden we dat de 4-week-oude N. benthamiana planten dragen ongeveer zes bladeren.
  2. Voorbereiding van A. thaliana transgene planten
    1. Verwijzen naar de Tabel van de materialen en de transgene Arabidopsis zaden bestellen.
    2. Geniet van ~ 50-100 transgene Arabidopsis zaden in 1 mL gedestilleerd water en bewaar ze bij 4 ° C voor 3 dagen in het donker te synchroniseren van het begin van de kiemkracht.
    3. Zaaien van ~ 2-3 op het bodemoppervlak van de lade van een plug plant en bedek het dienblad met een kunststof koepel. Zaden ontkiemen bij 23 ° C, 60% vochtigheid met een cyclus van 10/14-h licht/donker fotoperiode toestaan.
      Opmerking: De zaden moeten worden homozygotes. Wij raden echter aan het herbevestigen van de aanwezigheid van de transgenic in de batch. In dit geval de zaden te steriliseren door wassen met 70% ethanol voor 2 min, 50% bleekwater (ongeveer 2% hypochloriet) met 0,05% triton X-100 voor 5 min. volgen door 5 - 6 keer wassen met steriele dubbel gedestilleerd water (ddH2van O). Na sterilisatie, stratificeren bij 4 ° C voor 3 dagen en plaat hen op plant kiemkracht media met 25 µg/L hygromycin B te selecteren de transgene planten.
    4. Na een week, laat slechts één plant per plug en blijven groeien planten onder dezelfde voorwaarden groei gebruikt voor stap 1.2.3.
      Opmerking: Vier weken oude planten werden gebruikt voor de P. syringae infectie. Planten water om de andere dag planten om gezond te houden.

2. voorbereiding van Pseudomonas cultuur (~ 1 Week)

  1. Bouw van de plasmide voor Pseudomonas transformatie
    1. Verwijzen naar de Tabel van de materialen en de gewenste vector(s) van de T3SS gebaseerde effector uitvoeringssysteem vector25bestellen.
    2. Plaats de effector gen van belang in de effector levering vector met behulp van site-specifieke recombinatie klonen van25.
      Opmerking: Bij de bewaking van subcellular localisatie van full-length effector eiwit, zet het full-length gen in pBK-GW-1-2 of pBG-GW-1-2. Het is ook mogelijk om te kiezen van pBK-GW-1-4 of pBG-GW-1-4 met 2 x sfGFP11 voor verhoogde fluorescentie signaal. Gebruik in het geval van een gedeeltelijke effector signaal peptide ontbreekt, pBK-GW-2-2 of pBK-GW-2-4. Verwijzen naar Park et al. voor gedetailleerde informatie over effector levering vectoren25.
  2. Transformatie de plasmide uitvoering een effector gesmolten aan de sfGFP11 tag aan P. syringae pv. Tomaat (Pst) CUCPB5500 met behulp van standaard electroporation29.
    Opmerking: Andere Pseudomonas -stammen kunnen worden gebruikt indien nodig. De sfGFP11 tag systeem is gebouwd voor een breed scala van vectoren30 en de genexpressie van de effector wordt gereguleerd door de promotor van de AvrRpm1, die vergelijkbaar is met, bijvoorbeeld, Pseudomonas fluorescens (EthAn)31.
  3. Verspreid de getransformeerde bacteriecellen zachtjes over het oppervlak van de King's B agar platen met 100 µg/mL rifampicine en 25 µg Mo/mL kanamycine of 25 µg Mo/mL gentamycine. Incubeer bij 28 ° C gedurende 2 dagen.
  4. Enten van een kolonie in King's B vloeibare media met antibiotica geschikt is voor de gebruikte vector, en groeien de cellen 's nachts bij 28 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
  5. Maak een glycerol voorraad. Gesteriliseerde met autoclaaf glycerol toevoegen om een eindconcentratie van 50% en winkel bij-80 ° C.

3. Pre-steady uitdrukking van organel-gerichte sfGFP1-10OPT in N. benthamiana (4 dagen)

  1. Voorbereiding van Agrobacterium cultuur
    1. Om de gewenste vector(s) van sfGFP1-10OPT -plasmid(s) organel-gerichte (Zie de Tabel van de materialen).
    2. Het plasmid(s) omvormen Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 cellen32. Groeien de cellen op de drager van de agar Luria Bertani (LB) aangevuld met 50 µg Mo/mL kanamycine en 50 µg Mo/mL rifampicine bij 28 ° C gedurende 2 dagen.
    3. Uit een één kolonie op de drager van de LB-agar, de cellen te enten in 5 mL vloeibare LB-media, aangevuld met 50 µg Mo/mL kanamycine en 50 µg Mo/mL rifampicine. Groeien de cellen 's nachts bij 28 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
    4. Oogst de cellen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 10 min. Giet af de media supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL vers gemaakt infiltratie buffer.
    5. Meten van de hoeveelheid Agrobacterium door het verkrijgen van de optische dichtheid (OD) waarde op een extinctie van 600 nm (Abs 600 nm). De OD-600 van de bacteriën naar 0,5 met infiltratie buffer passen.
      Opmerking: 1 mL van de opschorting is genoeg om te infiltreren op twee plekken.
    6. Laat de cultuur bij kamertemperatuur op een zacht rocker voor 1-5 h voor infiltratie.
    7. Steken een gat in het midden van de bladeren te worden geïnfiltreerd met een 10 µL-tip. Gebruik een naaldloze spuit van 1 mL om te infiltreren in de Agrobacterium schorsingen. Zorgvuldig en langzaam injecteren ongeveer 500 µL van de schorsingen bereid uit stap 3.1.5 in de adaxial kant van het blad via de spuit. Herhaal de infiltratie op ten minste drie verschillende planten voor experimentele wordt gerepliceerd.
      Opmerking: Om redenen van gezondheid en veiligheid, oogbescherming moet gedragen worden tijdens de infiltratie.
    8. Veeg de overgebleven bacteriële suspensie op de bladeren en de grens van de geïnfiltreerde regio te markeren.
    9. Houd de geïnfiltreerde planten onder dezelfde voorwaarden groei 2 dagen gebruikt voor stap 1.1.1.

4. de inoculatie van Pseudomonas (4 dagen)

  1. Streep de getransformeerde Pseudomonas -stam uit de voorraad van glycerol in stap 2.5 op King's B agarmedia met de juiste antibiotica bij 28 ° C gedurende 2 dagen.
    Opmerking: De gezondheid van Pseudomonas is zeer kritisch. Als kolonies geen goed vormen, strijk de cellen opnieuw of verspreiden van de cellen in het King's vloeibare media voordat u verdergaat.
  2. Inoculeer een entoog van Pseudomonas cellen in Mannitol-glutamaat (MG) vloeibare media bij 28 ° C met schudden bij 200 t/min voor overnachting.
  3. Oogst de cellen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 10 min. Giet af het supernatant media, resuspendeer de pellet in 10 mM MgCl2, en aanpassen van de OD600 tot 0,02 (1 x 107 cfu/mL) voor N. benthamiana bladeren en 0.002 (1 x 106 CFU/mL) voor Arabidopsis . verlaat
  4. Voor de N. benthamiana, infiltreren de Pseudomonas schorsing in het gebied van de bladeren waar het Agrobacterium sfGFP1-10OPT construct uitvoering 2 dagen eerder (zoals in stap 3.1.7) was geïnfiltreerd. Voor de sfGFP1-10OPT transgene Arabidopsis, infiltreren de Pseudomonas schorsing in twee 4-week-oude korte dag geteelde bladeren.
    Opmerking: ten minste drie fabrieken zijn nodig voor experimentele wordt gerepliceerd.

5. waarneming van sfGFP signaal via confocale microscopie (1 dag)

  1. Knip het blad schijf van de Pseudomonas-geïnoculeerd bladeren. Beeld op specifieke tijdstippen na infiltratie van Pseudomonas, twee schijven van 2 cm2 blad van de enkele plant met behulp van een laser scannen confocal systeem met 40 X / 1.2 nb C-Apochromat water onderdompeling doelstelling of 63 X / 0.8 nb C-Apochromat olie-immersie doelstelling. Om te voorkomen dat de dode cellen gedood door verwonding, observeren de cellen uit de buurt van het gat van de infiltratie.
  2. Start de observatie op een instelling van het lage vermogen van de laser 488-nm argon. Verhoog het vermogen van de laser te detecteren van sfGFP.
    Opmerking: We gebruiken meestal 2-15% van de intensiteit van de laser om de fluorescentie-signaal te detecteren. Echter, de kracht van de laser en detectie instelling moeten worden aangepast op basis van microscopie-systeem van de gebruiker. Hier werden de emissie filters ingesteld op 520-550 nm. De dode cellen uitstoten vaak auto-fluorescentie onder de 488-nm laser excitatie. Daarom, als een negatieve controle, moet de dezelfde effector zonder de sfGFP11 tag worden geïnfiltreerd en waargenomen onder dezelfde voorwaarden observatie. Daarnaast kan de hoge laser excitatie chlorofyl autofluorescence veroorzaken. Daarom, pas de intensiteit van de laser met behulp van het besturingselement plantencellen dus niet voor het opwekken van chlorofyl autofluorescence.
    1. Voor een counterstaining van de celwand, 20 mM propidium jodide (PI) te infiltreren in het discstation. blad op 5-10 min vóór observatie.
    2. Voor de kern kleuring, dompelen de blad-schijven in 0,1% paraformaldehyde gedurende 5 minuten, gevolgd door wassen met water. Vervolgens infiltreren de 10 mM PI in het discstation. blad op 5-10 min voor microscopische waarneming. Herhaal de experimenten ten minste driemaal.
      Opmerking: Deze stap is niet kritisch, maar nuttig zijn voor het definiëren van de lokalisatie van de effector op het plasma-membraan of de kern. Als de effectoren van belang hun lokalisatie in een specifieke organel toonde, kunt een marker voor de gegeven organel bevestigen de lokalisatie van de effector.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De structuur van de β-vat van GFP bestaat uit elf β strengen en kan worden onderverdeeld in twee fragmenten, de 1-10th strand (GFP1-10OPT) en het onderdeelth (GFP11) 11. Hoewel geen van de twee fragmenten fluorescerende zelf, kan zelf geassembleerde sfGFP de fluorescentie uitstoten wanneer de twee fragmenten aanwezig zijn in de nabijheid (figuur 1A). In dit systeem, de sfGFP1-10OPT-uiting van Arabidopsis of...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol hier beschreven wordt gebruikt voor het toezicht op de nauwkeurige lokalisatie van de eiwitten van de effector geïnjecteerd door de bacteriële T3SS in de gastheercel plant na infectie. Eerder, het split GFP systeem werd gebruikt als een instrument om te studeren de subcellular localisatie van zoogdieren eiwitten23,36, Salmonella T3E lokalisatie en Agrobacterium VirE2 bezorging via de T4SS in de plantaardige cellen3...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gesteund door fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT en toekomstige Planning (NRF-2018R1A2A1A05019892) naar DC en door een subsidie van Plant Molecular Breeding Center) PMBC) van de volgende generatie Biogreen 21-programma van de landelijke ontwikkeling administratie (PJ013201) aan de EP. Wij danken het imaging center van het National Instrumentation Center for Environmental Management om een confocal microscoop voor het filmen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Arabidopsis transgene lijnenPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Ruimtelijk en tijdelijk toezicht op Pseudomonas syringae effectoren via Type III secretie met behulp van gesplitste fluorescente eiwitfragmenten. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10ABRCCS69831
NU-sfGFP1-10ABRCCS69832
PT-sfGFP1-10ABRCCS69833
MT-sfGFP1-10ABRCCS69834
PX-sfGFP1-10ABRCCS69835
ER-sfGFP1-10ABRCCS69836
GO-sfGFP1-10ABRCCS69837
PM-sfGFP1-10ABRCCS69838
Organel-doelgerichte sfGFP1-10OPT-plasmidePark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Ruimtelijk en tijdelijk toezicht op Pseudomonas syringae effectoren via Type III secretie met behulp van gesplitste fluorescente eiwitfragmenten. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10Addgene97387
NU-sfGFP1-10Addgene97388
PT-sfGFP1-10Addgene97389
MT-sfGFP1-10Addgene97390
PX-sfGFP1-10Addgene97391
ER-sfGFP1-10Addgene97392
GO-sfGFP1-10Addgene97393
PM-sfGFP1-10Addgene97394
ER-sfCherry1-10Addgene97403
ER-sfYFP1-10Addgene97404
CYTO-sfCFP1-10Addgene97405
sfGFP11-gelabeld Gateway-compatibel vector voor T3SS-gebaseerd effector-afleveringssysteemPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Ruimtelijk en tijdelijk toezicht op Pseudomonas syringae effectoren via Type III secretie met behulp van gesplitste fluorescente eiwitfragmenten. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2Addgene98250pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente tegen kanamycine (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4Addgene98251pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente tegen kanamycine (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2Addgene98252pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente tegen kanamycine (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4Addgene98253pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente tegen kanamycine (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2Addgene98254pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente tegen Gentamycine (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4Addgene98255pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente tegen Gentamycine (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2Addgene98256pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente tegen Gentamycine (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4Addgene98257pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente tegen Gentamycine (25 ug/ml)
Bacteriestammen
Agrobacterium tumefaciens GV3101Csaba Koncz en Jeff Schell, Het promotor van TL-DNA-gen 5 regelt de weefselspecifieke expressie van chimerische genen die worden gedragen door een nieuw type Agrobacterium binair vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistente tegen gentamycine (50 ug/ml) en rifampicine (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500Kvitko, B. H. et al. Deletions in het repertoire van Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 type III secretie-effectorgene onthullen functionele overlapping tussen effectoren. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistente tegen rifampicine (100 ug/ml)
Mediacomponenten
PlantkiemmediumVoeg 2.165g/L Murashige & Skoog-poeder, 10 g/L sucrose toe aan water. Pas aan naar pH 5.8 en voeg 2.2 g/L fytagel toe. Autocalve.
Murashige & Skoog medium inclusief vitaminenDuchefa BiochemieM0222Bewaar bij 4 °C.
SucroseDuchefa BiochemieS0809
FytagelSigma-AldrichP8169
LB-mediumVoeg 10 g/L tryptone, 5 g/L gistextract, 10 g/L NaCl toe aan water. Voor vaste media, voeg 15 g/L micro-agar toe. Autoclave.  Laat

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
  2. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
  3. Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
  4. Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
  5. Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4(2013).
  6. Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
  7. Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
  8. Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
  9. Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
  10. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  11. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
  12. Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
  13. Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
  14. Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
  15. Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
  16. Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
  17. Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563(2012).
  18. Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  19. Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59(2008).
  20. Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
  21. Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
  22. Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854(2013).
  23. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046(2016).
  24. Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
  25. Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
  26. Addgene. , Available from: https://www.addgene.org (2018).
  27. Arabidopsis Biological Resource Center. , Available from: https://abrc.osu.edu (2018).
  28. Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388(2009).
  29. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  30. Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
  31. Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
  33. Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
  34. Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
  35. Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
  36. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
  37. Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
  38. Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Split GFP SystemEffector Protein DeliveryType III Secretion SystemConfocal MicroscopyPseudomonas SyringaeArabidopsis ThalianaNicotiana BenthamianasfGFP11 TagOrganelle TargetingFluorescence Reconstitution

Related Articles