Hoewel veel insecten in de onderorde Wantsen (Insecta: Hemiptera) zijn giftig, de samenstelling van hun gif en de functies van hun vergift toxinen zijn meestal onbekend. Dit protocol wordt beschreven methoden om te heteropteran boosdoeners voor verdere karakterisering, met behulp van elektrostimulatie, intimidatie en klier dissectie van de oogst.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Oogsten van Venom toxines uit Assassin insecten en andere Heteropteran insecten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Heteropteran insecten zoals assassin bugs (Reduviidae) en reus water bugs (Belostomatidae) stamde uit een gemeenschappelijke voorouder van de predaceous en giftige, en de meerderheid van de overgeleverde heteropterans behouden deze trofische strategie. Sommige heteropterans zijn overgestapt naar het eten van gewervelde bloed (zoals de kissing bugs, Triatominae; en bed bugs, Cimicidae) terwijl anderen zijn teruggekeerd naar het eten van planten (de meeste Pentatomomorpha). Echter, met uitzondering van speeksel door kussende bugs gebruikt om bloed-voeding, weinig is bekend over heteropteran boosdoeners in vergelijking met het gif van spinnen, schorpioenen en slangen.
Een obstakel voor de karakterisatie van heteropteran venom toxines is de structuur en functie van de venom/labiaal klieren, die beide morfologisch complexe en uitvoeren van meerdere biologische functies (defensie, prooi vangen en extra mondelinge spijsvertering). In dit artikel beschrijven we drie methoden die we met succes gebruikt hebben voor het verzamelen van heteropteran boosdoeners. Eerst presenteren we elektrostimulatie zoals een handige manier voor het verzamelen van gif dat is vaak dodelijk wanneer geïnjecteerd in prooi dieren en die besmetting door klierweefsel ondervangt. Ten tweede, we laten zien dat zachte intimidatie van dieren volstaat om GIF extrusie van de proboscis en/of GIF spugen in sommige groepen van heteropterans. Ten derde, beschrijven we methoden om te oogsten venom toxines door dissectie van verdoofde dieren te verkrijgen van de venom klieren. Deze methode is een aanvulling op andere methoden, zoals het kunnen oogsten van toxine van taxa waarin elektrostimulatie en intimidatie ineffectief zijn. Deze protocollen kunnen onderzoekers te oogsten van toxine van heteropteran insecten voor structuur-functie karakterisatie en mogelijke toepassingen in geneeskunde en landbouw.
Inleiding
Heteropteran boosdoeners zijn krachtig bioactieve stoffen1. Bijvoorbeeld, de afscheidingen van de venom/speeksel van Wantsen bloed-voeding zoals kussende bugs (Triatominae) en bed bugs (Cimicidae) vergemakkelijkt voeden door het verstoren van hemostase2. Giftige stoffen in deze boosdoeners richten op meerdere trajecten met inbegrip van coagulatie, aggregatie van de bloedplaatjes en vasoconstrictie, evenals de pijn en jeuk van de trajecten. Boosdoeners van de meeste andere soorten heteropteran zijn aangepast om predatie in plaats van bloed-voeding. Hun boosdoeners veroorzaken verlamming, dood en weefsel vloeibaar maken wanneer geïnjecteerd in ongewervelden3,4. Wanneer geïnjecteerd in gewervelde dieren, kan hun gif ook drastische gevolgen hebben. Bijvoorbeeld veroorzaakt injectie van GIF van de moordenaar bug Holotrichius innesi in gewervelde dieren pijn, verlamming van de spieren en bloeding; muizen envenomated door deze bug sterven snel als gevolg van respiratoire verlamming5.
Transcriptomic en Proteoom studies is de samenstelling van de eiwitten van sommige heteropteran boosdoeners gebleken. Boosdoeners predaceous soorten zijn rijk aan proteasen, enzymen, en peptides en proteïnen van onbekende structuur en functie van6,7,8. Kissing bug venom is rijk aan de triabin eiwit familie, waarvan de leden diep coagulatie, aggregatie van bloedplaatjes en vasoconstrictie2,9 beïnvloeden. Het is echter niet bekend welke toxines ten grondslag liggen aan de meeste bioactivities van venom. Bijvoorbeeld GIF van de kissing bug Triatoma infestans pijnstiller en remmen natrium kanalen10heeft gemeld, maar de onderdelen die verantwoordelijk blijven om te worden opgehelderd. Het is ook niet bekend welke onderdeel van assassin bug venom dat verlamming of pijn veroorzaken. Een voorwaarde voor het identificeren van de toxines verantwoordelijk voor bepaalde venom bioactivities en voor het karakteriseren van de structuur en functie van roman venom toxines, is het verkrijgen van venom.
Venom is verkregen van heteropterans door elektrostimulatie5,6,7,8,11,12,13, provocatie van defensief Reacties4,8, mechanisch knijpen de thorax12,14,15,16, ontleden uit venom klieren8,17 ,18,19,20,21,22, en toepassing van agonisten van de muscarinerge acetylcholine receptor23. Beoordelen van de mogelijke voor- en nadelen van elke methode wordt bemoeilijkt door de morfologie van heteropteran venom klieren, die bestaan uit een belangrijkste wartel met twee aparte lumen, de anterior belangrijkste klier (AMG) en de achterste belangrijkste klier (PMG), evenals een bijbehorende klier accessoire (AG). Deze verschillende klier compartimenten produceren verschillende eiwit afscheidingen, die kunnen worden gespecialiseerd voor verschillende biologische functies, met inbegrip van prooi vangen, defensie en extra mondelinge spijsvertering8,17. In peiratine en ectrichodiine assassin bugs, heeft de AMG gepaard met prooi vangen en de PMG met extra mondelinge spijsvertering17. Echter in de harpactorine is bug Pristhesancus plagipennis de PMG gespecialiseerd prooi vangen en de spijsvertering overwegende dat de AMG is veronderstelde om defensieve venom8afscheiden. De AG is bestempeld als zijnde weinig secretoire functie in assassin bugs8 of als een belangrijke site voor protease storage in reus water bugs23. Het is duidelijk dat verdere werkzaamheden vereist ter verduidelijking van de functie van elk compartiment van de klier onder diverse subgroepen van de heteropteran en voor het bepalen van de functie van de meeste GIF toxines. In dit rapport beschrijven we protocollen voor het oogsten van venom toxines uit heteropterans richting van dit doel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol voldoet aan de Universiteit van Queensland van beleid in verantwoorde zorg en het gebruik van dieren in onderwijs en onderzoek (PPL 4.20.11) evenals de National Health en Medical Research Council de Australische code voor de verzorging en het gebruik van genoemde dieren voor wetenschappelijke doeleinden (8th Edition 2013).
Let op: Wees voorzichtig niet te worden envenomated bij het verwerken van assassin bugs. Zorg voor het beschermen van de ogen bij de verwerking van soorten die verdedigend gif spuwen. Zorg in de hele niet te verwonden de proefdieren. Het gaat hierbij om controle van druk op de beperkingen zoals elastiekjes en ervoor te zorgen dat de snuit niet gebroken is.
Opmerking: Optioneel, anaesthetize dieren door blootstelling aan CO2 voor 0,5-2 min of koeling tot 4-10 ° C vóór het venom oogsten 1-3 beoogt om veilige overdracht en terughoudendheid te vergemakkelijken. Anaesthetization is niet strikt noodzakelijk maar veilige terughoudendheid van agile of sterke specimens kunnen vergemakkelijken. Dieren moeten echter wakker om GIF oogsten. Downstream-toepassingen in gedachten houden bij de beslissing al dan niet toe te voegen proteaseinhibitors.
1. oogsten Venom toxines door elektrostimulatie
- Verkrijgen van levende specimens waaruit te oogsten van toxines.
- Gebruik vooraf bereid kunststof pincet met positieve en negatieve elektroden gemonteerd op een puntje. Geëlektrificeerde pincet verbinden met een electrostimulator of een bron van constante spanning waarmee aanpassing van de spanning.
- Voor kleine (~ 10 mm) en grote (~ 25 mm) moordenaar bugs, piek spanningen van de 15 en 25 V respectievelijk te gebruiken.
- Voor grotere heteropterans zoals reus water bugs, gebruikt tot 40 V.
- Levende insecten beperken door hen vast te binden aan een platform, met behulp van een rubberen band op de thorax.
- Plaats het uiteinde van de proboscis in een geschikte verzamelen tip. Voor assassin bugs, gebruikt u een uiteinde van de pipet P200. Voor gigantische water bugs, knip de extremiteit uit een P200 tip om de grootte van het diafragma.
- Zachtjes heffen de snuit met een gesloten schone pincet en druk op de open diafragma van de collectie tip op het einde van de snuit.
- Indien gewenst, tip opname ~ 5 µL ultrazuiver water voorafgaand aan het plaatsen van de snuit in de verzamelen. Hierdoor verliezen van venom resterende binnenkant van de tip, hoewel het geoogste GIF zal worden verdund.
- Toepassing van elektrostimulatie. Dompel de elektroden van de stimulerende in geleidende gel, zoals 2,5 M NaCl/50% glycerol. Toepassing van de elektroden op de thorax. Voor belostomatids, de twee elektroden van toepassing op de achterste dorsale oppervlak van het hoofd.
- GIF om te voorkomen dat autodegradation worden opgeslagen. Na GIF warm geperst is, snel overbrengen naar een buis bij-20 ° C of -60 ° C, of een buis met protease inhibitor cocktail.
- Herhaal de stappen 1.5 en 1.6 voldoende GIF wordt verworven of geen verdere GIF is aanstaande.
2. oogsten van Venom toxines door intimidatie
- Dieren voor te bereiden voor het oogsten van de venom en plaats het uiteinde van de proboscis in een collectie vestibule, als beschreven in subsecties 1.1 en 1.3-1.4.
- Als venom is spontaan geëxtrudeerd, gaat u naar stap 2.3. Als dat niet het geval is, de dieren te kwellen door zachtjes aan te raken op de poten, de buik en de antennes met een pincet totdat GIF wordt geproduceerd.
- Breng snel GIF tot een koker bij-20 ° C of -60 ° C, of een buis met proteaseinhibitor cocktail, indien gewenst.
3. oogsten van Venom toxines door intimidatie van Venom "Spugen" soorten
- Anaesthetize of gedeeltelijk anaesthetize, het insect voordat u het verwijdert uit de behuizing om te voorkomen dat een voortijdige defensieve spugen.
- GIF spugen gedrag uitlokken. Bevatten en verplaatsen van het insect met behulp van het diepe deksel van een standaard 90 x 16 mm petrischaal. Houd de deksel licht posterior en 1-4 cm boven het insect ter voorkoming van de vlucht. De meeste insecten zullen spuwen meerdere malen, vaak ter vlug successie. Controleer dat alle GIF wordt verzameld op de onderkant van de schotel.
- Het GIF bij de onderkant van de petrischaal verzamelen met spoelen met 10 µL van ultrazuiver water. Snel overbrengen naar een buis bij-20 ° C of -60 ° C, of een buis met protease inhibitor cocktail.
4. oogsten Venom toxines door klier dissectie
- Het offeren van dieren. Sterk anaesthetize of doden van dieren met behulp van > 5 minuten blootstelling aan CO-2. Pijp zuivere CO2 rechtstreeks in de lucht-holes van het dier huisvesting behuizing.
- PIN insect naar dissectie tray. Voor assassin bugs, ontleden door het ventrale oppervlak (4.3). Voor gigantische water bugs, ontleden door middel van het dorsale oppervlak (4.4).
- Ventrale dissectie
- Drie pinnen in de achterste buik het insect ingedrukt zonder het prikken van de venom klieren invoegen.
- Snijd een korte middellijn insnijding in het ventrale oppervlak van de buik met behulp van een miniatuur scalpel. Miniatuur schaar gebruiken om uit te breiden van de middellijn incisie anteriorly aan het hoofd, het verzorgen te snijden het exoskelet alleen en interne structuren niet te beschadigen.
- Om de interne structuren bloot, te snoeien meerdere laterale zich uitstrekt van de middellijn incisie aan de zijkant van het insect. Vervolgens pin terug elke klep van ventrale exoskelet te onthullen van de interne structuren.
- Voor grote moordenaar bugs, maak vier zijdelingse insnijdingen, in het midden buik, anterior buik, tussen eerste en tweede benen, en voor de eerste etappe.
- Dorsal dissectie
- Verwijder de vleugels in de buurt van de base. Drie pinnen in de achterste buik het insect ingedrukt zonder het prikken van de venom klieren invoegen.
- Snijd een insnijding van de middellijn van het hoofd naar de buik met behulp van miniatuur schaar en scalpel, verzorgen om te knippen het exoskelet alleen en interne structuren niet te beschadigen.
- Dwingen uit elkaar de twee helften van het insect. Plaats meerdere pinnen lateraal langs de lengte van het insect te verlaten de interne holte blootgesteld.
- Verwijder de vlucht spieren met pincet.
- Overgiet de dissectie-lade. Voeg PBS totdat de bug is ondergedompeld, zodat interne structuren zweven omhoog en worden gemakkelijker gevisualiseerd.
- Het gebruik van pincet en micro-schaar, verwijder voorzichtig connective en zenuwweefsel en luchtpijp. De venom klieren worden weergegeven als langwerpig, doorschijnend structuren langs elke kant van het kanaal van de darmkanalen.
- Identificeer de belangrijkste klier door haar karakteristieke verschijning, met de voorste en achterste kwab en twee leidingen op de hilus bijeen.
- Indien gewenst, identificeren de accessoire klier door het traceren van de koker van de hilus. Gratis de belangrijkste klier door het snijden van de twee buisjes die afkomstig zijn van de hilus.
- Oogst de gewenste klier lumen. De klier overbrengen in een microcentrifuge op het ijs met 30 µL van PBS of PBS plus proteaseinhibitor cocktail. Lance de klieren met een schone scherpe pin.
- Vortex voor 10 s en centrifuge (1 min 5.000 × g, 4 ° C) voor het leegmaken van de klier lumen. Verwijder het klierweefsel met pincet.
- Het toxine-extract te verduidelijken. Centrifuge (5 min, 17.000 × g, 4° C) te verwijderen van alle vaste deeltjes, behoud van het supernatant en teruggooien van de pellet. Bewaren bij-20 ° C of -60 ° C ter voorkoming van aantasting van de autoproteolytic.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Sommige heteropteran-soorten, zoals de harpactorine P. plagipennis en de reduviine Platymeris Rhadamanthys, opbrengst betrouwbaar grote hoeveelheden (5-20 µL) van venom in reactie op Elektrostimulatie (tabel 1). In het algemeen, opbrengst de meeste peiratine, reduviine en harpactorine insecten venom in reactie op deze methode. Onder stenopodaine de bugs ontlokte elektrostimulatie gif uit Oncocephalus sp., maar niet Thodelmus sp. De holo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest kritische stap in het oogsten van assassin bug venom is het selecteren van de juiste methode afhankelijk van de toepassing van de studie. Elk van de drie methoden voorgesteld voor het oogsten van heteropteran boosdoeners heeft voordelen en nadelen afhankelijk van downstream toepassingen.
Inducerende bugs te verdrijven van GIF van de proboscis (protocollen 1-3) dat verontreiniging van venom voorkomen wordt door klierweefsel weefsels. Bovendien, deze methoden zijn niet-letale en kunnen ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij erkennen de financiële ondersteuning van de Australian Research Council (subsidies DP130103813 en LP140100832 naar G.F.K., DECRA Fellowship DE160101142 naar EABU), de Australische National Health & Medical Research Council (Principal Research Fellowship APP1044414 naar G.F.K.), en de Universiteit van Queensland (postdoctorale Fellowship aan A.A.W.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Electostimulator | Grass Technologies | S48 Square Pulse Stimulator | Electrostimulator die gepulseerde elektrostimulatie mogelijk maakt |
| Featherlight pincetten | Australian Entomological Supplies | E122B | Voor het hanteren van levende giftige insecten |
| Protease-remmercocktail | Sigma | 4693124001 | Voor het voorkomen van autoproteolytische vertering van gif |
| Dissectie-apparatuur | Australian Entomological Supplies | E152Micro | Voor fijne dissecties |
| Insectenpins | Australian Entomological Supplies | E162 | Voor fijne dissecties |
Referenties
- Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits. Toxins. 8 (2), 43(2016).
- Ribeiro, J. M. C., Assumpção, T. C., Francischetti, I. M. B. An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera. Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).
- Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae). Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).
- Edwards, J. S. The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae). Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).
- Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A. Animal and Plant Toxins. Kaiser, E. , Goldman. 143-146 (1973).
- Walker, A. A., Hernández-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Walker, A. A., et al. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cell. Mol. Life Sci. , (2018).
- Walker, A. A., et al. The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens. Nature Communications. 9 (1), 755(2018).
- Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis. Toxins. 8 (2), 44(2016).
- Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels. Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).
- Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization. FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).
- Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids. Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).
- Silva-Cardoso, L., et al. Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum. Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).
- Noeske-Jungblut, C., et al. Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin. Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).
- Noeske-Jungblut, C., et al. An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).
- Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).
- Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae). Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).
- Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. Biotechnological Applications for Integrated Pest Management. , Oxford Publishing. 125-131 (2000).
- Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P. Insect Pest Management, A Current Scenario. Ambrose, D. P. , Entomology Research Unit. 346-361 (2011).
- Pereira, M. H., et al. Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae). Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).
- Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus. British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).
- Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimarães, J. A. Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus. Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).
- Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae). Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular & Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).
- Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. On the 'spitting' behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae). Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).
- Fink, L. S. Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae). Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).
- Herzig, V. Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae). Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).
- Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab). Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
