Evaluatie van de rol van mitochondriale functie in moeheid in verband met kanker

Samenvatting

Ons doel was het ontwikkelen van een praktische protocol om te evalueren van de mitochondriale dysfunctie vermoeidheid bij kankerpatiënten is gekoppeld. Dit innovatieve protocol is geoptimaliseerd voor klinisch gebruik waarbij alleen standaard phlebotomy en basic Labor procedures.

Samenvatting

Vermoeidheid is een gemeenschappelijk en het afmatten voorwaarde dat de meeste patiënten met kanker beïnvloedt. Tot op heden, test vermoeidheid blijft slecht gekenmerkt met geen diagnostische voor objectief maatregel de ernst van deze aandoening. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor de beoordeling van de mitochondriale functie van PBMCs verzameld uit vermoeid kankerpatiënten. Met een compacte extracellulaire flux-systeem en de sequentiële injectie van respiratoire remmers, onderzochten we PBMC mitochondriale functionele status door het meten van de basale mitochondriale ademhaling en luchtwegen reservecapaciteit energie fenotype, waarin wordt beschreven het traject van de voorkeur energie om te reageren op stress. Verse PBMCs zijn beschikbaar in de klinische setting met behulp van standaard phlebotomy. De hele test beschreven in dit protocol kan worden afgerond in minder dan 4 uur zonder de betrokkenheid van complexe biochemische technieken. Daarnaast beschrijven we een normalisatie-methode die nodig is voor reproduceerbare gegevens te verkrijgen. De eenvoudige procedure en de normalisatie methoden gepresenteerd mogelijk voor herhaalde sample collectie van dezelfde patiënt en generatie van reproduceerbare gegevens die kunnen worden vergeleken tussen de tijdstippen te evalueren van potentiële effecten van de behandeling.

Inleiding

Vermoeidheid is een overwegend en pijnlijke aandoening die een negatief effect op de kwaliteit van leven van kanker patiënten^{1 heeft}. Tot op heden, kanker vermoeidheid blijft slecht gedefinieerde en vertrouwt alleen op subjectieve rapportage door patiënten². Daarom is er dringend behoefte aan een eenvoudig aan te passen diagnostisch laboratoriumtest objectief karakteriseren vermoeidheid in de klinische setting^3,4te identificeren.

Meerdere onderliggende mechanismen, met inbegrip van de mitochondriën dysfunctie, hebben voorstellen gedaan tot vermoeidheid⁵. Mitochondriën zijn de krachtpatser organellen, met 95% van cellulaire energiebehoefte via oxidatieve fosforylatie, en een belangrijke rol spelen bij calcium signalering, apoptosis, immuun signalering en regulering van de andere intracellulaire signalering gebeurtenissen⁶ . Dienovereenkomstig, verminderde mitochondriale Bioenergetica en gebreken in de energieproductie kunnen bijdragen aan vermoeidheid. Ter ondersteuning van deze hypothese, hebben vorige studies waargenomen mutaties in het mitochondriaal DNA bij patiënten met chronische vermoeidheid syndroom⁷. Terwijl het blijft onduidelijk of de pathofysiologische oorsprong van vermoeidheid ligt binnen het centrale zenuwstelsel of perifere weefsels, zoals skeletspieren^8,9, is er momenteel geen directe methode om nauwkeurig beoordelen mitochondriale dysfunctie gerelateerde tot vermoeidheid in live, respiring cellen.

Met behulp van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te bestuderen van mitochondriale functie biedt een aantal voordelen. Eerst PBMCs zijn beschikbaar in de klinische setting met behulp van standaard phlebotomy en kunnen worden geïsoleerd snel met behulp van eenvoudige laboratoriumtechnieken. Ten tweede, is de bloedinzameling minder invasief dan het verzamelen van andere weefsels zoals een biopsie van spier. Zo kunnen bloedmonsters worden verzameld uit de dezelfde patiënt herhaaldelijk na verloop van tijd, dat longitudinale beoordeling van de effecten van de behandeling vergemakkelijkt. Interessant, leek mitochondriale functie in PBMCs te worden goed gecorreleerd met nier mitochondriale status in een diermodel¹⁰. Bovendien hebben immuun cel mitochondriën is gebruikt als een proxy voor het opsporen van systemische veranderingen onder andere ziekte voorwaarden^11,12. Mitochondriën in circulerende immune cellen zijn vooral gevoelig voor veranderingen in immuun functies en immuun signalering van moleculen zoals cytokines^13,14,15. Men heeft bijvoorbeeld opgemerkt dat PBMCs van patiënten met acute reumatische inflammatoire ziekten hoge basislijn zuurstof verbruik^{14 vertonen}. Daarentegen was zuurstofverbruik in PBMCs geïsoleerd van patiënten met systemische inflammatoire voorwaarden waaronder sepsis¹⁶verlaagd. Inflammatoire voorwaarden, kunnen de vrije radicalen geproduceerd door disfunctionele mitochondriën verder bijdragen tot verhoogde oxidatieve stress en langdurige ontsteking¹⁷. De centrale rol van mitochondria in de productie van de energie zo goed zoals in oxidatieve stress suggereert het potentiële nut van het gebruik van mitochondriale functie als een proxy voor de studie van vermoeidheid in kanker patiënten ¹³.

Eerdere studies onderzoeken van mitochondriale functie gebruikt biochemische technieken, mitochondriale membraan potentiële meting of isolatie van specifieke cel populaties die niet mag gemakkelijk aanpasbaar in de klinische setting^{5, 14,18}. In de afgelopen jaren de ontwikkeling van extracellulaire flux tests hebben onderzoekers gemakkelijk en nauwkeurig onderzoeken van wijzigingen in zuurstof verbruik tarief (OCR) in reactie op geautomatiseerde injecties van respiratoire remmers^{19,20 , 21 , 22}. echter, de meeste van deze studies zijn ontworpen voor specifieke celtypes en het grote formaat van de hoge gegevensdoorvoer mogelijk niet van toepassing in een klinische setting. In dit manuscript beschrijven we een geoptimaliseerde protocol voor de behandeling van mitochondriale functie voor klinisch gebruik.

Protocol

De huidige studie (NCT00852111) werd goedgekeurd door de institutionele Review Board (IRB) van de National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Deelnemers ingeschreven in deze studie werden euthymic mannen, 18 jaar of ouder, die niet-gemetastaseerd prostaatkanker met of zonder voorafgaande prostatectomie werden gediagnosticeerd en waren gepland om te ontvangen van de lichtbundel van de externe radiotherapie (EBRT). Potentiële deelnemers waren uitgesloten indien zij had een progressieve ziekte die leiden grote vermoeidheid tot kan, psychiatrische ziekte binnen de afgelopen vijf jaar had, had ongecorrigeerd hypothyreoïdie of bloedarmoede, of had een tweede maligniteit. Personen die sedativa, steroïden of niet-steroïdale anti-inflammatoire agenten gebruikte werden ook uitgesloten. Gezonde controle werden bloedmonsters bij de NIH departement van transfusiegeneeskunde van gezonde donoren onder een IRB-goedgekeurde protocol (NCT00001846). Alle deelnemers worden gerekruteerd bij de Magnuson Clinical Research Center op de NIH. Ondertekende schriftelijke geïnformeerde toestemming zijn verkregen vóór deelname van de studie.

1. de mitochondriale functie meting voorbereiding (dag 1 van het Experiment)

1. Hydrate Sensor Cartridge (Zie Tabel of Materials; geschatte duur: 5 minuten).
   1. Sensor Cartridge uit pakket verwijderen. Voeg 200 μl kalibrant oplossing in elk putje van de plaat hulpprogramma, vul dan elke gracht met 400 μL kalibrant oplossing.
   2. Sensor plaat terug naar de utility-plaat, die inmiddels kalibrant oplossing erin. Hydrateer de Cartridge in een niet-CO₂ -37 ° C incubator's nachts.
      Opmerking: Sensor Cartridge moet worden gehydrateerd voor een minimum van 4 uur en een maximum van 72 uur.

2. klinische monstervoorbereiding (dag 2 van het Experiment)

1. Meten van vermoeidheid met behulp van de 13-item functionele beoordeling van chronische ziekte therapie - vermoeidheid (FACIT-F)^2,23,24 op basislijn (vóór EBRT initiatie), middelpunt en voltooiing van EBRT, en de 1-jarige post-EBRT.
   1. Gebruik een 0 - 4 schaal voor elk item antwoord, waar een 0 geeft aan dat "helemaal niet" en een 4 geeft aan dat de verweerder heeft betrekking op de overeenkomstige instructie "heel erg." Totaalscores moeten variëren van 16-53, met lagere scores als gevolg van hoge vermoeidheid intensiteit.
   2. Vermoeidheid als een FACIT-F-score lager dan 43, met een score van de FACIT-F van ≥43 aangeeft, ontbreken van of niet klinisch-zinvol vermoeidheid²definiëren.
      Opmerking: Een score FACIT-F van 43 beste verdeelt vermoeidheid scores van kankerpatiënten en de algemene bevolking².
   3. De volgende 13 items worden opgenomen in de FACIT vermoeidheid schaal: 1) ik voel me vermoeid; 2) Ik voel me zwak helemaal; 3) Ik voel me lusteloos ("gewassen"); 4) Ik voel me moe; 5) ik problemen ondervindt bij het starten van dingen, want ik moe ben; 6) ik problemen ondervindt bij het afwerken van dingen, want ik moe ben; 7) Ik heb energie; 8) Ik ben in staat om te doen van mijn gebruikelijke activiteit; 9) Ik nodig om te slapen tijdens de dag; 10) Ik ben te moe om te eten; 11) behoeftehulp van I doen van mijn gebruikelijke activiteiten; 12) Ik ben gefrustreerd door het wordt te moe om te doen de dingen die ik wil doen; en 13) ik moet mijn sociale activiteit te beperken omdat ik moe ben.
2. PBMC isoleren van vers verzameld bloedmonsters (geschatte duur: 1 uur).
   1. Verzamelen van 8 mL bloed in een mononucleaire cellen Preparation Tube (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: Bloedmonsters moeten worden verwerkt binnen 2 uur van collectie. De kwaliteit van PBMCs kan worden aangetast als bloedmonsters meer dan 2 uur na sample collectie verwerkt worden.
   2. Centrifugeer bij 1.750 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (18-25 ° C). De bewolkte laag overbrengen in een conische tube van 15 mL. Voeg maximaal 15 mL PBS en 5 keer omkeren.
   3. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig en verwijder het supernatant zonder storende pellet. Resuspendeer de pellet door tot 10 mL PBS toe te voegen, en 5 keer omkeren.
   4. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Negeren van vloeibare supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL PBS. De PBMCs overbrengen in een 1,5 mL microfuge buis.
   5. Centrifugeer bij 610 x g gedurende 10 minuten. Zorgvuldig verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet in volledige RPMI-1640 (RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS, 10 mM penicilline/streptomycine).
3. Jas van cel platen voor niet-aanhanger cellen (geschatte duur: 30 min).
   1. Bereiden van cel- en weefseltransplantaties zelfklevende oplossing (Zie Tabel van materialen) door verdunning van de stockoplossing in 0,1 M natriumbicarbonaat pH 8,0. De werkoplossing dient bij 3.5 μg/cm² van oppervlakte.
      Opmerking: Deze oplossing bevat polyphenolic eiwitten de mariene Mossel, Mytilus edulisis onttrokken. Deze eiwitten zijn belangrijke onderdelen van de lijm uitgescheiden door de Mossel om zelf op oppervlakken te verankeren. Wij vinden dat cel-Tak het beste met PBMCs werkt.
   2. Voeg 100 μl van de verdunde lijm oplossing aan elk putje en incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoel driemaal met DI water en lucht droog.

3. mitochondriale functie meting

1. Voorbereiding van Assay Media (geschatte duur: 10 min).
   Opmerking: Assay media moet vers worden bereid op de dag van het experiment.
   1. L-glutamine, pyruvaat en glucose naar de basis van de media (de dezelfde bestanddelen als de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM), maar zonder natrium-bicarbonaat, glucose, glutamine, of natrium pyruvaat) zodat assay media toevoegen. Media opwarmen tot 37 ° C, pH aan 7.4 vervolgens aanpassen.
      Opmerking: Concentraties van L-glutamine, glucose en pyruvaat zijn meestal hetzelfde als concentraties in normale groeiomstandigheden en media, maar kunnen worden aangepast op basis van de bepaling.
2. PBMCs voorbereiden op de Mito Stress-test (geschatte duur: 2 h).
   1. Plaat genoeg PBMCs uit stap 2 in elk putje 80-90% confluentie bereiken. In onze ervaring, 1.5 x 10⁵ cellen/well de meest consistente resultaten opgeleverd.
      Opmerking: Wells A en H zijn achtergrond putten en mag alleen assay media met geen cellen bevatten. In putten B tot en met G, is het raadzaam minimaal 3-6 wells per patiënt monster plating om rekening voor uitschieters.
   2. Spin platen neer bij 200 x g gedurende 2 min aan cellen vast te houden aan de onderkant van de putten toestaan. Wassen van de cellen een keer met Assay media. Deze stap verwijdert serum en natriumbicarbonaat uit de media groei.
      Opmerking: In onze ervaring, het wassen stap meestal verwijdert 20-30% van de cellen.
   3. 180 μL Assay media toevoegen aan elk putje, met inbegrip van achtergrond wells A en H. Incubate in een niet-CO₂ -37 ° C incubator voor 45-60 min.
3. De Mito stresstest uitvoeren
   1. Reconstrueren drugs in de Mito Stress Kit met assay media als volgt:
      1. Oligomycin: Voeg 252 μL assay media in de flacon voor het genereren van een stamoplossing bij 50 μM.
      2. FCCP: Voeg 288 μL van assay media in de flacon voor het genereren van een stamoplossing bij 50 μM.
      3. Antimycin A / rotenon: 216 toevoegen μL van assay media in de flacon voor het genereren van een stamoplossing op 25 μM.
   2. Vortex gereconstitueerd drugs voor ongeveer 1 minuut. Verdun in werkende oplossingen.
      Opmerking: Concentraties van de werkoplossing moeten worden getitreerd en vooraf bepaalde voorafgaand aan het experiment afhankelijk van het celtype. Voor PBMCs, vinden we dat 1 μM van Oligomycin, 1 μM FCCP en 0,5 μM antimycin A / rotenon werken het beste.
   3. Pipetteer de drugs in elke haven in de sensor patroon opeenvolgend:
      1. Haven A: Pipetteer 20 μL van 10 μM Oligomycin, voor een uiteindelijke concentratie in elk putje van 1 μM.
      2. Poort B: Pipetteer 22 μL van 10 μM FCCP, voor een uiteindelijke concentratie in elk putje van 1 μM.
      3. Haven C: Pipetteer 25 μL van 5 μM antimycin A / rotenon voor een uiteindelijke concentratie in elk putje van 0,5 μM.
4. Selecteer "Mito Stress Test" op een instrument dat extracellulaire flux. Volg instrument prompt en plaats de sensor cartridge. Het instrument zal automatisch sensor kalibratie uit te voeren. Voeg cel plaat nadat sensor kalibratie, en het instrument zal de rest van de bepaling. Dynamiek van de zuurstof wordt gemeten op 530 nm (excitatie) / 650nm (emissie), en proton-concentratie wordt gemeten op 470 nm (excitatie) / 530 nm (emissie).

4. normalisatie van mitochondriale functie gegevens

1. Bereid cel proliferatie Assay-oplossing (geschatte duur: 5 minuten).
   1. 48 μl nucleïnezuur vlek (500 x) en 240 μL achtergrond suppressor toevoegen aan 11,7 mL PBS (2 x). De vlek nucleïnezuur is een cel-permeant DNA-bindende kleurstof en de achtergrond suppressor is een maskeren kleurstof die dode cellen of cellen met gekraakte celmembraan integriteit van gekleurd wordt geblokkeerd. De combinatie van de DNA-bindende kleurstof en de achtergrond suppressor zorgt ervoor dat alleen levende cellen zijn gekleurd.
   2. Voeg gelijk volume 2 x werkoplossing (180 μL) direct in het medium in elk putje nadat de Mito Stress-Test is voltooid.
2. Incubeer de cellen in het bijzijn van cel proliferatie assay oplossing in een 37 ° C incubator voor 45-60 min. Quantify het aantal levende cellen (TL) op een afleesapparaat op 508 nm (excitatie) / 527 nm (emissie) en normaliseren van OCR-gegevens (geschatte duur: 10 min) .
   Opmerking: naast het aantal levende cellen, gebruikers kunnen ook kiezen om te normaliseren hun gegevens met het totale aantal cellen, het bedrag van nucleic zuur, eiwit-concentratie, enz.

Resultaten

De Mito Stress Test berust op het meten van zuurstof verbruik tarief (OCR) na sequentiële injectie van verschillende respiratoire remmers een compleet mitochondriale profiel toewijzen. OCR metingen na de injectie van elke drug kan worden gebruikt voor het berekenen van de volgende parameters in verband met mitochondriale gezondheid: Basale OCR wordt eerst gemeten vóór elke drug injectie te beoordelen zuurstofverbruik nodig om te voldoen aan niveau ATP vraag rusten. Basale...

Discussie

Vermoeidheid bij kankerpatiënten is een invaliderende aandoening die is niet goed gedefinieerd of¹gekenmerkt. Diagnose van vermoeidheid is volledig gebaseerd op subjectieve rapportage en er is geen huidige diagnostische standaard of behandeling voor deze aandoening, grotendeels te wijten aan een gebrek aan inzicht in de pathobiology². Van de voorgestelde mechanismen ten grondslag liggen aan de vermoeidheid bij kankerpatiënten, is bijzondere waardeverminderingen in mitochond...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube	BD Biosciences	362761	Voor het isoleren van PBMC's na venepunctie
RPMI-1640	Corning	10-040	Voor het maken van groeimedia voor PBMC's
Fetal bovien serum (FBS)	Corning	35-010-CV	Voor het maken van groeimedia voor PBMC's
Penicilline/Streptomycine	ThermoFisher	15140122	Voor het maken van groeimedia voor PBMC's
Cell-Tak	Corning	354240	Cel- en weefsel kleefoplossing; laat suspensiecellen aan de oppervlakte hechten
Seahorse XF Calibrant Solution	Agilent	103059-000	Voor het hydrateren van cartridges
XFp Fluxpak (miniplaten en sensor cartridges)	Agilent	103022-100	Bevat XFp celcultuur miniplaten en sensor cartridges
XF basismedia	Agilent	103335-100	Voor het maken van XF assay media
45% celcultuur D-(+)-Glucose oplossing	Corning	25-037-CI	Voor het maken van XF assay media
Natriumpyruvaat oplossing	Corning	25-000-CI	Voor het maken van XF assay media
L-glutamine oplossing	ThermoFisher	25030081	Voor het maken van XF assay media
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit	Agilent	103010-100	Bevat oligomycine, FCCP, antimycine A/rotenon
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay	ThermoFisher	C35011	Voor kwantificering van levende cellen en data normalisatie
Seahorse XFp Analyzer	Agilent	S7802AEA	Voor het meten van mitochondriale functie in levende cellen
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (of elk instrument dat fluorescente cellen in een plaat kan kwantificeren)	BioTek	BTCYT5PV	Voor kwantificering van levende cellen en data normalisatie