Hier presenteren we een protocol ter bevestiging van de aanwezigheid van punt mutatie voor de diagnose van erfelijke transthyretin amyloidose, met behulp van Ala97Ser, de meest voorkomende endemisch mutatie in Taiwan, als voorbeeld.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Genetische analyse van erfelijke Transthyretin Ala97Ser gerelateerde amyloidose
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Genetische tests is de meest betrouwbare test voor erfelijke transthyretin gerelateerde amyloidose en in de meeste gevallen van transthyretin Amyloïdose (ATTR) moet worden uitgevoerd. ATTR is een zeldzame maar fatale ziekte met heterogene fenotypen; de diagnose wordt daarom soms uitgesteld. Met de toenemende aandacht en bredere erkenning op vroege uitingen van ATTR evenals opkomende behandelingen, passende diagnostische studies, met inbegrip van de transthyretin (TTR) genetische testen, om te bevestigen de types en varianten van ATTR zijn daarom fundamentele ter verbetering van de prognose. Genetische analyses met polymerase kettingreactie (PCR) methoden bevestigen de aanwezigheid van TTR puntmutaties veel sneller en veiliger dan met conventionele methoden zoals zuidelijke vlek. Hierin tonen wij genetische bevestiging van de ATTR Ala97Ser mutatie, de meest voorkomende endemisch mutatie in Taiwan. Het protocol omvat vier hoofdstappen: het verzamelen van volbloed specimen, DNA-extractie, genetische analyse van alle vier TTR exons met PCR, en DNA sequencing.
Inleiding
Transthyretin (TTR) amyloidose (ATTR) is de meest voorkomende vorm van erfelijke systemische amyloidose1, en kan worden veroorzaakt door een autosomaal dominant erfelijke mutatie in het gen transthyretin (TTR)2. TTR mutaties destabiliseren het tetramere eiwitstructuur en leiden tot haar dissociatie in monomeren die herassembleert in amyloïde fibrillen2. Meer dan 100 amyloidogenic TTR mutaties zijn gerapporteerde wereldwijd1. Genetische analyses met polymerase kettingreactie (PCR) methoden bevestigen de aanwezigheid van TTR punt mutatie en voordelen, waaronder het vermijden van de behandeling van radioactief gelabelde sondes in vergelijking met de zuidelijke vlek3hebben. PCR is een snelle, eenvoudige, goedkope en betrouwbare techniek die is toegepast op tal van gebieden in moderne wetenschappen4.
De vroegtijdige diagnose van deze progressieve en dodelijke ziekte is uitdagend gegeven haar fenotypische heterogeniteit. Met toenemende aandacht en bredere erkenning op de vroege uitingen van ATTR evenals de opkomende behandelingen5, zijn passende diagnostische studies, met inbegrip van TTR genetische test daarom kritisch fundamenteel voor het verbeteren van de prognose. Bovendien verschillende mutaties zijn geassocieerd met verschillende doordringendheid van de Trek, leeftijd van intreden, patronen van progressie, ernst van de ziekte, mediane overleving, werkzaamheid of lever transplantatie, TTR stabilisatoren2,6, en variabele graden van neurologische en cardiologische betrokkenheid, die grote gevolgen voor genetische counseling7,8,9 hebben. Bovendien, een zeer nauwkeurige genetische test is het enige hulpmiddel dat de twee verschillende soorten ATTR onderscheidt: erfelijke (mutant) en wild-type (niet-mutant vorm, seniele systemische amyloidose, SSA)7. Het is noodzakelijk om te bevestigen de soorten ATTR, omdat de therapieën2sterk uiteenlopen. Daarom is er een toenemende noodzaak om te beschrijven de stapsgewijze protocol van de TTR genetische test.
De moleculaire benadering om op te sporen van de mutatie wordt geïllustreerd met behulp van Ala97Ser, de meest voorkomende endemisch mutatie in Taiwan, als voorbeeld. Wijzigingen in de DNA-extractie stap verminderen het bedrag van de drie oplossingen gebruikt en levert van een voldoende hoeveelheid van DNA. In dit protocol, alle vier TTR exons werden geanalyseerd, terwijl de regio's, met inbegrip van 5' stroomopwaarts 3' stroomafwaarts, initiatiefnemers, introns, en niet-vertaalde regio's (UTR) waren niet gesequentieerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het testen uitgevoerd in het laboratorium werd uitgevoerd overeenkomstig de eisen van de klinische laboratorium verbetering amendementen (CLIA) van 1988, de verordeningen die zijn goedgekeurd door de institutionele Review Board van Chang Gung Memorial Hospital en Universiteit (licentie nr. 100 - 4470A3 en 104-2462A3). Geïnformeerde toestemming was verkregen bij alle patiënten.
1. Blood Specimen Collection
- Volbloed in verkrijgbare EDTA-behandelde buizen verzamelen. Meng voorzichtig en bewaren van bloedmonster bij 4 ° C tot verwerking.
2. DNA-extractie uit perifeer bloed
Gebruik van een DNA-extractie-Kit voor de genomic DNA-extractie (Zie Tabel van materialen).
- Voeg 10 mL van oplossing 1 aan het 4,0 mL bloedmonster. Incubeer het monster op het ijs gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer het monster bij 2.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder en zorgvuldig wordt weggeworpen. Resuspendeer de pellet in 3 mL oplossing 1.
- Centrifugeer het monster bij 2.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C weer en weggeworpen. Resuspendeer de pellet in 3 mL oplossing 2.
- Voeg 10 µL van pronase-stockoplossing (225 mg/mL) om een eindconcentratie van 100 µg/mL en meng goed. Incubeer bij 37 ° C's nachts.
- Chill de buis op ijs voor 10 min. toevoegen 0.8 mL van oplossing 3 aan het monster en omkeren van 3 - 5 keer. Leg het monster op het ijs gedurende 5 minuten.
- Centrifugeer het monster bij 3000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C. Zorgvuldig overbrengen in het supernatant een tube van 15 mL steriele conische centrifuge.
- Voeg 6 µL van RNase stockoplossing (10 mg/mL) om een eindconcentratie van 20 µg/mL. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Toevoegen van 2.5 mL isopropyl alcohol en meng grondig door voorzichtig omkeren van meerdere keren te precipiteren DNA (strengen van witte, flocculator materiaal zal vormen). Met behulp van een pipet grote boring, overbrengen in de neerslaande DNA een nieuwe 1,5 mL centrifugebuis.
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C. Zorgvuldig vloeistof wordt weggeworpen. Wassen DNA pellet door 500 µL van 70% ethanol toe te voegen.
- Centrifugeer bij 12.000 x g voor 1 min en weggeworpen. Lucht drogen DNA pellet bij kamertemperatuur. Voeg 100 µL van ddH2O en Incubeer bij 65 ° C gedurende 15 min naar resuspendeer DNA.
3. genomic DNA kwantificering
Gebruik van een spectrofotometer (Zie Tabel van materialen) om te ontdekken de kwantiteit en kwaliteit van de genomic DNA.
- Log in op de computer waarop de spectrofotometer machine aangesloten. De software niet openen.
- Initialiseer de spectrofotometer machine:
- Klik "Nucleic zuur" op de spectrofotometer software.
- Reinig het voetstuk met een disposable papier wipe en gezuiverd water.
- Leeg de spectrofotometer:
- Laden 2 µL van het gezuiverde water op het voetstuk.
- Verlaag de bovenarm van de spectrofotometer valt en klikt u op 'Leeg' te kalibreren, hoeft.
- Wanneer het heeft gedaan, til de bovenarm en het voetstuk met een doekje droog.
- Het meten van de steekproef:
- Klik op "DNA-50" op monster Type.
- Laden 2 µL van DNA-monster op het voetstuk.
- Verlaag de bovenarm en klik op "Maatregel" om de verhouding A260/A280 en de concentratie van het monster te meten.
- Reinig de sokkel tussen elke uitvoering met een doekje en gezuiverd water.
- Klik op de "Print Screen" om de gegevens te verzamelen.
4. Genetische analyses van mutaties
Versterken van doelDNA met de PCR-4. Uitvoeren van PCR in een reactie van 25 µL mengsel met behulp van een Polymerase van DNA kit (Zie Tabel van materialen). Tabel 1 toont de TTR-gene intronic inleidingen.
| gen | Primer volgorde |
| Exon1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' |
| Exon2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' |
| Exon3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' |
| Exon4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' |
Tabel 1. TTR gene intronic inleidingen. (NCBI referentie volgorde: NC_000018.10)
- De reagentia in tabel 2 toevoegen aan een PCR-tube van 0,2 mL.
| Onderdelen | Volume (µL) | Eindconcentratie |
| 10 x Buffer | 2.5 | 1 x |
| MgCl2 (25 mM) | 1.5 | 1,5 mM |
| 360 GC Enhancer | 1 | - |
| 360 DNA-Polymerase | 0.2 | 2 U/reactie |
| dNTP Mix (elke 25 mM) | 2 | elke 2 mM |
| Primer F (10 µM) | 1 | 0.4 ΜM |
| Primer R (10 µM) | 1 | 0.4 ΜM |
| DNA (100 ng) | 2 | |
| PCR-grade water | 13,8 | - |
| Totaal Volume | 25 | - |
Tabel 2. PCR reactie voorwaarden.
- Meng voorzichtig en kort centrifugeren op een benchtop centrifuge voor het verzamelen van alle onderdelen naar de onderkant van de buis. Plaats de buis in een thermocycler.
- PCR voor 30 cycli uitvoeren. Elke cyclus bestaat uit een denaturatie stap voor 30 bij 94 ° C, primer gloeien voor 30 s s op 58 ° C, en polymerase uitbreiding voor 45 s bij 72 ° C (Zie tabel 3).
| Stap | Temperatuur (° C) | Tijd | cyclus |
| Eerste denaturatie | 95 | 5 min | 1 |
| DNA denaturatie stap | 94 | 30 s | 30 cycli |
| Primer onthardende stap | 58 | 30 s | 30 cycli |
| Polymerase extensie stap | 72 | 45 s | 30 cycli |
| Post rek stap | 72 | 10 min | 1 |
| Einde van PCR fietsen | 4 | Onbepaalde tijd |
Tabel 3. Voorwaarden voor het sturen van PCR producten te fietsen.
- Het valideren van het PCR-product door het visualiseren van de Elektroforese van het gel:
- Bereiden een 1,2% agarose gel:
- 1.2 g agarose poeder mengen met 100 mL 0,5 x TBE in een maatkolf van microwavable. Magnetron gedurende 2 minuten totdat de agarose volledig is opgelost. Afkoelen van het agarose mengsel tot 55 ° C.
- Voeg 2 µL van een ethidium bromide oplossing (10 mg/mL) toe aan het mengsel agarose en meng voorzichtig. Giet het mengsel agarose in een lade gel ongeveer 5-7 mm, voeg dan de comb(s) op zijn plaats. Laat het stollen (minstens 30 min) en verwijder voorzichtig comb(s).
- Laden van monsters en het uitvoeren van een agarose gel:
- Gel en lade in de elektroforese cel plaatsen. De elektroforese cel vullen met 0,5 x TBE totdat de gel is gedekt.
- Zorgvuldig laden 2 µL van een 100 bp DNA ladder (Zie Tabel van materialen) in de één rijstrook van de gel als moleculaire grootte markering. Laden kleurstof/monster mengsel (5 µL van het PCR productmix met 1 µL 6 x laden kleurstof) in de extra rijstroken.
- Schakel de voeding. Stel de gel gedurende 25 minuten bij 100 V.
- Het verwijderen van de gel uit de elektroforese-cel. Visualiseren van de DNA-fragmenten onder UV-licht in een imaging systeem.
- Bereiden een 1,2% agarose gel:
5. DNA sequencing
- Zuiveren van PCR producten met behulp van een commerciële kit en volgnummer commercieel of met een automatische sequencer (Zie Tabel van materialen).
- Indienen nucleotidesequenties naar de NCBI BLAST server te vergelijken van de nucleotide-query naar de nucleotide databases10. Nadat de resultaten worden weergegeven, reeks aanpassingen uitvoeren en identificeren van de verwachte mutatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Agarose gelelektroforese van twee patiënten en een gezonde individuele geopenbaarde bands van de verwachte omvang, met inbegrip van een 454 bp PCR product voor exon 4 van de TTR-gen (Figuur 1).
Figuur 1 . De Elektroforese van het gel beeltenis van PCR versterkt TTR gene....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn twee belangrijke stappen in het protocol. Eerst, om voldoende aantal witte bloedcellen hebben een hemodiluted monster moet vermeden11. Ten tweede, het gebruik van passende PCR inleidingen is fundamenteel voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten12. We gebruikten het gereedschap van de web Primer-BLAST te ontwerpen de inleidingen4,13; een minimum van 40 basenparen aan weerskanten van de vier TTR exons mo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij willen Miss Shin-Fun Wu bedanken voor haar hulp bij de experimenten. Deze studie werd gesteund door een subsidie van de Chang Gung medische Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) en IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| EDTA-behandelde buizen | BD | ||
| DNA-extractiekit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrofotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA-polymerasekit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR-genintronische primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| elektroforesecel | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA-ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| kleurstof | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatische sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
Referenties
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
- Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
- Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178(2017).
- Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
- Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
- Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
- Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, suppl 4 16427-16432 (2002).
- Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 5-9 (2008).
- Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Buckingham, L., Flaws, M. L. Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , F.A. Davis Co. Philadelphia. (2012).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
- Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
- Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
- Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
- Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19(2014).
- Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
- Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
- Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
- Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948(2017).
- Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall'Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, suppl 1 58-60 (2012).
- Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
- Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
