Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

Summary

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Abstract

Bacteriën, een van de belangrijkste oorzakelijke agens van diverse plantenziektes, afscheiden een aantal effector eiwitten in de plant gastheercel te ondermijnen van het immuunsysteem van de plant. Tijdens de infectie cytoplasmatische effectoren afgeleverd bij het cytosol host via een type III secretie systeem (T3SS). Na de levering in de cel van de plant, de effector(s) is gericht op de specifieke compartment(s) om te moduleren host cel processen voor overleving en replicatie van het pathogene agens. Hoewel er al wat onderzoek op de subcellular localisatie van effector eiwitten in de cellen van de gastheer om hun functie in pathogeniteit te begrijpen met behulp van fluorescente proteïnen, onderzoek van de dynamiek van de effectoren direct ingespoten van bacteriën heeft zijn uitdagend als gevolg van de incompatibiliteit tussen de T3SS en de fluorescente proteïnen.

Hier beschrijven we onze recente methode van een geoptimaliseerde split superfolder groen fluorescent proteïne systeem (sfGFP^OPT) te visualiseren van de lokalisatie van de effectoren geleverd via de bacteriële T3SS in de gastheercel. De sfGFP11 (11^th β-onderdeel van sfGFP)-tagged effector uitgescheiden via het T3SS kan worden gemonteerd met een specifieke organel gericht sfGFP1-10^OPT (1-10^th β-onderdeel van sfGFP) voorloop fluorescentie uitstoot op de site. Dit protocol wordt een procedure beschreven om te visualiseren het gereconstitueerde sfGFP fluorescentie signaal met een effector eiwit van Pseudomonas syringae in een bepaalde organel in het Arabidopsis en Nicotiana benthamiana planten.

Introduction

Planten zijn sessiele organismen die talrijke invasie ziekteverwekkers zoals bacteriën, schimmels, virussen, insecten en nematoden gedurende hun hele levenscyclus optreden. Onder de planteziekteverwekkers, infecteren de gram-negatieve bacteriële pathogenen zoals Pseudomonas spp. en Ralstonia spp., hun waardplanten door te voeren door middel van wonden of natuurlijke openingen, zoals de stoma en de Waterporie¹. Om met succes koloniseren gastheerplanten, zijn bacteriële pathogenen geëvolueerd om een verscheidenheid van virulentie factoren². Wanneer bacteriën een waardplant binnenvallen, zij een reeks van ....

Protocol

Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld.

1. bereiding van plantaardige materialen (4 weken)

1. Voorbereiding voor het planten van de N. benthamiana
   1. 2 zaaien van N. benthamiana op het bodemoppervlak van elke pot, bedek het dienblad met een kunststof koepel, en zaden ontkiemen in een 25 ° C, 60% vochtigheid groei kamer met een 16/8-h licht/donker fotoperiode cyclus toestaan.
   2. Na twee weken, uitzoeken en negeren de kleinste zaailing in elke pot blijven groeien planten onder dezelfde voorwaarden groei als de kiemkracht vermeld in stap 1.1.1 aangevraagd. Voe....

Results

De structuur van de β-vat van GFP bestaat uit elf β strengen en kan worden onderverdeeld in twee fragmenten, de 1-10^th strand (GFP1-10^OPT) en het onderdeel^th (GFP11) 11. Hoewel geen van de twee fragmenten fluorescerende zelf, kan zelf geassembleerde sfGFP de fluorescentie uitstoten wanneer de twee fragmenten aanwezig zijn in de nabijheid (figuur 1A). In dit systeem, de sfGFP1-10^OPT-uiting van Arabidopsis of.......

Discussion

Het protocol hier beschreven wordt gebruikt voor het toezicht op de nauwkeurige lokalisatie van de eiwitten van de effector geïnjecteerd door de bacteriële T3SS in de gastheercel plant na infectie. Eerder, het split GFP systeem werd gebruikt als een instrument om te studeren de subcellular localisatie van zoogdieren eiwitten^23,36, Salmonella T3E lokalisatie en Agrobacterium VirE2 bezorging via de T4SS in de plantaardige cellen^3.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidopsis transgenic lines			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
PT-sfGFP1-10	Addgene	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene	97391
ER-sfGFP1-10	Addgene	97392
GO-sfGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfCherry1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
CYTO-sfCFP1-10	Addgene	97405
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500			Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)
Media components
Plant germination media			Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium including vitamins	Duchefa Biochemie	M0222	Store at 4 °C.
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
LB media			Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.  Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed.
Tryptone	BD Bioscience	211705
Yeast extract	BD Bioscience	212750
NaCl	Duchefa Biochemie	S0520
Micro agar	Duchefa Biochemie	M1002
King's B media			10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.
Proteose peptone	BD Bioscience	212120
Anhydrous K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Glycerol	Duchefa Biochemie	G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Bacto Agar	BD Bioscience	214010
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media			Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7
Mannitol	Duchefa Biochemie	M0803
L-glutamic acid	Duchefa Biochemie	G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
Infiltration buffer			10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.
MES	Duchefa Biochemie	M1503	Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406	Prepare 150 mM stock in DMSO.
Confocal microscope equipments/materials
710 laser scanning confocal system	Carl Zeiss
Axio observer Z1 inverted microscope	Carl Zeiss
Propidium iodide	ThermoFisher	P1304MP