Bronchoalveolar Lavage Exosomes Lipopolysaccharide-geïnduceerde septische long letsel

Samenvatting

Muizen blootgesteld aan intraperitoneaal LPS afscheiden exosomes in Broncho-alveolaire lavage (BAL) vloeistof die zijn ingepakt met miRNAs. Met behulp van een systeem co cultuur tonen we dat exosomes vrijgegeven in de BAL vloeistof expressie van strakke junction eiwitten in bronchiale epitheliale cellen verstoren en verhogen van expressie van pro-ontsteking cytokinen die long letsel accentueren.

Samenvatting

Acute long letsel (ALI) en acute respiratory distress syndrome (ARDS) vormen een heterogene groep van longziekten die nog steeds een hoge morbiditeit en mortaliteit. De moleculaire pathogenese van ALI wordt beter gedefinieerd; echter, vanwege de complexe aard van de ziekte moleculaire therapieën moeten nog worden ontwikkeld. Hier gebruiken we een lipopolysaccharide (LPS) geïnduceerde muismodel van acute septische long letsel af te bakenen de rol van exosomes in de inflammatoire respons. Met behulp van dit model, hebben wij laten zien dat muizen die zijn blootgesteld aan intraperitoneaal LPS afscheiden exosomes in Broncho-alveolaire lavage (BAL) vloeistof uit de longen die zijn ingepakt met de miRNA en cytokinen tot regeling van de ontstekingsreactie. Verder gebruikt een modelsysteem co cultuur, laten we zien dat exosomes verlost van macrofagen expressie van strakke junction eiwitten in bronchiale epitheliale cellen verstoren. Deze resultaten suggereren dat 1) cross talk tussen aangeboren immuun en structurele cellen via de exosomal pendelen bijdraagt aan het inflammatoire respons en verstoring van de structurele barrière en 2) gericht op deze miRNAs een nieuw platform bieden kan te behandelen ALI en ARDS.

Inleiding

ALI en ARDS zijn de levensbedreigende vormen van respiratoire insufficiëntie met ernstige hypoxemia veroorzaakt door niet-cardiogeen longoedeem die ongeveer 1 miljoen mensen wereldwijd treft jaarlijks¹. De etiologie van ARDS omvat directe schade aan de longen van infecties of aspiratie en een scala aan indirecte beledigingen. De afgelopen tien jaar is er een toegenomen begrip van de moleculaire pathogenese van ARDS, specifieke gerichte behandelingen voor ARDS zijn echter nog worden ontwikkeld^2,3.

Verschillende dierlijke modellen van acute long letsel hebben ontwikkeld die voorzien in een brug vertalen van experimentele therapieën op menselijke studies^4,5. Gebruikte modellen omvat lokale installatie van oliezuur, bacteriën, LPS en bleomycine. Andere benaderingen omvatten ischemie-reperfusie, cecal afbinding punctie, mechanische ventilatie-geïnduceerde stretch letsel, hyperoxia of systemische toediening van bacteriën en LPS⁵. Deze modellen bieden een nuttige biologisch systeem om te testen van klinische hypothesen en voor de ontwikkeling van mogelijke therapieën. Als u wilt nabootsen menselijke ARDS, moeten dierlijke modellen reproduceren ontsteking en acute schade aan de epitheliale en endotheliale cellen met afwijkingen in de functie van de barrière in de longen.

Exosomes zijn membraan blaasjes met 20-200 nm in diameter, waarvan de moleculaire inhoud bevat eiwitten, DNA, RNA en lipiden, en vergemakkelijken van Inter cellulaire communicatie in weefsel communicatie via moleculaire samenstelling overdracht. Exosomes worden uitgescheiden door meerdere soorten cellen, zoals de endotheliale cellen, epitheliaale cellen, zachte spiercellen en tumorcellen, en bestaan in menselijke lichaamsvloeistof. Studies tonen aan dat exosomes cross-talk tussen immuuncellen en stromale cellen tijdens de bestrijding van infectiekiemen en steriele ontstekingsziekten reguleren, en hun abnormale vrijlating lijkt te worden geregeld door verschillende natuurlijke en experimentele prikkels tijdens fysiologische en ziekteprocessen⁶. Dergelijke communicatie-netwerk kan een belangrijke rol spelen in de pathogenese van longziekten en pathofysiologische progressie^7,8kan beïnvloeden. Zo 18-22 nucleotide niet-coderende RNAs, miRNAs bestaan in zowel weefsels en lichaamsvloeistoffen, plasma, sera en moduleren van mRNA uitdrukking bij posttranslationele niveau^9,10.

Verpakte miRNAs in exosomes differentiatie en functie van meerdere soorten cellen beïnvloeden, en buitensporige niveaus worden geassocieerd met een verscheidenheid van ziekten, waaronder kanker, longziekten, obesitas, diabetes en hart-en vaatziekten^{11, 12,13,14,15,16}. Inwerkingtreding van de ontvangende cellen en pendelen van exosomal miRNAs vergemakkelijken intercellulaire communicatie wijzigen de hemostase communicatie^17,18. Acute Long-blessure is een complexe processen, waarbij meerdere celtypen met uitgebreide intercellulaire communicatie via exosomes⁸. miR-155 en miR-146a delen van de gemeenschappelijke transcriptionele reguleringsmechanisme en bijdragen aan de ontstekingsreactie en de immuun tolerantie^19,20. Recente studies tonen aan dat zowel ontstekingsreactie moduleren via exosomal miRNAs pendelen tussen immuuncellen²¹. Echter, de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan f effecten van exosomal miRNAs op de alveolaire reactie op endotoxine onduidelijk blijven, ongetwijfeld de potentiële klinische relevantie en translationeel implicatie verdienste verder onderzoek.

Co cultuur modellen gebruikt om te definiëren van de wisselwerking tussen de specifieke celtypes in de complexe omgeving, zoals de ontsteking en kanker^22,23. Deze platforms bieden een alternatieve strategie te ondervragen cross talk tussen celtypen, met name voor immuun en structurele cellen.

Intra-tracheale, aërosol, intraperitoneaal of systemische toediening van LPS worden veel gebruikt voor het opwekken van experimentele long letsel^24,25,26, en voor het opwekken van epitheliale en endotheel permeabiliteit is gebleken defecten. We gebruiken hier intraperitoneaal LPS ertoe een septische model van acute lung injury in muizen. Binnen de 24u intraperitoneale toediening van LPS, permeabiliteit defecten veroorzaakt in de longen met de aanwerving van ontstekingscellen. Verder laten we zien dat de exosomes van de BAL miRNA-155 en miR-146a bevatten, en exosomes aan de BAL vloeistof opwekken van pro-ontsteking cytokinen expressie in ontvangende epitheliale cellen, met inbegrip van IL-6 en TNF-α. Deze gegevens zijn de eerste om te laten zien dat exosomal miRNAs bal in dit model van acute septische long letsel worden uitgescheiden.

Protocol

Het totale protocol vereist 2 dagen, met inbegrip van de eerste dag van sepsis inductie en isolatie van BAL vloeistof uit het dier, en de tweede dag voor exosomes isolatie van de muis BALF. Alle procedures zijn herzien en goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité aan Atlanta VA medical center.

1. Acute septische Lung Injury muismodel

1. Gebruik 6-8 weken - oude mannelijke wild-type C57BL/6J muizen (gewicht 20-22 g) voor het dier model, en uitvoeren van alle procedures met behulp van aseptische technieken en instrumenten. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten, met inbegrip van de Tang en schaar voor 20 min bij 121 ° C.
2. Willekeurig verdelen muizen in experimentele en controlegroep. Muizen op een chirurgische bord te bedwingen. Behandeling van muizen met Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS, 15 mg/kg) door intraperitoneaal route. Volgens de individuele lichaamsgewicht, Verdun passende LPS doseringen tot 0,1 mL PBS per muis, dan injecteren LPS oplossing met behulp van een injectiespuit 1 mL met 27 G naald en injecteren van een gelijkwaardige hoeveelheid PBS te controledieren.
3. Muizen in de dier faciliteit van de BSL2, die uit schone kooien op passende kamer temperatuur bestaat houden.
4. 24 uur later, euthanaseren muizen met CO₂ inademing.
5. Selecteer het chirurgische gebied in het midden van de nek van de muis. Maken van een kleine incisie (ongeveer 5 mm) en scheiden zachtjes spieren voor de toegang tot de luchtpijp met behulp van botte pincet totdat de luchtpijp wordt blootgesteld.
6. Trekken muis BAL vloeistof met 10 mL steriele injectiespuit met een naald 27 G. Voorzichtig, eerst de naald in de luchtpijp invoegen en injecteren van 1 mL steriele PBS langzaam in de luchtpijp, waarna BALF trekken in een 3 mL wegwerp injectiespuit met een naald 27 G. Gooi weg na voltooiing van de procedure, spuiten en naalden in biohazard slijpsel container.
7. Behandelen van chirurgische instrumenten met chloordioxide, zoals eerder is beschreven door Chauret et al. ²⁷, en vervolgens alle chirurgische instrumenten steriliseren in autoclaaf gedurende 20 minuten bij 121 ° C.

2. Exosomes isolatie-serial Ultra-centrifugeren en karakterisering

1. Verzamelen muis BAL vloeistof in 15 mL conische buisjes. Om te oogsten alveolaire cellen, Centrifugeer steekproeven voor 10 min op 1000 g, bij 4 ° C.
2. Het supernatant overbrengen naar nieuwe 15 mL conische buizen en centrifugeer monsters gedurende 30 minuten bij 4000 x g bij 4 ° C tot cel puin te verwijderen.
3. Verzamelen het supernatant in ultracentrifuge buizen en centrifuge monsters voor 60 min bij 10.000 x g bij 4 ° C om grotere cellulaire deeltjes te verwijderen.
4. De bovendrijvende vloeistof overdracht naar nieuwe conische buizen, filtreer vervolgens de monsters door 0,2 µm spuit-filter voor het verwijderen van de resterende grotere deeltjes.
5. Verzamelen van de monsters in de ultracentrifuge buizen en evenwicht van de buizen. Centrifugeer steekproeven voor 2 h bij 140.000 x g bij 4° C tot de exosomes pellet.
   Opmerking: De grootte van exosomes varieert 20-200 nm. 0,2 µm filter wordt gebruikt voor het verwijderen van grotere deeltjes die meer dan 200 zijn nm in grootte.
6. Gooi het supernatant zachtjes. Los van de pellet met 100 µL PBS of lysis van de oplossing, en overdracht exosomes monsters 1,5 mL buizen, en bewaren bij-80 ° C tot gebruik.
   Opmerking: Transmissie-elektronenmicroscoop wordt aanbevolen om te controleren of geïsoleerde exosomes.
7. Volg het standaardmonster van TEM verwerking protocol²⁸. Analyseren van exosomes monsters met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie, en nemen de beelden, schaal bar 200 nm.

3. voorbereiding van de miRNA en Performing miRNA-q-RT-PCR

Opmerking: miRNA-q-RT-PCR wordt aanbevolen voor het analyseren van expressie niveau van miRNAs.

1. Volg protocol van de isolatie van de standaard miRNAs en zorg ervoor dat u een gelijke hoeveelheid van gezuiverde RNAs in single-strand omgekeerde transcriptie²⁴.
2. Volg de real-time PCR standaardprotocol voor het detecteren van exosomal microRNA niveau in BAL vloeistof. Gebruik specifieke real-time PCR primers tegen miR-155, miR-146a en U6 SnRNA. PCR reactie worden uitgevoerd met het kwantitatieve PCR-apparaat en de waarden van de expressie naar interne controle U6 snRNA normaliseren.
   Opmerking: Elke groep bestaat uit drievoudige monsters²⁴.

4. Exosomes Labeling en zuivering

1. Schorten exosomes pellet met 100 µL schorsing oplossing in een polypropyleen tube van 1,5 mL, voeg dan 0.4 µL van de kleurstof van de exosomes in de andere buis met 100 µL van de luchtvering oplossing.
2. Snel exosomes in de oplossing toevoegen aan de oplossing van de kleurstof en meng het door pipetteren. Houd de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, beschermen tegen licht.
3. Zet één exosome spin kolom in een tube van 1,5 mL elutie. Het mengsel oplossing overbrengen in het midden van de kolom exosome spin.
4. Draai de kolom gedurende 2 minuten op 800 x g bij kamertemperatuur.
5. Negeren van de kolom en het eluted monster bij-20 ° C bewaren tot gebruik.

5. bevestiging van Exosomes genomen door ontvangende cellen

1. 1 x 10⁴ MLE 12 distributiedatum in een dia 8-well kamer en cultuur cellen bij 37 ° C, 5% CO₂zaad.
2. 10 µL van de TL-label van het exosomes aan de cellen toevoegen. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
3. Verwijderen van cultuurmedia en wassen van cellen met PBS, dan herstellen van cellen met 1% paraformaldehyde voor 10 minuten bij kamertemperatuur.
4. Monteer de dia in mount medium met DAPI.
5. Analyseren van monsters door een fluorescentie Microscoop en nemen van beelden, 40 X vergroting.

6. verificatie van de interactie tussen Exosomes en ontvangende cellen

1. Zaad 2 x 10⁵ MLE12 per putje in een 12-well cultuur plaat met passende kweekmedium en cultuur cellen bij 37 ° C, 5% CO₂.
2. 20 µg exosomes aan de vloeistof die muis BAL aan MLE12 cellen toevoegen en instellen van replicaat-organismen per experimentele groep.
3. 24 h later wassen met PBS cellen en toevoegen van 600 µL lysis-buffermengsel in put. Voorzichtig schudden van de plaat en het verzamelen van lysis van de monsters in 1,5 mL tube met de pipet.
4. De totale RNA isolatie standaardprotocol en cDNA omgekeerde transcriptie protocol volgen, de single-strand cDNA omgekeerde transcriptie²⁹compleet.
5. Volg de real-time PCR standaardprotocol voor het detecteren van mRNA uitdrukking niveau in ontvangende cellen²⁹. Gebruik specifieke real-time PCR primers tegen TNF-α, IL-6, en ZO-1. PCR reacties worden uitgevoerd met het kwantitatieve PCR-apparaat en de waarden van de expressie naar de interne controle GAPDH te normaliseren.
   Opmerking: Elke groep bestaat uit drievoudige monsters.

Resultaten

Om te induceren septische long letsel, werden muizen behandeld met intraperitoneaal LPS (15 mg/kg). Binnen de 24u van LPS administratie, werd neutrofiele toestroom gezien in de longen, zoals weergegeven in figuur 1A. Muis BAL vloeistof werd getrokken, gevolgd door isolatie en zuivering van exosomes. Morfologie van BALF exosomes werd bevestigd door Transmissie Electronenmicroscopie (figuur 1B).

Discussie

Muismodellen van ziekten worden vaak gebruikt om te evalueren van de fysiologische functie van specifieke genen en om de kosten van experimenten². De acute septische Long schade beschreven hier bootst ontstekingsreactie gezien bij mensen met ARDS. Dit model is relevante onderzoeken de Moleculaire Pathogenese, ontwikkeling van biomarkers en het testen van mogelijke nieuwe therapieën⁵.

Co cultuur systemen zijn relevant voor in vivo onderzo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich	Escherichia coli 055:B5
PBS pH7.2(1X)	Life technologies	20012-027
mirVana miRNA isolation kit	Thermo Fisher	449774
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher	4369016
mmu-miR-155 (002571) primer	Thermo Fisher	4427975
has-miR-146a (000468) primer	Thermo Fisher	4427975
U6 snRNA primer	Thermo Fisher	4427975
TNF-α (Mm00443258_m1 ) primer	Thermo Fisher	4331182
IL-6 (Mm00446190_m1   )primer	Thermo Fisher	4331182
ZO-1 (Mm00493699_m1  )primer	Thermo Fisher	4331182
minimal essential medium (MEM)	Thermo Fisher	11095-072
Trypsine-EDTA oplossing(0,05%)	Thermo Fisher	25300054
Exosomes werden gelabeld met PKH67 door PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit	Sigma-Aldrich	MINI67-1KT
Exosome Spin Columns (MW3000)	Thermo Fisher	4484449
Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge	Beckman Coulter	L-100XP
Ultra-clear centrifuge tubes	Beckman Coulter	344058
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System	Thermo Fisher
Transmissie-elektronenmicroscopen (TEM)	JEOL Ltd	120 kV TEM
Olympus BX41 microscoop	Olympus	BX41