Methodenartikel

Een test van de Neurosphere voor de evaluatie van de activering van de endogene neurale stamcellen in een muismodel van minimale dwarslaesie

DOI:

10.3791/57727

⸱

13 september 2018

 ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Surgery, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier tonen we de prestaties van een minimale ruggenmerg letsel model in een volwassen muis die de centrale kanaal niche huisvesting endogene neurale stamcellen (NSCs spaart). Laten we zien hoe de bepaling van de neurosphere kan worden gebruikt voor het kwantificeren van activering en migratie van definitieve en primitieve NSCs na verwonding.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurale stamcellen (NSCs) in het volwassen zoogdieren ruggenmerg zijn een relatief mitotically zwakke bevolking van periventricular cellen die kunnen worden bestudeerd in vitro met behulp van de bepaling van de neurosphere. Deze kolonie-vormende assay is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de reactie van NSCs op exogene factoren in een schotel; Dit kan echter ook worden gebruikt om te bestuderen van het effect van in vivo manipulaties met het juiste begrip van de sterke punten en beperkingen van de test. Een manipulatie van het klinische belang is het effect van letsel op de endogene activering van de NSC. Huidige modellen van dwarslaesie bieden een uitdaging om te studeren dit omdat de ernst van de gebruikelijke kneuzingen, compressie en transect modellen leiden tot de vernietiging van de NSC niche op de site van de schade waar de cellen van de stam woont. Hier beschrijven we een minimale schade-model dat gelokaliseerde schade aan het oppervlakkige dorsolateral oppervlak van de thoracale benedenverdieping (T7/8) van het ruggenmerg volwassen muis veroorzaakt. Dit letsel model spaart het centrale kanaal op het niveau van het letsel en vergunningen van de analyse van de NSCs die zich bevinden op het niveau van de laesie op verschillende tijdstippen na letsel. Hier, laten we zien hoe de bepaling van de neurosphere kan worden gebruikt om de activering van de twee afzonderlijke, lineally-gerelateerde, populaties van NSCs die zich in het ruggenmerg periventricular regio - primitieve en definitieve NSCs bevinden studie (pNSCs en dNSCs, respectievelijk). We laten zien hoe u kunt isoleren en cultuur van deze NSCs uit de regio van de periventricular op het niveau van het letsel en de witte stof letsel site. Onze ruggenmerg na chirurgische ontledingen Toon verhoogde aantallen van pNSC en neurospheres dNSC-afgeleid uit de periventricular regio van gewonde koorden in vergelijking met de besturingselementen, hun activering via letsel te spreken. Bovendien, naar aanleiding van schade, dNSC afkomstige neurospheres kunnen worden geïsoleerd van de site schade — aantonen van het vermogen van NSCs om te migreren van hun periventricular-niche naar plaatsen van verwonding.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het centrale zenuwstelsel bevat een subpopulatie van zichzelf vernieuwend, multipotente stamcellen die de capaciteit hebben om te leiden naar alle andere volwassen neurale cel typen1,2,3,4. Deze neurale stamcellen (NSCs) bevinden zich in gespecialiseerde niches in de hersenen en het ruggenmerg en kan worden geactiveerd na letsel te vermenigvuldigen, migreren en differentiëren in volwassen neurale cellen. NSCs en hun nageslacht is gebleken om te migreren naar de site van de schade in5,6van de modellen van de corticale schade. In de hersenen, NSCs gebleken voor het migreren van de laterale ventrikels op de site van schade waar ze onderscheiden in astrocyten die aan gliale litteken vorming7 bijdragen. In het ruggenmerg, echter zijn weinig studies gedaan om te vragen als deze dezelfde endogene NSCs kunnen worden aangewend ter bevordering van herstel na dwarslaesie. Inderdaad, er is momenteel een debat over de vraag of de activering van de pool van de cel van de stam in het ruggenmerg een directe fysieke schade van de niche van de periventricular voering van het centrale kanaal8 vereist of als de schade aan de spinal cord parenchym (verlaten van de stam cel niche intact) is voldoende om te activeren van endogene NSCs9.

Een aantal ruggenmerg letsel (SCI) modellen zijn gebruikt om te studeren de pathofysiologie van acute en chronische blessure. Deze modellen zijn ook gebruikt om te testen potentiële therapieën voor de behandeling van SCI via neuroprotectie, Immunomodulatie en ontwikkelende cel transplantatie/vervanging strategieën10,11,13. Huidige modellen bevatten compressie en/of kneuzingen verwondingen, die leiden grootschalige functionele tekorten evenals uitgebreide laesies en cavitations in het snoer14,15 tot. Resulterende gliale littekens kunnen verschillende spinale segmenten samen met de meerderheid van de breedte/omtrek van het ruggenmerg16beslaan. Dus, terwijl deze modellen klinisch relevante zijn, zij zich veroorloven grote uitdagingen aan het bestuderen van de reactie van endogene NSCs na verwonding. Er zijn chemische modellen van schade die kan worden aangepast als u de mildere vormen van schade die het centrale kanaal17kunt sparen. Echter dit soort schade zich richten op de demyelinisatie SCI is gekoppeld en niet klinisch relevante modellen voor de fysieke en/of mechanische schade in verband met traumatische SCI.

Om de beperkingen van de huidige modellen van de schade, hebben we een naald nummer minimale SCI model, oorspronkelijk ontwikkeld in de rat9, voor de toepassing in een volwassen muismodel aangepast. Ons model aangepast letsel kunt maken van een consistente laesie van de dorsolateral regio van het ruggenmerg muis en sparen van het centrale kanaal op het niveau van het letsel (s). Het voordeel van dit model is dat het mogelijk de studie van NSC kinetiek maakt na letsel en hun potentiële radiale migratie op de site van letsel. Het gebruik van een muismodel staat ook het gebruik van transgene muizen waarmee lineage opvolging van endogene NSCs en hun nakomelingen na letsel. De eigenschappen van NSCs kunnen verder worden beoordeeld met behulp van een aangepaste vorm van de in vitro neurosphere bepaling die in dit protocol is opgenomen.

De bepaling van de neurosphere is een in vitro kolonievormend test waarmee de isolatie van de NSCs in aanwezigheid van mitogenen. Bij klonen plating dichtheden vermenigvuldigen individuele NSCs om te leiden tot vrij zwevende sferische kolonies van cellen die bestaan uit een kleine populaties van NSCs en een overgrote meerderheid van de progenitoren18,19. In ons protocol, we laten zien van het isolement van twee verschillende, lineally-gerelateerde NSCs uit de streek van de periventricular van het ruggenmerg — onder basislijn voorwaarden en na onze minimale SCI-model. Definitieve neurale stengelgroenten uitdrukkelijke nestin van cellen (dNSCs) en de gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) en zijn gegroeid in aanwezigheid van de epidermale groeifactor (EGF), fibroblast groeifactor (FGF) en heparine (samen genoemd EFH)20. Deze dNSCs zijn zeldzaam in het ruggenmerg naïef, die aanleiding geven tot zeer weinig neurospheres in vitro. Echter, laten we zien dat dNSCs worden geactiveerd na minimale SCI, uitbreiding van het aantal neurospheres van de periventricular regio21geïsoleerd. Primitieve neurale stamcellen (pNSCs) zijn voorafgaand aan de dNSCs in de bloedlijn van neurale stamcellen. pNSCs zijn uiterst zeldzaam, express lage niveaus van de pluripotent markering Oct4, en leukemie remmende factor (LiF) responsieve22. pNSCs vormen geen neurospheres wanneer geïsoleerd van het ruggenmerg volwassen muis als gevolg van de aanwezigheid van myeline basic protein (MBP) in primaire culturen; echter pNSC neurospheres kunnen worden geïsoleerd van MBP deficiënte muizen en hun nummers zijn uitgebreide volgende schade — vergelijkbaar met dNSCs21. Tot slot laten we zien dat dNSC afkomstige neurospheres kunnen worden geïsoleerd van de site van letsel bij vroege tijden na minimale SCI. Deze bevindingen tonen aan dat onze schade model en testen de kenmerken van de activering van periventricular NSCs zoals hun vermogen om te vermenigvuldigen en migreren in reactie op schade kunnen beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier aan de Universiteit van Toronto en is in overeenstemming met de "gids voor de zorg en gebruik van proefdieren" (2nd Edition, Canadese Raad op Animal Care, 2017).

1. minimale Spinal Cord Injury chirurgie

Opmerking: Vóór de operatie, zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten en materialen zijn gesteriliseerd door passende methoden (figuur 1A).

  1. Bouwen een thoracale ondersteuning boog door 4 – 5 pleinen van gaas oprollen en taping ze samen in het midden te verkrijgen van een vaste rol van gaas.
  2. Plaatst u de muisaanwijzer in de zaal van de inductie en initiëren van anesthesie met 5% Isofluraan. Het ontbreken van een teen snuifje reflex voordat u verdergaat, alsook tijdens de gehele procedure bevestigen. Zoals de operatie omhoog van 30 min beslag nemen kan, optimaliseren voor de minimale Isofluraan blootstelling (5 min 5%) en de resterende tijd op 2 – 3%.
  3. De muis naar een neus kegel gekoppeld aan de verdoving machine op de onderhoudsdosis van 2 – 3% Isofluraan overbrengen. Tondeuses vacht verwijderen uit het dorsum van het dier vanaf halverwege back-up naar de nek/oren bloot een breed rechthoekig gebied van huid voor chirurgie te gebruiken.
  4. De muis overbrengen in een stereotaxic instrument door het plaatsen van zijn neus in de bijgevoegde neus kegel en het stabiliseren van de schedel met oor bars. Isofluraan op 5% handhaven tijdens de plaatsing van de oor-bars en lagere terug tot 2-3%, zodra de muis is beveiligd in het stereotaxic apparaat.
  5. Preoperatieve pijnstillende medicijnen intraperitoneally beheren — Meloxicam (2,0 mg/kg). Royaal toepassing oog smering op de ogen open muis ter voorkoming van hoornvlies uitdroging als onder verdoving.
  6. Plaats de boog van de thoracale steun onder de buik van de muis terwijl strekken uit het lichaam van de muis en de wervelkolom door licht te trekken op basis van de staart. Laboratorium labeling tape kunt de staart en alle uitgebreide ledematen in een positie van de ster-achtige beveiligen. Eenmaal veilig, duwen de thoracale ondersteuning boog rostrally, uit de buik van de muis naar de bovenste thorax — om overeind de thoracale wervelkolom (figuur 1B).
  7. Bereid een steriele chirurgische veld door de bont-geknipt huidgebied bereid in stap 1.3 met 70% ethanol, gevolgd door Povidon-jodium te ontsmetten. Herhaal dit twee keer. Een steriele chirurgische gordijn zodat een brede steriel veld toepassen.
  8. Met behulp van een scalpel #10 mes, maken een verticale insnijding evenwijdig aan de lengteas van het dier vanaf halverwege beide schouderbladen de kromming van het thoracale wervelkolom. Intrekken van de huid om te bloot weke delen en de contour van de wervelkolom (Figuur 1 c).
  9. Het identificeren van de onderrand van de suprascapular vet pad (Dit kadert de T4/5 Vertebrale niveau). Met de dezelfde #10 mes, snijd zorgvuldig maar met kracht, langs beide zijden van de wervel bone T5-T8/9 loskoppelen van de pezen van de rug-spier uit de kolom.
  10. De tanden van het oprolmechanisme invoegen op de sites van de incisie aan weerszijden van de wervelkolom. De belichting aanpassen door OPROLMECHANISMEN te verheffen voldoende de wervelkolom zonder dat te veel spanning op de ingeklapte spier lagen (Figuur 1 d) uit te vouwen.
  11. Onder de chirurgische Microscoop, voorzichtig schoon de residuele spier en andere weke overliggende van de wervelkolom om het Vertebrale bot (figuur 1E) bloot te stellen. Het identificeren van de wervels die zal worden verwijderd door het proces van de spinous van de wervels omklemde met een getande Tang en iets omhoog verplaatsen en omlaag.
    Opmerking: Dit moet toestaan van identificatie van lat. gewrichten en bloot de kleine openingen (lat. foramen) onder de wervels van belang.
  12. Een hoofd van de gebogen afgestompte schaar invoegen aan weerszijden van de blootgestelde lat. foramen, caudal aan de Vertebrale lamina te worden weggesneden, en snijd de aansluitende lat. gewrichten bilateraal.
  13. Til de lamina omhoog en afgesneden van de bovenste bevestiging van de lamina te isoleren en te verwijderen van het bot.
    Opmerking: Dit zal blootstellen de intact dural OSS met het ruggenmerg (figuur 1F). Kunnen er overmatig bloeden die kan worden gecontroleerd door het plaatsen van 1 x 1 cm gaas op de getroffen gebieden voorgesneden en/of wassen met steriel PBS.
  14. Met de dorsale middellijn ader fungeren als een mijlpaal, plaatst u een 45° gebogen schacht van een 30 G naald tip (met naald schuine kant naar boven) in het dorsolateral oppervlak van het ruggenmerg (ongeveer 1 mm diep) op ongeveer 0,5 mm lateral aan weerszijden van de middellijn.
  15. Verplaats de naald ~ 2 mm van caudal naar rostraal (parallel aan de middellijn) zodat de gehele lengte van de schuine kant van de naald wordt ingevoegd aan het snoer. Verwijder de naald door het natrekken via het pad van binnenkomst (figuur 1G).
    Opmerking: Er mag geen bloeden maar zwelling van de spinale weefsels kan worden gezien op deze stap.
  16. Tot slot de wond Verwijder het oprolmechanisme en suture van de rugspieren aan weerszijden van de schade samen in de schouderstreek met behulp van een 6-0 absorbeerbare hechtdraad. Gebruik een 4-0 steriele zijde hechtdraad vervolgens sluiten de bovenliggende huid.
  17. Antibiotische zalf toepassen op de bovenkant van de oppervlakkige sutured huid ter voorkoming van postoperatieve infectie met behulp van het puntje van een wattenstaafje. Post-operatieve pijnstiller van 0,1 mg/kg van buprenorfine subcutaan samen met vloeistoffen (1 mL van de oplossing lactated Ringer's) beheren.
  18. Uitschakelen van de Isofluraan vaporizer en zuurstof. Verwijder de muis uit de stereotaxic apparaat en de plaats in een schone kooi met geen beddengoed.
  19. Plaats de muis in de kooi ongeveer 30 cm afstand van een warmte lamp voor herstel van anesthesie en monitor gedrag na wakker. De muis moet binnen 5-10 minuten wakker en hebben de hind-limb functie met mogelijke parese en/of zwakte van de staart bij het ontwaken.
  20. Monitor muisgedrag in de komende paar dagen en bieden goede post-operatieve zorg en pijnstillers (d.w.z., mash, lactated Ringer's oplossing vloeistof subcutane, 0,1 mg/kg buprenorfine 2 x dagelijks subcutaan voor 2-3 dagen, en het juiste gewicht controle ) conform lokale dier faciliteit verordeningen en op individuele basis als terugwinning kan variëren.

2. Neurosphere Assay dissectie

Opmerking: Volg juiste steriele weefselkweek procedures in.

  1. Enzymatische oplossing voorbereiding
    1. Voeg 32 mL van Earle's Balanced Salt oplossing (EBSS) toe aan de albumine ovomucoid remmer met glazen fles en zachtjes vortex tot het is opgelost.
    2. Voeg 5 mL EBSS tot een geportioneerde papaïne glazen ampul en plaats in een waterbad 37 ° C te ontbinden. De oplossing wordt duidelijk (oplossing 1).
    3. Neem 500 µL EBSS en toevoegen aan de geportioneerde DNase dat ik glazen flesje om te verkrijgen van een concentratie van 1 mg/mL (oplossing 2). Meng heel zachtjes door het kantelen van de flacon heen en weer en voeg 250 µL van dit mengsel op oplossing 1.
      Opmerking: Alle oplossingen gemaakt (oplossing 1 en 2) zijn genoeg voor de verwerking van twee stukken van het weefsel. Als de verwerking meer stukken van weefsel, geschikt voor met meer oplossing prep.
  2. Weefsel voorbereiding en dissectie
    1. Plaats een laboratorium doekje gedrenkt in Isofluraan in de kooi van de muis en laat 2-3 min voor dampen naar volledig anesthetize muis. Volgende knock-out, verwijder de muis uit de kooi en bevestigen het ontbreken van een teen-snuifje reflex.
    2. Uitvoeren van cervicale dislocatie met een stomp metalen voorwerp (d.w.z., metalen kooi kaart) om te euthanaseren van het dier. Spray de euthanized dier uit zijn nek naar middenachter royaal met 70% ethanol.
    3. Aan de basis van de schedel, kunt schaar afgesneden het hoofd en gooi deze weg in een bio-zak. Maak een middellijn incisie in de huid langs de gehele lengte van de rug bloot de spier en vertebrale bot contour (figuur 2A).
    4. Til de mediale aspect van elke schouderblad (dwz., schouderblad — geïdentificeerd door de overliggende vet pad) en het gebruik van schaar te knippen weg weke delen (tussen scapulae en wervels). Aparte volledig om de onderliggende wervelkolom bloot te stellen.
    5. Na de kromming van de wervelkolom, hetzelfde paar van schaar invoegen de bovenste borstwervels diafragma en isoleren van de wervelkolom door het weg snijden bijgevoegde ribben, spieren en inwendige organen (figuur 2B).
    6. Schaar in de caudal Vertebrale foramen/opening invoegen en snijd de lat. gewrichten aan beide zijden van de laminae (dorsale oppervlak). Letten vooral geen schade toebrengen aan het intact snoer. Herhaal dit proces tot het gewenste niveau en/of lengte van het snoer is blootgesteld.
    7. Zorgvuldig gesneden de spinal nerve(s) uitbreiding lateraal van de koord voordat u overdraagt van het ruggenmerg weefsel in een petrischaal met regelmatige kunstmatige cerebrospinale vloeistof. Houd het monster op ijs (figuur 2C).
    8. Onder een Microscoop dissectie, snijd het ruggenmerg weefsel tot ~ 2 mm rostraal en caudal naar de site van de schade. Twee paren van pincet gebruiken om te voorzichtig het scheiden van het snoer in 2 helften lengterichting langs de dorsale en ventrale kloven (figuur 2C').
    9. Met microscissors, knip de gewonde dorsolateral witte stof. Plaats het stuk in een conische tube van 15 mL.
    10. Holding een helft van het ruggenmerg naar beneden met een tang, plagen en verwijderen van witte stof met behulp van een ander paar fijne pincet langs de omvang van de rostrocaudal van het ruggenmerg te isoleren van de gewenste periventricular-regio. Herhaal voor de andere helft van het ruggenmerg.
    11. Leg stukjes van periventricular weefsel in een aparte 15 mL conische buizen. Gebruik microscissors en zachtjes gehakt van het weefsel tegen de muren van de conische buisjes.
      Opmerking: Weefsel dissociatie wijzigingen zijn van papaïne dissociatie systeem Protocol23 en procedures24van de voorbereiding van de eerder beschreven weefsel.
    12. 2,5 mL nieuwe oplossing 1 (step 2.1.3) toevoegen aan het monster weefsel en plaats op een rocker bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
    13. Zachtjes triturate het weefsel in de oplossing met een 1.000 µL pipette uiteinde. Centrifugeer het bewolkt celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min op RT.
    14. Oplossing 3 bereiden met 2,7 mL Earle's Balanced zoutoplossing, 300 µL van ovomucoid remmer oplossing (stap 2.1.1) en 150 µL van de DNase ik oplossing (stap 2.1.3).
    15. Verwijder het supernatant van stap (stap 2.2.13) en resuspendeer in 1,5 mL oplossing 3 in de vorige stap (stap 2.2.14).
    16. Deze nieuwe celsuspensie (stap 2.2.15) op de top van 5 mL van ovoimucoid remmer oplossing (stap 2.1.1) in een nieuwe conische tube van 15 mL maken een discontinue dichtheid verloop laag. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min op RT.
    17. Verwijder supernatant en resuspendeer in 2 mL zuiver neurobasal media. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 min op RT.
    18. Verwijder supernatant en resuspendeer in 1 mL van neurobasal media. Het filteren van de opschorting met een 20 µm cel zeef gevolgd door 4 mL van media voor een totaal volume van 5 mL.
  3. Beplating
    1. Bereiden van voedingsbodems voor groei van de neurosphere door neurobasal media met epidermale groeifactor (20 ng/mL) aan te vullen / fibroblast groei factor (20 ng/mL) / heparine (2 µg/mL) [voor definitieve NSCs] of leukemina remmende factor (10 ng/mL) [voor primitieve NSCs]. Voeg 10 mL van beide media in een maatkolf van 25 mL weefselkweek.
    2. Een hemocytometer en de Trypan blauwe kleurstof gebruiken voor het berekenen van het aantal cellen in suspensie (stap 2.2.18) €25. Zodra berekend, cellen aan weefselkweek kolven bereid in (stap 2.3.1) toevoegen aan een klonale dichtheid van 10 cellen/µL en plaats weefselkweek kolf met toegevoegde cellen in de incubator gedurende 24 uur (37 ° C, luchtvochtigheid van 95%, 5% CO2).
      Opmerking: Een voorbeeld van het tellen techniek is als volgt: Neem 10 µL van de celsuspensie en meng met 10 µL van Trypan blauwe kleurstof. Voeg 10 µL van dit mengsel in een hemocytometer. Onder een 10 X lichte Microscoop, tellen het aantal levende cellen en alle cellen geteld onder 4 van de 4 x 4 kwadranten optellen. Gebruik de formule: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000] te geven van de omvang van de celsuspensie te worden verguld in elke maatkolf van 25 mL weefselkweek om klonen dichtheid (10 cellen/µL).
    3. Na 24u, zachtjes swirl van de kolf en giet inhoud in een conische tube van 15 mL. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min op RT.
    4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1-2 mL verse neurobasal media.
    5. Herhaal stap 2.3.2 te tellen van het aantal cellen in de cellen van de opschorting en plaat bij klonen dichtheid in een 24-well weefselkweek plaat met 500 µL van hun respectieve mitogeen aangevuld media (EFH voor definitieve NSC groei) en LIF voor primitieve NSC groei.
      Opmerking: Gebruik de aangepaste formule (5000 / [X cellen/4) x 2 x 10 x 1.000) voor het berekenen van het volume van de celsuspensie te worden verguld in elk putje met 500 µL van media.
    6. Plaats de platen met cellen in de incubator (37 ° C, luchtvochtigheid van 95%, 5% CO2) groeien voor 7 dagen.
  4. Tellen
    1. Na 7 dagen in de cultuur, het verwijderen van platen en bekijken onder een lichte Microscoop. Kwantificeren van neurospheres door het tellen van de sferische kolonies die > 80 µm in diameter dNSCs culturen en > 50 µm diameter voor pNSCs culturen.
      Opmerking: Indien gewenst, neurospheres kan verder gepasseerd26 of gedifferentieerd. Als cellen niet langer nodig zijn, beschikken over door de versnelde waterstofperoxide toe te voegen aan de putjes (ca. 1 mL) voor 20 min, zodat de kleur van het medium omslaat naar geel. Vervolgens Gooi.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na de chirurgie, moeten de muizen ervaring minimale motor tekorten, die kunnen bestaan uit staart en mogelijk hind-limb parese gedurende maximaal 24 uur. Na deze tijd, moeten de muizen ervaring geen hind-limb verlamming en/of parese en minimale veranderingen in gang.

Figuur 3 toont representatieve resultaten van de neurosphere-bepaling 5 dagen na de minimale dwarslaesie. De absolute aantallen dNSC a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijdens de chirurgische ingreep zijn er een paar kritische stappen waar de onderzoeker moet bijzondere aandacht besteden aan het verkrijgen van optimale resultaten en minimaliseren van de variabiliteit tussen de dieren. Wees voorzichtig met het geïnhaleerde anesthesie (Isofluraan) tijdens de operatie als de verdoving is aangetoond te hebben op neuroprotectieve effecten met langdurige blootstelling27. Dienovereenkomstig, bij de studie van het regeneratieve vermogen van het ruggenmerg na letsel, ins...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt gefinancierd door de Stichting Krembil (exploitatiesubsidie CMM). WX was de ontvanger van het Carlton Marguerite Smith student award. NL ontving een Graduate beurs van Ontario.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agricola RetractorFine Science Tools17005-04
Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved)Fine Science Tools15370-50Pas aan bij bestellen om stompe uiteinden te krijgen
Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth)Fine Science Tools11053-10
Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated)Fine Science Tools11152-10Of een andere pincet voor het naaien
Hartman Hemostats (Straight)Fine Science Tools13002-10Of een andere geschikte voor het naaien
Scalpel Handle #3Fine Science Tools10003-12Of een andere geschikte
Haarclippersamazon.cahttps://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BAof een andere geschikte
Stereotaxisch instrumentStoeling51500of een andere geschikte
Buprenorfineof een andere geschikte goedgekeurd door de dierenverzorgingsfaciliteit
Meloxicamof een andere geschikte goedgekeurd door dierenverzorgingsfaciliteit
Tears Naturale P.M.Alconhttps://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXEof een andere geschikte
IsofluraanBaxter International IncDIN 02225875of een andere geschikte voor anesthesie
Q-tips katoenen tamponsamazon.cahttps://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
Katoenen gaasFisher Scientific13-761-52
30 G naaldenBecton Dickinson305106Voor verwondingen
25 G naaldenBecton Dickinson305122Voor medicijninjecties
1 mL spuitenBecton Dickinson3090659voor medicijninjecties
3 mL spuitenBecton Dickinson309657voor vloeistofinjecties
4-0 hechtdraaduoftmedstore.com2297-VS881voor het naaien van de huid
6-0 hechtdraaduoftmedstore.comVS889voor het naaien van spieren
Polysporine zalfamazon.ca102051
IsofluraanverdamperVetEquip901806
15 mL conische buisjesThermoFisherElke geschikte
Petri-schalenThermoFisherelke geschikte
TrypanblauwThermoFisherElke
HemocytometerThermoFisherElke geschikte
CentrifugeThermoFisherElke geschikte
Standaard dissectiegereedschapFine Science Tools
DissectiemicroscoopZeissStemi 2000
TellmicroscoopOlympusCKX41
Neural Basal-A MediumInvitrogen10888-022
B27Invitrogen17404-044
Penicilline- StreptomycineGibco15070
L- GlutamineGibco25030
DMEMInvitrogen12100046
F12Invitrogen12700075
30% GlucoseSigmaG61521 M, 9,01 g in 100 mL dH2O
1 M Glucose
7,5% NaHCO3SigmaS5761155 mM, 1,30 g in 100 mL dH2O
155 mM NaHCO3
1 M HEPESSigmaH337523,83 g in 100 mL dH2O
Apo-TransferrineR&D Systems3188-AT
Putrescine SigmaP7505
InsulinSigmaI5500
SeleniumSigmaS9133
ProgesteronSigmaP6149
Papaïne dissociatie systeem Worthington Biochemical CorporationPDS1 flesje papaïne kan worden gebruikt voor 2 monsters
Epidermale groeifactorInvitrogenPMG8041Poeder gereconstitueerd met 1mL hormoonmix en verdeeld in 20uL flacons om in de vriezer te worden bewaard
FibroblastengroeifactorInvitrogenPHG0226Poeder gereconstitueerd met 0,5 mL hormoonmix en verdeeld in 20 μL flacons om in de vriezer te worden bewaard
HeparineSigmaH3149
Leukemie remmende factorIn House
Trypanblauw
Hemocytometer
24 wel platenNUNC
2 M NaClSigmaS588611,69 g in 100 mL dH2O
1 M KCLSigmaP54057,46 g in 100 mL dH2O
1 M MgCl2SigmaM239320,33 g in 100 mL dH2O
108 mM CaCl2Sigma C79021,59 g in 100 mL dH2O

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
  2. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
  3. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
  4. Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
  5. Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
  6. Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
  7. Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
  8. Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
  9. Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
  10. Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
  11. Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
  12. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
  13. Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
  14. Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
  15. Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
  16. Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
  17. Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
  18. Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
  19. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
  20. Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
  21. Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
  22. Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
  23. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
  24. Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
  25. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  26. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
  27. Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
  28. Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
  29. Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

neurale stamcellenperiventriculaire regioprimitieve neurale stamcellendefinitieve neurale stamcellenweefseldissectiecelkweekchirurgisch modelcentraal kanaal

Gerelateerde artikelen