Methodenartikel

Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen

DOI:

10.3791/57731

⸱

13 september 2018

 ,  , 
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt onderzoekers met een nieuw instrument voor het controleren van de betrouwbaarheid van transcriptie in meerdere modelorganismen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nauwkeurige transcriptie is vereist voor de trouwe uitdrukking van genetische informatie. Verrassend genoeg echter is weinig bekend over de mechanismen waarmee de betrouwbaarheid van de transcriptie. Om te vullen deze kloof van de wetenschappelijke kennis, we onlangs de cirkel-sequencing assay voor het detecteren van transcriptie fouten in de gehele transcriptome van Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteren Caenorhabditis geoptimaliseerd elegans. Dit protocol zorgt voor onderzoekers met een krachtige nieuwe tool om het landschap van transcriptie fouten in eukaryote cellen toewijzen zodat de mechanismen waarmee de trouw van transcriptie kunnen worden opgehelderd in ongekend detail.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het genoom biedt een nauwkeurige biologische blauwdruk van het leven. Ter uitvoering van deze blauwdruk correct, is het belangrijk dat het genoom te worden overgezet met grote precisie. Transcriptie is echter onwaarschijnlijk dat vrij is van fouten. Bijvoorbeeld, RNA polymerase zijn al lang bekend bij vergissing-geneigd in vitro1,2, en onlangs werd aangetoond dat ze fouten begaan in vivo evenals3,5,6, met name wanneer geconfronteerd met DNA schade7,8,9,10. Samen genomen, deze opmerkingen aangeven dat transcriptie voortdurend in alle levende cellen fouten, suggereren dat ze een potente bron van gemuteerde eiwitten zou kunnen zijn.

Dit proces wordt genoemd transcriptionele mutagenese, verschilt van de klassieke mutagenese op twee manieren. Eerst, in tegenstelling tot genetische mutaties, transcriptie fouten invloed op zowel mitotische en post mitotische cellen, aangezien ze niet afhankelijk van DNA-replicatie. Bestuderen van de mechanismen die van invloed zijn de trouw van transcriptie, daarom krijgt waardevol inzicht geven in de belasting van de mutatie van de mitotische zowel post mitotische cellen. Interessant, transcriptie fouten zijn onlangs betrokken bij de bevordering van eiwit aggregatie11,12,13 en hypothetische hebben is om bij te dragen aan beide carcinogenese10 en de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica in bacteriën14.

Ten tweede, in tegenstelling tot genetische mutaties, transcriptie fouten zijn in de natuur van voorbijgaande aard. Hun tijdelijke bestaan vormt een bijzondere uitdaging omdat het maakt transcriptie fouten buitengewoon moeilijk op te sporen. Bijvoorbeeld, terwijl verschillende labs hebben bedacht waardevolle verslaggever testen voor de studie van transcriptionele mutagenese, kunnen deze testen alleen voor het meten van de transcriptie fouten in een beperkt aantal contexten en model organismen4,15. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben vele onderzoekers aan RNA sequencing-technologie (RNA-seq), waarmee theoretisch transcriptie fouten worden geregistreerd in de gehele transcriptome van elke soort gedraaid. Deze studies zijn echter gemakkelijk verward door bibliotheek bouw artefacten, zoals omgekeerde transcriptie fouten, PCR versterking fouten en de feilbare aard van sequencing zelf. Bijvoorbeeld, omgekeerde transcriptases ongeveer één fout begaan elke ~ 20.000 basen, terwijl RNA polymerase (RNAPs) worden verwacht om te maken maar van één fout elke 300.000 honken5,6. Omdat de foutmarge van omgekeerde transcriptie alleen de foutmarge van RNA polymerase binnen cellen dwergen, is het vrijwel onmogelijk om te onderscheiden waar transcriptie fouten van artefacten, veroorzaakt door de voorbereiding van de bibliotheek in traditionele RNA-Seq-gegevens ( Figuur 1a).

U kunt dit probleem oplossen, ontwikkelden we een geoptimaliseerde versie van de cirkel-Sequencing (Cirseq, of C-seq voortaan) bepaling5,16. Deze bepaling kan de gebruiker voor het opsporen van transcriptie fouten en andere zeldzame varianten in RNA gedurende de transcriptome5. De circulaire-sequencing assay draagt deze naam omdat een belangrijke stap in deze test rond RNA circularization draait. Zodra de RNA-doelstellingen zijn circularized, zijn ze omgekeerde overgezet in een rollende cirkel mode, voor de productie van lineaire cDNA moleculen die vele kopieën van dezelfde RNA sjabloon bevatten. Als een fout aanwezig in een van deze sjablonen was, zou deze fout ook aanwezig zijn in elke één herhaling deel uitmaakt van het cDNA molecuul. In tegenstelling, fouten geïntroduceerd door omgekeerde transcriptie, PCR versterking of sequencing neiging om willekeurig ontstaan, en zullen dus aanwezig zijn in slechts één of twee herhalingen. Dus, door het genereren van een consensus volgorde voor elke cDNA molecuul en willekeurige fouten van fouten die in alle herhalingen optreden te onderscheiden, bibliotheek bouw artefacten kunnen effectief worden gescheiden van ware transcriptie fouten (Figuur 1b).

Indien goed gebruikt, de C-seq-bepaling kan worden gebruikt voor het nauwkeurig detecteren het tempo van de base vervangingen, invoegingen en verwijderingen in RNA hele transcriptome van elke soort (bijvoorbeeld Zie Traverse en Ochman17). Bijvoorbeeld, zijn wij gewend de C-seq-assay genoom-brede metingen van de foutmarge van transcriptie in Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans en Drosophila melanogastervoorzien van een enkele basis resolutie5 (niet-gepubliceerde opmerkingen). Oorspronkelijk gebruikt voor het nauwkeurig volgnummer RNA-virus populaties, is deze geoptimaliseerde versie van de C-seq-bepaling gestroomlijnd om te minimaliseren van de barre omstandigheden tijdens de voorbereiding van de bibliotheek die aan de bibliotheek bouw artefacten bijdragen. Bovendien, met behulp van een aantal commercieel beschikbare kits, is de doorvoer van de bepaling sterk verbeterd, evenals de gebruiksvriendelijkheid. Indien goed gebruikt, kan deze test duizenden transcriptie fouten per repliceren, daardoor sterk verbeteren op eerdere studies6nauwkeurig detecteren. Globaal, is deze methode biedt een krachtig instrument om te studeren transcriptionele mutagenese en toestaat de gebruiker toegang krijgt tot nieuwe inzichten in de mechanismen waarmee de trouw van transcriptie in een breed scala van organismen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding

  1. RNases zijn alomtegenwoordig; de werkruimte daarom grondig te reinigen door het naar beneden te spuiten met een decontaminatie-reagens (b.v., RNase weg) en 70% ethanol. Spray onderaan elke pipetten, pennen, of buis rekken potentiële bronnen van RNase besmetting uit te schakelen.
  2. Voorkom verdere RNases van de verontreiniging van de monsters en draag een laboratoriumjas of lange mouwen T-shirt tijdens de experimenten. Vermijd contact tussen de handschoenen en de binnenkant van elke buizen die zal worden gebruikt, vooral als ze worden opgehaald uit een doos of tas.
  3. Voorafgaand aan het omgekeerde transcriptie, handschoenen vaak worden gewijzigd.
    Opmerking: Voor een optimaal resultaat worden niet onderbroken het experiment vóór de omgekeerde transcriptie.

2. cel en dierlijke cultuur en collectie

  1. Saccharomyces cerevisiae groei en collectie
    1. Desgewenst een C-seq-bibliotheek is uit gist eerst enten een één kolonie van S. cerevisiae in 3 mL middellange bevatten gistextract, adenine, pepton en dextrose (YAPD), en na een het nacht bebroeden bij 30 ° C in een rollende trommel.
    2. In de ochtend, opnieuw het enten van de cultuur in 50 mL YAPD middellange tot een optische dichtheid (OD) van 0,1 en de cellen groeien totdat ze een OD van 0,5 – 0,7 (~ 7 x 106 cellen/mL).
    3. Verzamelen van de gehele 50 mL cultuur (ongeveer 350 x 106 cellen) in een conische tube van 50 mL en draaien de cellen naar beneden voor 3 min bij 2100 x g. Verwijder het medium van de YAPD voorzichtig en wassen van de pellet een keer met 1 x PBS.
    4. Vervolgens resuspendeer de pellet in 480 µL van lysis buffer, 48 µL van 10% SDS en 480 µL van fenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1), pH 6.8. Vortex het monster bij maximumsnelheid voor 5 s, en overdracht aan een schroefdop 1,5 mL tube met 750 µL van ijskoude Zirkonia kralen (meegeleverd met de kit). Ga naar stap 3 van dit protocol voor de lysis van de cel en totaal RNA extractie.
      Opmerking: Alle van de reagentia die nodig zijn voor stap 2.1.4 vindt u in de aanbevolen gist RNA extractie kit. Deze reagentia werken even goed voor gist, wormen, en vliegt zodat na de inzameling van de gist (stap 2.1), wormen (stap 2.2) of vliegen (stap 2.3), een uniforme aanpak kan worden gebruikt voor het genereren van C-seq bibliotheken (stap 3 – 10).
  2. Caenorhabditis elegans cultuur en collectie
    1. Als u wilt een C-seq-bibliotheek van wormen, Kluisje 30 volwassen wormen op een verse plaat agar gespot met OP50 bacteriën.
      Opmerking: Vijf platen zijn voldoende voor 1 repliceren.
    2. Cultuur van de wormen voor 4 dagen en de wormen door voorzichtig wassen de platen met 5 mL M9 media verzamelen en bundelen van de wormen in een conische buis van één 50 mL.
    3. Draai de wormen naar beneden bij 100 x g gedurende 2 min maken een pellet. Vertragen de centrifuge op de laagste snelheid mogelijk, dus niet te verstoren de pellet.
    4. Zachtjes de wormen gaan met een 1.5 mL-buis, was ze twee keer in 1,5 mL M9 media en centrifugeer de buis bij 100 x g gedurende 1 minuut te verwijderen van bacteriën en het genereren van een schoon 100 µL pellet van wormen.
    5. Resuspendeer de wormen in 480 µL van lysis buffer, 48 µL van 10% SDS en 480 µL van fenol: Chloroform: Isoamylalcohol. Vortex het monster bij maximumsnelheid voor 5 s en overdracht aan een schroefdop 1,5 mL tube met 750 µL van ijskoude Zirkonia kralen. Ga naar stap 3 van dit protocol voor de lysis van de wormen en de totale extractie van RNA.
  3. Drosophila melanogaster cultuur en collectie
    1. Desgewenst een C-seq-bibliotheek is vanaf vliegen, cultuur 20 – 25 vliegen in flesjes die dextrose of een medium van melasse gebaseerde bevatten. Aliquot de vliegen meer dan 3 flesjes, zo dat elke ampul bevat ongeveer 8 vliegen.
    2. Het verzamelen van de vliegen, plaatst u de ampul in een ijsemmer totdat de vliegen zijn gedrogeerd. Vervolgens, om ze met een penseel in een tube van 1,5 mL te verzamelen. Verzamelen de vliegen niet door CO2 behandeling.
    3. Laat de warme vliegt naar kamertemperatuur (RT), en snel een premade mengsel van 500 µL van lysis buffer, 50 µL van 10% SDS en 500 µL van fenol: Chloroform: Isoamylalcohol toevoegen aan de buis. Gebruik een micropestle om te slijpen van het vliegen met ongeveer 15 lijnen, vergezeld van een onderneming draaiende beweging wanneer de stamper de onderkant van de buis bereikt.
    4. Giet het mengsel van vliegen en lysis van de media in een schroefdop 1,5 mL tube met 750 µL van ijskoude Zirkonia kralen en vortex het bij maximumsnelheid voor 5 s. doorgaan naar stap 3 van dit protocol voor de lysis van de vliegen en de totale extractie van RNA.

3. totaal RNA zuivering

Opmerking: op dit moment alle drie protocollen convergeren, en een enkele, uniforme aanpak kan worden gebruikt voor het genereren van C-seq bibliotheken.

  1. Schroef de dop op strak en bevestig de buis aan een vortexer met een adapter of plakband. Vortex de buis bij maximumsnelheid voor 10 min lyse van de monsters. Vervolgens Centrifugeer het monster bij 16.100 x g gedurende 5 min te scheiden van de organische oplosmiddelen van de waterige fase.
  2. Verwijder voorzichtig 400-500 µL van de waterige fase zonder verstoring van de interfase wit, bewolkt, en het toe te voegen aan een conische tube van 15 mL met 1.9 mL bindende buffer. Meng ze door vortexing.
  3. Voeg 1,25 mL ethanol 100% en meng het monster door vortexing. 700 µL van het monster overbrengen in een filterpatroon geassembleerd in een collectie buis en het monster bij 14.500 x g draaien voor 30 s. herhalen totdat alle van het monster wordt doorgegeven door de cartridge.
    Opmerking: op dit punt, het monster kan zetten iets ondoorzichtig. Als te veel cellen, wormen of vliegen werden lysed, precipitaten kunnen blijken dat het filter kan verstoppen.
  4. Was het filter eenmaal met 700 µL van wassen oplossing 1 en tweemaal met 500 µL van wassen oplossing 2 of 3. Beëindig de wasbeurten door het draaien van de monsters bij 14.500 x g gedurende 2 min voor het verwijderen van eventuele overtollige ethanol.
  5. Het filterelement overbrengen in een tube van de dolfijn 1,5 mL en voeg 108 µL voorverwarmde elutie oplossing (65 ° C).
    Opmerking: Nooit bloot RNA monsters aan temperaturen hoger dan 65 ° C vóór een omgekeerde transcriptie, zoals doen dus cytosine uracil deamination gebeurtenissen die onmogelijk zijn provoceren zal te onderscheiden van transcriptie fouten.
  6. Degraderen van de DNA-besmetting in de geïsoleerde RNA (Zie stappen 2.1-3.4) door toevoeging van 11 µL van 10 x DNase ik buffer, 2 µL van RNase remmer en 4 µL van DNase ik (8 U), en laat hen bij 37 ° C gedurende 30 minuten inwerken.
  7. Voeg na vertering, 11 µL van DNase inactivatie reagens. Vortex het mengsel en laat het zitten op RT gedurende 5 minuten. Vervolgens Centrifugeer het monster bij 15.000 x g gedurende 3 minuten de inactivatie-reagens pellet en 110 µL van het supernatans dat verzamelen zonder de pellet te verstoren. Het supernatant overbrengen in een 1,5 mL-buis.
    Opmerking: De DNase inactivatie reagens kan heel moeilijk om Pipetteer goed, zo visueel inspecteren de pipet tip na elke pipetting actie. Als de inactivatie-reagens al te visceus aan Pipetteer wordt, toevoegen 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) gelijk is aan 1/5 van het resterende volume.
  8. (Kwaliteitscontrole) Het meten van de concentratie van de totale RNA met behulp van een spectrofotometer. Vervolgens 1 µL van totale RNA gereserveerd en Verdun het tot een concentratie van 10 ng/µL in nuclease-gratis (NF) water. Het RNA worden uitgevoerd op een passende nucleotide analyse-instrument met een hoge gevoeligheid RNA-Tape om ervoor te zorgen dat de RNA is niet gedegradeerd en een eRIN-waarde van ten minste 8,5 of hoger (figuur 2B heeft).

4. mRNA verrijking

  1. Uitvoeren van de mRNA verrijking met een mRNA-miniprep kit (Zie Tabel van materialen). 140 µL van NF water Voeg aan het monster voor een totaal volume van 250 µL. Dan, voeg 250 µL van 2 x bindende buffer, het monster Meng door vortexing en voeg 15 µL van oligo (dT) kralen.
  2. Meng het monster door pipetteren het op en neer en na het bebroeden bij 65 ° C gedurende 2 min. Leg vervolgens het monster op RT gedurende 10 minuten. Ten slotte, Centrifugeer het monster bij 16.100 x g gedurende 2 min naar de kraal: mRNA complexen pellet.
  3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 µL van wassen oplossing. Breng de oplossing over in een kolom spin en draai het voor 1 min bij 15.000 x g. Negeren de doorstroming en wassen van het monster met een extra 500 µL van wassen oplossing. Draai vervolgens, aan het monster gedurende 2 minuten bij 15.000 x g eventuele overtollige ethanol uit de spin filters verwijderen.
  4. De spin filter overbrengen in een dolfijn buis en resuspendeer de pellet in de kolom met 80 µL voorverwarmde elutie oplossing (65 ° C). Incubeer het monster gedurende 1,5 minuten bij 65 ° C en elueer het door het draaien van het voor 1 min bij 15.000 x g.
  5. Het meten van de concentratie van gezuiverde RNA met een spectrofotometer of gelijkaardig hulpmiddel waarmee voor de kwantificering van de concentratie van RNA en kwaliteit.

5. RNase III fragmentatie en RNA schoon te maken

Opmerking: (Belangrijk) ter voorbereiding van de circulaire RNA-moleculen die geschikt is voor het genereren van C-seq Bibliotheken, RNA naar ongeveer 60 – 80 bases in lengte moet worden gefragmenteerd. Terwijl de voorgaande methoden hebt gebruikt een chemische fragmentatie naar fragment RNA, introduceert chemische fragmentatie met zware metalen schade aan het RNA samples die kunnen worden geïnterpreteerd als transcriptie fouten tijdens de laatste analyse. Om dit probleem te omzeilen, in plaats daarvan vertrouwen op een versnippering RNase III met kleine fragmenten te genereren. Een bijkomend voordeel van deze enzymatische aanpak is dat het creëert compatibel uiteinden vereist voor afbinding, het wegnemen van de noodzaak van een einde-reparatie na de chemische versnippering.

  1. De reactie van de RNA-fragmentatie met 1 microgram van gezuiverde RNA ingesteld, 10 µL van reactie buffer, 5 µL van RNase III, en genoeg NF water om het volume tot 100 µL (Zie Tabel van materialen). Voeg het enzym laatst en Pipetteer het mengsel op en neer ten minste 10 keer te mengen. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 25 minuten, die de neiging om het produceren van RNA fragmenten van ongeveer 60-80 bases in lengte.
  2. Zodra de incubatie 25 min voltooid is, het opruimen van de reactie onmiddellijk met een oligo-opschonen en concentrator kit (Zie Tabel van materialen) om te voorkomen dat eventuele verdere vertering. 200 µL van oligo-bindende buffer aan het monster, meng het door vortexing en voeg 800 µL van 100% ethanol toevoegen. Meng het monster door vortexing en het overbrengen van een meegeleverde spin-kolom in een collectie buis.
  3. Centrifugeer het monster bij 10.000 x g gedurende 30 s en wassen met 750 µL van was buffer te verwijderen RNase III. Centrifugeer het monster bij 10.000 x g gedurende 30 s, negeren de doorstroming, en wassen van het monster nogmaals met 750 µL van was buffer zoals hierboven beschreven. Na de tweede doorstroming heeft verworpen, centrifugeren van de kolom bij 15.000 x g gedurende 2 min voor het verwijderen van eventuele overtollige ethanol.
  4. De kolom overbrengen in een tube van verse 1,5 mL en elueer van het monster in 24 µL van NF water door het draaien van het bij 10.000 x g gedurende 1 minuut.
  5. QUALITY CHECK: Neem 2 µL van het gezuiverde fragmenten van RNA en Verdun het 2-fold door 2 µL van NF water toe te voegen. De gefragmenteerde RNA worden uitgevoerd op een scherm-tape om ervoor te zorgen dat de gefragmenteerde RNA in het bereik van 50-100 bases in lengte (Figuur 2 c).

6. RNA Circularization en glooiende cirkel omgekeerde transcriptie

  1. Om het circularize van de fragmenten van RNA, warmte-denatureren 20 µL van het monster bij 65 ° C gedurende 1 minuut en plaats deze op ijs onmiddellijk gedurende 2 minuten. Dan, Voeg 4 µL van 10 x T4 RNA ligase buffer, 4 µL van 10 mM ATP, 1 µL van RNase remmer, 1 µL van NF water en 8 µL van 50% polyethyleenglycol (PEG).
  2. Meng van het monster door vortexing, voeg vervolgens 2 µL van 10 U/µL van T4 RNA Ligase I. Mix het monster opnieuw door het pipetteren en na het bebroeden bij 25 ° C gedurende 2 uur in een thermocycler met de temperatuur van het deksel ingesteld bij 30 ° C.
  3. Na 2 uur, 10 µL van NF water Voeg aan het monster en opruimen van het monster met een oligo-opschonen en concentratie kit volgens specificaties van de fabrikant. Elueer het monster in 20 µL van NF water.
  4. Om te keren transcriberen de circulaire molecules van RNA, 4 µL van 10 mM dNTPs, 4 µL van 50 ng/µL willekeurige hexamers en 9 µL van NF water toevoegen aan 9 µL van RNA. Meng alles grondig door pipetteren, denatureren van het monster bij 65 ° C gedurende 1 minuut, en plaats deze op het ijs voor 2 min. winkel de resterende RNA als back-up.
  5. 8 µL van 5 x eerste-onderdeel synthese buffer, 2 µL van 0.1 mM DTT en 4 µL van 200 U/µL reverse-transcriptase toevoegen en meng alles door pipetteren. Incubeer het monster bij 25 ° C gedurende 10 minuten, gevolgd door een 20 min incubatie bij 42 ° C met het deksel ingesteld op 5 ° C hoger is dan de incubatietemperatuur.
    Opmerking: Een reverse-transcriptase met strand verplaatsing mogelijkheden moeten worden gebruikt bij deze stap te voorzien in een rollende omgekeerde transcriptie van de cirkel.
  6. 10 µL van NF water Voeg aan het monster en het schoon te maken met de oligo sanering en concentratie kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Elueer het monster in 42 µL van elutie oplossing.
  7. QUALITY CHECK: Verdun 2 µL van het single-stranded cDNA in 2 µL van NF water en uitvoeren van dit voorbeeld op een nucleotide analyse-instrument met een hoge gevoeligheid RNA Tape. Als de omgekeerde transcriptie goed, een bibliotheek van cDNA moleculen werkte, moeten variërend van ongeveer 60 – 1.500 bases in lengte, zichtbaar zijn. Idealiter is de meeste cDNA in het bereik van 500 – 1000 bases (figuur 2d).

7. tweede onderdeel cDNA synthese en einde reparatie

  1. Een tweede onderdeel synthese kit gebruiken voor het genereren van een double-stranded cDNA Bibliotheek. Leg de monsters op ijs en 30 µL van NF water toevoegen aan 38 µL van uw monster. Dan, voeg 8 µL van 10 x tweede onderdeel Buffer en 4 µL van tweede Strand enzym, en meng het monster door het zachte pipetteren voordat de incubatie bij 16 ° C gedurende 2,5 uur.
  2. Opruimen van de monsters met de oligo sanering en concentratie kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor 100 µL reacties en elueer de monsters in 38 µL van NF water.
  3. De reactie van de einde-reparatie door 20 µL van NF water toe te voegen aan 35.5 µL van double-stranded cDNA, 6.5 µL van einde herstellen reactie Buffer en 3 µL van einde Prep enzym Mix opgericht. Zorgvuldig controleren de reactie buffer voor witte precipitaten en ontbinden hen door hand-warming indien aanwezig.
  4. Meng de einde-reparatie reactie door pipetteren en Incubeer het bij 20 ° C gedurende 30 minuten, gevolgd door een tweede 30 min incubatieperiode bij 65 ° C. Stel de temperatuur van het deksel thermocycler bij 5 ° C hoger is dan de incubatietemperatuur.

8. adapter afbinding en grootte selectie van bereid bibliotheken

  1. Een scriptingregel bibliotheek voorbereiding-module gebruiken voor de voorbereiding van de definitieve bibliotheek (Zie Tabel van materialen). Eerst, Verdun de adapters voor volgende-generatie 10-fold sequencing in 10 mM Tris-HCl tot een eindconcentratie van 1,5 µM. Vervolgens 2.5 µL van verdunde adapter en 1 µL van afbinding enhancer toevoegen aan elk monster en meng ze door vortexing.
  2. Voeg 15 µL van Blunt/TA Ligase Master Mix, meng het door pipetteren en Incubeer het bij 20 ° C gedurende 15 minuten. Vervolgens Voeg 3 µL van uracil-specifieke excisie reagens enzym en het incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Nadat de afbinding voltooid is, 13,5 µL van NF water Voeg aan het monster voor een totaal volume van 100 µL en overgaan tot de selectie van de grootte.
    Opmerking: Het is best om grootte-select voor cDNA moleculen die in het bereik van 600-800 bases in lengte. Mochten de gefragmenteerde RNA-moleculen ongeveer 60 – 80 basissen in lengte, selecteren voor moleculen die 600-800 basis in lengte zal zorgen dat de meeste van de geselecteerde moleculen ten minste drie tandem wordt herhaald bevatten, ideaal voor de downstream processing en analyse.
  3. Toevoegen om te selecteren voor moleculen die 600-800 bp in lengte, 30 µL van de geresuspendeerde magnetische kralen (Zie Tabel of Materials), acclimated aan RT, aan elk monster en meng door pipetteren. Overdracht van het monster tot een 1,5 mL koker en Incubeer het bij RT gedurende 5 min.
  4. Leg het monster op een magnetische stand gedurende 5 minuten om te scheiden van de parels van de bovendrijvende substantie. Breng het supernatant (waarin de gewenste cDNA-moleculen) een nieuwe 1,5 mL tube te vervreemden van de magnetische kralen (die zijn gebonden aan grote cDNA moleculen).
  5. Een verse hoeveelheid 15 µL van magnetische kralen toevoegen aan elk samples, Meng door pipetteren, Incubeer gedurende 5 min op RT. plaats de monsters op een magnetische rek en hen Incubeer gedurende 5 min op RT. Vervolgens zorgvuldig verwijderen en verwijdering van het supernatant, om ervoor te zorgen niet te verstoren, de kralen.
    Let op: Gooi niet het magnetische kralen, die nu de gewenste doelgroep cDNA bevatten.
  6. Voeg 200 µL van 80% vers bereid ethanol aan elk van de monsters zonder verstoring van de Ingehuld magnetische kralen en incubeer 30 s. negeren de ethanol en wassen van de monsters nogmaals met 80% ethanol. Vervolgens volledig verwijderen van elk spoor van ethanol uit de monsters en drogen van de kralen voor 5 min maar wees voorzichtig niet te overdreven drogen de kralen. Als de kralen zijn overdried, verschijnt er scheuren in de pellets.
  7. Om elueer de monsters van de kralen, verwijder de buizen uit de magnetische stand en voeg 19 µL van 10 mM Tris-HCl. Pipet omhoog en omlaag meerdere keren te resuspended de kralen en Incubeer de monsters gedurende 5 minuten op RT. Als de parels werden overdried, incubeer hen voor > 10 min.
  8. Leg de monsters terug op de magnetische standaard en hen gedurende 5 minuten om te scheiden van de parels van de bovendrijvende substantie uit te broeden. Verwijder 15 µL van het supernatans dat met de zuivere, grootte-geselecteerd cDNA bibliotheken van de buizen voorzichtig en overbrengen naar een verse 1,5 mL-buis.

9. PCR versterking en reiniging van de laatste kraal

  1. Voeg 5 µL van universele primer en 5 µL van een unieke index primer (zie tabel van materialen) aan elk gezuiverd cDNA Bibliotheek en meng ze door pipetteren. Zorgvuldig controleren van de polymerase master mix voor kristallen en andere precipitaten en warm de master mix met de hand totdat de precipitaten ontbinden.
    1. Voeg 25 µL van de polymerase master mix aan het monster, meng ze door pipetteren, en volg de fietsen voorwaarden hieronder voor de PCR versterking. Uitvoeren van de eerste denaturatie bij 98 ° C gedurende 30 s, en voer een dubbele stap PCR reactie door denaturating de monsters bij 98 ° C voor 10 s en gloeien/extensie van de PCR producten bij 65 ° C gedurende 75 s (12 x), gevolgd door een laatste extensie bij 65 ° C gedurende 5 minuten en een onbepaalde hold bij 4 ° C.
  2. Reinigen van de definitieve bibliotheken door 45 µL van de geresuspendeerde magnetische kralen rechtstreeks naar de PCR reactie toe te voegen, meng ze door pipetteren, en hen op RT voor 5 min. overdracht Incubeer het monster tot een 1,5 mL koker en plaats deze in een magnetische stand. Incubeer het gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en wassen tweemaal met vers bereide 80% ethanol voor 30 s.
  3. Na de tweede wash, volledig verwijderen van de ethanol uit het monster, en drogen van de kraal pellet voor 5 min en elueer het in 35 µL van 0.1 x TE. Resuspendeer de kralen door hen pipetteren en incubeer hen bij RT gedurende 5 min. plaats het monster op de magnetische stand en na 5 min, 30 µL van het supernatans overbrengen in een verse 1,5 mL-buis. Opslaan van de bibliotheken van-80 ° C.
  4. QUALITY CHECK: 1 µL van de definitieve bibliotheek in 9 µL van NF water verdunnen en uitvoeren van het monster op een speciaal DNA-analyse-instrument met een hoog-gevoeligheids-chip; de meerderheid van cDNA moeten in het bereik van 600-800 bp in lengte (figuur 2e).
  5. Na de elutie, verstuur de monsters voor het rangschikken op een platform van massaal parallelle sequencing met behulp van 250 bp gekoppeld-einde leest, of 300 bp single-end leest.

10. bio-informatica analyse van cirkel rangschikking van gegevens

Opmerking: Analyseren en interpreteren van de ruwe gegevens van de C-seq-test vereist een speciale bio-informatica pijpleiding. Een schematische voorstelling van de pijpleiding die werd gebruikt voor onze analyses is afgebeeld in Figuur 3. Download deze pijpleiding op https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. Eerst, trim de leest verwijderen adapter sequenties en lage kwaliteit basis gesprekken met cutadapt18, met behulp van een kwaliteit score drempel van 20.
  2. Vervolgens identificeren de herhalingen gecodeerd door de concatemerized RNA molecuul gebruikmakend van een passende algoritme te detecteren herhalingen met een minimale grootte van 30 nucleotiden en een maximum van 2 incongruenties tussen herhaalt18. Een reeks van consensus ontlenen deze herhalingen en bijhouden van alle basis oproepen en bijbehorende kwaliteitsscores op elke positie.
    Opmerking: Omdat omgekeerde transcriptie op elke positie op het circularized RNA-molecuul beginnen kan, het begin van een herhaling niet noodzakelijkerwijs overeenkomt met het 5 '-eind van de gefragmenteerde RNA molecuul (hierna te noemen de afbinding punt). Dienovereenkomstig, zal de volgorde van de consensus niet continu kaart tegen de overeenkomstige transcriptome, die de identificatie van het punt van de afbinding vergt.
  3. Kaart ter identificatie van de afbinding punt, een concatemer van de reeks van de consensus tegen de verwijzing transcriptome met behulp van de uitlijning van de BLAST-achtige tool (BLAT)19.
    1. Samenvoegen van twee exemplaren van de volgorde van de consensus om ervoor te zorgen dat de toegewezen reeks ten minste één volledige ononderbroken exemplaar van het eerste fragment opeenvolging van RNA bevat. Vervolgens, draaien de volgorde van de consensus om te beginnen op de plaats van de voorspelde afbinding-punt.
  4. De sequenties van de gedraaide consensus tegen het genoom met behulp van TopHat20 in kaart en gebruiken de uitlijning voor het detecteren van enkele nucleotidepolymorfisme (SNPs) die kunnen worden verward met transcriptie fouten.
  5. Bel de transcriptie fouten uit de toegewezen gedraaide consensus sequenties en testen of de fouten van de kandidaat-vier extra tests doorstaan.
    1. Controleer eerst dat een fout transcriptie niet met een SNP overlapt (een typische vereiste is dat ten minste 20 leest nodig ter dekking van een bepaalde basis en niet meer dan 5% van de leest kan een alternatieve basis oproep steunen).
    2. Ten tweede, Controleer dat de volgorde van de consensus is afgeleid van ten minste 3 tandem wordt herhaald, elk waarvan de dezelfde basenpaar roept; en ten derde, zorg ervoor dat de som van de kwaliteitsscores van die positie meer dan 100 moet.
  6. Voor een vierde en laatste controleren, draaien de volgorde van de consensus in alle mogelijke combinaties (simuleren van alle mogelijke standen van de afbinding punt) en elke versie tegen het genoom van de verwijzing met behulp van TopHat kaart.
    Opmerking: Als een perfecte match men van de gedraaide sequenties in het genoom vindt, de overeenkomstige afbinding punt wordt nu beschouwd als de juiste is en de transcriptie fout oproep moet worden afgewezen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals alle benaderingen van massaal parallelle sequencing produceert elk C-seq-experiment een logge, grote dataset. Voor first-time gebruikers is het moeilijk te behandelen deze datasets; Dus, is het aanbevolen dat alle gebruikers contact met een ervaren bio-informaticus voorafgaand aan het experimenteren. Gemiddeld, is de verwachting dat gebruikers zal het genereren van ongeveer 55 – 70 Giga basen (Gbases) per run op de meeste platformen van massaal parallelle sequencing. Voor dit protoc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde protocol voor de bereiding van C-seq bibliotheken voor het opsporen van fouten van de transcriptie in Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegansen Drosophila melanogaster. Dit protocol heeft vele voordelen ten opzichte van de bestaande protocollen, evenals alternatieve technieken.

In de afgelopen 15 jaar, zijn talrijke verslaggever systemen ontwikkeld die afhankelijk zijn van luciferase7,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze publicatie werd mogelijk gemaakt door financiering verlenen T32ES019851 (C. Fritsch), toekennen R01AG054641, en een jonge onderzoeker van AFAR (M. Vermulst).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RiboPure RNA purification kitThermoFisherAM1926Total RNA purificatie
Genelute mRNA purification kitSigma-AldrichMRN70-1KTmRNA-zuivering
Nuclease-vrij WaterAmbionAM9937Elutie en verdunning
Ambion RNase IIIThermoFisherAM2290RNA-fragmentatie
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204SRNA-circulisatie
RibolockThermoFisherEO0381RNase-remmer
SuperScript III Reverse TranscriptaseThermoFisher18080044Rolling circle reverse transcriptie
10 mM dNTP-mixThermoFisher18427013Rolling circle reverse transcriptie
Random hexamers (50 ng/&/micro;L)ThermoFisherN8080127Rolling circle reverse transcriptie
NEB Second Strand Synthesis ModuleNew England BiolabsE6111SSecond Strand Synthese
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for IlluminaNew England BiolabsE7370ScDNA-bibliotheekvoorbereiding
NEB Next index primersNEBE7335SMultiplex PCR-primers
Oligo Clean & ConcentratorZymo ResearchD4061Opruiming van RNA- en DNA-monsters
DynaMag-2 MagnetThermoFisher12321DMagneetparelzuivering
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881Magneetparelzuivering
Eppendorf 5424 MicrocentrifugeFisherScientific05-403-93centrifugatie
INCU-Shaker 10 LBenchmark ScientificH1010Celcultuur
T100 Thermal CyclerBIO RAD1861096Middelmatige tot hoge temperatuur cycluscondities
PTC-200 Thermal CyclerGMI8252-30-0001 Lage temperatuur cycluscondities
RNase AwayMolecular Bioproducts700S-11Sterilisering
50 mL CentrifugebuisCorning430290Nuclease-vrij
15 mL CentrifugebuisCorning430052Nuclease-vrij
Eppendorf buisjesUSA Scientific1615-5500Nuclease-vrij
4200 Tapestation SystemAgilentG2991AANucleotide-analyse-instrument voor kwaliteitscontrole van RNA en enkelstrengs DNA-monsters
High Sensitivity RNA Screen TapeAgilent5067-5579Kwaliteitscontrole van RNA en enkelstrengs DNA-monsters
RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5577Kwaliteitscontrole van RNA en enkelstrengs DNA-monsters
RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5578Kwaliteitscontrole van RNA en enkelstrengs DNA-monsters
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentG2939BADubbelstrengs DNA kwaliteitscontrole
High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626Kwaliteitscontrole voor dubbelstrengs cDNA-monsters
Water BathVWR462-0244Incubatie
NanoDrop 2000/2000C SpectrophotometerThermoFisherND-2000CBepaling van RNA-concentratie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484(2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065(2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36(2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Circle Sequencing AssayRNA polymerasegetrouwheidSaccharomyces cerevisiaeDrosophila melanogasterCaenorhabditis elegansRNA fragmentcircularisatieT4 RNA ligasereverse transcriptiesynthese van de tweede strengadapterligatieselectie van korrelgrootte met magnetische kralenPCR amplificatieopschoning van de library

Gerelateerde artikelen