Onderzoeken van de vertegenwoordigingen van de Object in de makaak dorsale Visual stroom met behulp van Single-eenheid opnames

Summary

Een gedetailleerd protocol om te analyseren object selectiviteit van parieto-frontale neuronen die betrokken zijn bij visuomotor transformaties wordt gepresenteerd.

Abstract

Eerdere studies hebben aangetoond dat neuronen in parieto-frontale gebieden van de hersenen makaak zeer selectief voor levensechte objecten, ongelijkheid gedefinieerde gebogen oppervlakken en beelden van reële objecten (met en zonder verschil), op een vergelijkbare manier als kunnen beschreven in de ventrale visuele stroom. Daarnaast worden parieto-frontale gebieden verondersteld te converteren van visuele objectinformatie in passende motor uitgangen, zoals de vooraf vormgeving van de hand tijdens het grijpen. Beter karakteriseren object selectiviteit in de corticale netwerk die betrokken zijn bij visuomotor transformaties, bieden wij een batterij van tests die bestemd zijn voor het analyseren van de visueel object selectiviteit van neuronen in parieto-frontale regio's.

Introduction

Menselijke en niet-menselijke primaten delen de capaciteit van het uitvoeren van complexe motorische acties waaronder object grijpen. Met succes uitvoeren van deze taken, moet onze hersenen de omvorming van intrinsieke objecteigenschappen in motor opdrachten uitvoeren. Deze transformatie is afhankelijk van een geavanceerde netwerk van dorsale corticale gebieden gelegen in pariëtale en ventrale premotor cortex^1,2,3 (Figuur 1).

Uit de studies van de laesie bij apen en mensen^4,5weten we dat de dorsale visuele stream - van oorsprong uit primaire visuele cortex en gericht op posterieure pariëtale cortex - is betrokken bij zowel ruimtelijke visie en de planning van de motor acties. Het merendeel van de dorsale stream gebieden zijn echter niet gewijd aan een uniek type van verwerking. Bijvoorbeeld, bevat het voorste intraparietal gebied (AIP), één van de eind fase gebieden in de dorsale visuele stroom, een verscheidenheid van neuronen die niet alleen tijdens het grijpen van^6,7,8, maar ook tijdens het visuele brand inspectie van het object^7,8,9,10.

Gelijkaardig aan AIP, neuronen in gebied F5, gelegen in de ventrale premotor cortex (PMv), reageren ook tijdens visuele fixatie en object grijpen, die dreigt als belangrijk voor de transformatie van visuele informatie in motor acties¹¹. Het voorste gedeelte van dit gebied (subsector F5a) bevat neuronen selectief reageren op driedimensionale (3D, ongelijkheid gedefinieerde) beelden^12,13, terwijl de subsector gelegen in de convexiteit (F5c) neuronen bevat gekenmerkt door spiegel eigenschappen^1,3, afvuren, zowel wanneer een dier voert of merkt op een actie. Ten slotte, de achterste F5-regio (F5p) is een hand-gerelateerde veld, met een groot aantal visuomotor neuronen reageren op zowel observatie en het grijpen van 3D-objecten^14,15. Naast F5, gebied 45B, gelegen in de inferieure ramus van de Fasciculus Sulcus (hersenanatomie), kan ook worden betrokken bij zowel vorm verwerking^16,17 en grijpen¹⁸.

Testen van object selectiviteit in de pariëtale en frontale cortex is uitdagend, want het is moeilijk om te bepalen welke functies deze neuronen reageren op en wat de Receptieve velden van deze neuronen. Bijvoorbeeld, als een neuron op een plaat maar niet op een kegel reageert, welke functie van deze objecten is het besturen van deze selectiviteit: de 2D contour, de 3D-structuur, de oriëntatie in de diepte, of een combinatie van veel verschillende functies? Om te bepalen van de kritische object voorzieningen voor neuronen die reageren tijdens object fixatie en grijpen, is het noodzakelijk om verschillende visuele testen met behulp van beelden van objecten en lagere versies van dezelfde afbeeldingen in dienst.

Een aanzienlijk deel van de neuronen in de AIP en F5 niet alleen reageert op de visuele presentatie van een object, maar ook wanneer het dier dit object in het donker (dat wil zeggen, in het ontbreken van visuele informatie grijpt). Dergelijke neuronen reageert niet op een afbeelding van een object dat niet kan worden begrepen. Vandaar, visuele en motorische onderdelen van de reactie zijn nauw verbonden, waardoor het moeilijk te onderzoeken van de vertegenwoordiging van de neuronale object in deze regio's. Aangezien visuomotor neuronen kunnen alleen worden getest met objecten van de echte wereld, moeten we een flexibel systeem voor de presentatie van verschillende objecten op verschillende posities in het gezichtsveld en verschillende oriëntaties, als we willen bepalen welke functies zijn belangrijk voor deze neuronen. De laatste kan alleen worden bereikt door middel van een robot staat voor het presenteren van de verschillende objecten op verschillende locaties in de visuele ruimte.

Dit artikel is van plan om een experimentele gids voor onderzoekers ook geïnteresseerd in de studie van parieto-frontale neuronen. In de volgende secties bieden wij de algemene protocol dat wordt gebruikt in ons laboratorium voor de analyse van grijpen en visueel object reacties bij wakker makaak apen (Macaca mulatta).

Protocol

Alle technische procedures werden uitgevoerd volgens de National Institute of Health Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en de EU-richtlijn 2010/63/EU en goedgekeurd door de ethische commissie van de KU Leuven.

1. algemene methoden voor extracellulaire opnamen in wakker gedragen Monkeys

1. Het trainen van de dieren uit te voeren van de visuele en motorische taken vereist inspelen op uw specifieke onderzoeksvraag. Zorg ervoor dat het dier kunnen flexibel schakelen tussen taken tijdens dezelfde opnamesessie om het neuron uitgebreid testen en het verkrijgen van een beter begrip van de functies voor het besturen van de neurale reactie (Figuur 2-3).
   1. Trainen van het dier in de Visually-Guided grijpen (VGG; grijpen 'in het licht') te beoordelen van de visuomotor componenten van het antwoord. Opmerking: onafhankelijk van de gekozen taak geleidelijk beperken vochtinname ten minste drie dagen vóór het begin van de fase van de opleiding.
      1. Beperken de monkey's hoofd voor de gehele duur van de experimentele sessie.
      2. Houd de hand contralaterale aan de kamer van de opname op de rustende positie in de eerste sessies, en helpen het dier te bereiken en begrijpen van het object, waardoor handmatige beloning na elke poging.
      3. Plaats terug de monkey's hand op de rustende positie aan het einde van elk afzonderlijk experiment.
      4. Elke paar proeven, laat de hand van de aap, en wacht een paar seconden om te observeren als het dier het verkeer spontaan initieert.
      5. Handmatige beloning van toepassing wanneer de aap naar het object bereikt.
      6. Wanneer de bereiken fase correct wordt verworven, helpen het dier te heffen (of trekken) het object en de beloning handmatig.
      7. Zoals in 1.1.1.4 en 1.1.1.5, laat de monkey's hand en wacht een paar seconden om te observeren als het dier het verkeer spontaan initieert. Beloning geven wanneer de beweging goed wordt uitgevoerd.
      8. Corrigeer het bereiken, met de hand positie en de stand van de pols zoveel keer als nodig tijdens de procedure.
      9. Herhaal de bovenstaande stappen totdat het dier de handelingen automatisch voert.
      10. Laden van de automatische taken. Het dier krijgt automatisch beloond toen hij de bewegingen van reach en greep voor een vooraf bepaalde tijd presteert.
      11. Verhoog geleidelijk de tijd houden van het object.
      12. Het introduceren van de laser die de projecten van het punt van de fixatie op de basis van het object. Voeg vervolgens de tracker oog om te controleren de ooghoogte rond het object-te-worden-begrepen.
   2. Train het dier in Memory-Guided grijpen (MGG) te onderzoeken van de motor component van de reactie, niet beïnvloed door de visuele component van de stimulus.
      1. Beperken de monkey's hoofd.
      2. Volg dezelfde stappen beschreven voor het VGG ervoor te zorgen dat het dier fixatie op de laser tijdens de taak binnen een elektronisch gedefinieerde venster onderhoudt. Voor deze versie van de taak uitgaat het lampje aan het einde van de periode van de fixatie.
   3. Train de aap in passieve fixatie visuele responsiviteit en de selectiviteit van de vorm aan te pakken.
      1. Beperken de monkey's hoofd.
      2. De visuele stimuli voorleggen in de aap met een CRT (passieve fixatie van 3D stimuli) of een LCD-monitor (passieve fixatie van 2D stimuli).
      3. Presenteren een fixatie plek in het midden van het scherm, bovenop de visuele stimuli.
      4. Belonen van het dier na elke presentatie van de stimulus en verhoog geleidelijk de fixatie periode tot het bereiken van de normen van de taak.
2. Chirurgie, met behulp van steriele hulpmiddelen, gordijnen en toga's uitvoeren.
   1. Anesthetize van het dier met ketamine (15 mg/kg, intramuscularly) en medetomidine waterstofchloride (0,01-0,04 mL/kg intramuscularly) en bevestig de narcose regelmatig door het controleren van het dier reactie op prikkels, hartslag, ademhalingsfrequentie en bloed druk.
   2. Handhaven van algemene anesthesie (propofol 10 mg/kg/h intraveneus) en beheren van zuurstof met een tracheale buis. Gebruik maken van een lanolim gebaseerde zalf om te voorkomen dat oog droogheid terwijl onder verdoving.
   3. Analgesia met behulp van 0,5 bieden cc van buprenorfine (0,3 mg/ml intraveneus). In geval van verhoging van de hartslag tijdens de operatie, kan een extra dosering worden toegediend.
   4. Implantaat een MRI-compatibele hoofd post met keramische schroeven en tandheelkundige acryl. Het uitvoeren van alle overleving operaties onder strikte aseptische condities. Gebruik voor een adequaat onderhoud van het steriel veld, Steriele wegwerphandschoenen, maskers en steriele instrumenten.
   5. Geleid door de anatomische magnetische resonantie beeldvorming (MRI; Horsley-Clark coördinaten), maken een craniotomy boven het interessegebied en de kamer van de opname op de monkey's schedel implantaat. Gebruik een standaard opname kamer voor één eenheid extracellulaire opnames of een multielectrode microdrive, voor het gelijktijdig opnemen van meerdere neuronen.
   6. Na de operatie, staken de intraveneuze toediening van propofol tot spontane ademhaling hervat. Laat het dier onbeheerd achter totdat het bewustzijn heeft herwonnen niet en voeren het dier in de sociale groep slechts na volledig herstel.
   7. Voorzien van post-operatieve Analgesie, zoals aanbevolen door de institutionele dierenarts; Gebruik bijvoorbeeld Meloxicam (5mg/ml intramuscularly).
   8. 6 weken na de operatie voordat het experiment te wachten. Hierdoor is een betere verankering van de hoofd post aan de schedel en de garanties die het dier heeft volledig hersteld van de interventie.
3. Lokaliseren van het gebied van de opname met behulp van MRI (voor één eenheid extracellulaire opnamen) en computertomografie (CT; voor multielectrode opnamen).
   1. Glazen capillairen te vullen met een 2%-oplossing van kopersulfaat en voegt u deze in een raster van de opname.
   2. Uitvoeren van structurele MRI (slice dikte: 0.6 mm).
4. Controle van de neurale activiteit.
   1. Wolfraam microelectrodes gebruiken met een impedantie van 0,8-1 MΩ.
   2. Plaats de elektrode door middel van de dura met behulp van een 23G RVS gids tube en een hydraulische microdrive.
   3. Voor spike discriminatie, versterken en filteren van de neurale activiteit tussen 300 en 5.000 Hz.
   4. Voor lokale potentiële (LFP) veldopnames, versterken en filteren van het signaal tussen 1 en 170 Hz.
5. Monitor het signaal van het oog
   1. Het aanpassen van een infrarood camera voor de ogen van het dier om een adequaat beeld van de leerling en het hoornvlies reflex te krijgen.
   2. Een infrarood-gebaseerd camera gebruiken om te proeven van de positie van de leerling bij 500 Hz.

2. onderzoek naar Object selectiviteit in de dorsale gebieden

1. Uitvoeren van visueel-geleide grijpen (VGG).
   1. Kies de juiste grijpen setup afhankelijk van het doel van het onderzoek: carrousel setup of robot setup (Figuur 3).
   2. Voor de carrousel setup, voert u de taak VGG:
      1. Laat de aap plaats de hand contralaterale de opgenomen halfrond in de rust positie in volledige duisternis te leiden van de reeks.
      2. Na een variabele tijd (intertrial interval: 2.000-3.000 ms), een rode laser (fixatie punt) van toepassing op de basis van het object (afstand: 28 cm vanaf de apen ogen). Als het dier haar blik binnen het venster van een elektronisch gedefinieerde fixatie (+/-2,5 °) voor 500 ms onderhoudt, verlicht is het object van boven met een lichtbron.
      3. Nadat een variabele vertraging (300-1500 ms), program een dimmen van de laser (visuele cue van de GO) instrueren de aap op te heffen van de hand van de positie van de rust, en bereik, begrijpen en het object te houden voor een variabele interval (houden tijd: 300-900 ms).
      4. Wanneer het dier voert de hele reeks juist, het belonen met een druppel sap.
   3. Gebruik een vergelijkbare taak-reeks voor de setup van de robot.
      1. Wat de carrousel setup, zou de aap plaats de hand contralaterale de opgenomen halfrond in de rust positie in volledige duisternis te leiden van de reeks.
      2. Na een variabele tijd (intertrial interval: 2.000-3.000 ms), verlichting van de LED (fixatie punt) op het object (van binnenuit; afstand: 28 cm vanaf de apen ogen). Nogmaals, als het dier haar blik binnen het venster van een elektronisch gedefinieerde fixatie (+/-2,5 °) voor 500 ms onderhoudt, verlichten het object vanuit met een witte lichtbron.
      3. Nadat een variabele vertraging (300-1500 ms), schakel de LED (visuele cue van de GO), instrueren de aap op te heffen van de hand van de positie van de rust, en reach, begrijpen en het object te houden voor een variabele interval (houden tijd: 300-900 ms).
      4. Wanneer het dier voert de hele reeks juist, het belonen met een druppel sap.
   4. Tijdens de taak, de prestaties van de aap, met bijzondere aandacht voor de timing te kwantificeren. Maatregel zowel de tijd die is verstreken tussen de go-signaal en het begin van de beweging van de hand (reactietijd), en tussen het begin van de beweging en de lift van het object (grijpen tijd).
2. Uitvoeren van geheugen-geleide grijpen (MGG; 'Grijpen in het donker'). De taak van het MGG gebruiken om te bepalen als neuronen visuomotor of motor-dominant zijn.
   Opmerking: De volgorde is vergelijkbaar met die voor de VGG beschreven, maar het object is begrepen in totale duisternis.
   1. Identiek aan de VGG taak, laat de aap plaats de hand contralaterale de opgenomen halfrond in de rust positie in volledige duisternis te leiden van de reeks.
   2. Na een variabele tijd (intertrial interval: 2.000-3.000 ms), een rode laser/LED (fixatie punt) om aan te geven van het punt van de fixatie van toepassing (aan de voet van het object voor de carrousel-installatie, in het midden van het object voor de robot setup; afstand: 28 cm vanaf de apen ogen) . Als het dier haar blik binnen het venster van een elektronisch gedefinieerde fixatie (+/-2,5 °) voor 500 ms onderhoudt, verlichting van het object.
   3. Na een vaste tijd (400 ms), door uit het licht te schakelen.
   4. Na een onderbreking van de variabele periode (300-1500 ms) na licht gecompenseerd, dimmen/schakelen de fixatie punt (CUE gaan) te instrueren de aap tot opheffing van de hand en reach, greep, en houden van het object (houden tijd: 300-900 ms).
   5. Wanneer het dier voert de hele reeks juist, geven een druppel sap als een beloning.
3. Uitvoeren van passieve fixatie. Wat betreft de taak van VGG, kies de meest geschikte Setup te starten (carrousel of robot setup) afhankelijk van het doel van het onderzoek.
   Opmerking: Twee verschillende passieve fixatie taken kunnen worden uitgevoerd: passieve fixatie van reële objecten (met behulp van de objecten-te-worden-begrepen in de carrousel en robot opstellingen) en passieve fixatie van 3D/2D beelden van objecten.
   1. Uitvoeren van passieve fixatie van reële objecten.
      1. Presenteren de fixatie punt (rode laser voor de installatie van de carrousel geprojecteerd op de basis van het object en de rode LED in de robot-setup).
      2. Als het dier haar blik binnen het venster van een elektronisch gedefinieerde fixatie (+/-2,5 °) voor 500 ms onderhoudt, verlichten het object voor 2.000 ms.
      3. Als het dier haar blik in het venster voor 1000 ms onderhoudt, kunt u het belonen met een druppel sap.
   2. Uitvoeren van passieve fixatie van 3D/2D beelden van objecten.
      1. Presenteren van alle visuele stimuli op een zwarte achtergrond (luminantie 8 cd/m²) met behulp van een monitor (resolutie van 1280 × 1024 pixels) uitgerust met een snel-verval P46-fosfor en geëxploiteerd op 120 Hz (bekijken afstand: 86 cm).
      2. In de 3D-tests, presenteren de prikkels stereoscopically door afwisselend de linker en rechter oog beelden op een scherm (CRT-monitor), in combinatie met twee ferroelektrische vloeibare kristallen luiken. Zoek deze luiken voor de monkey's ogen, werken bij 60 Hz en synchroniseren met de verticale retrace van de monitor.
      3. Begin het proces door het presenteren van een klein plein in het midden van het scherm (fixatie punt; 0.2 ° × 0.2 °). Als de positie van de ogen binnen een elektronisch gedefinieerde 1° vierkante venster (veel kleiner dan voor levensechte objecten) voor ten minste 500 ms blijft, presenteren de visuele stimuli op het scherm, voor een totale tijd van 500 ms.
      4. Wanneer de aap een stabiele fixatie tot de verschuiving van de prikkel onderhoudt, het belonen met een druppel sap.
      5. Voor een passende studie van vorm selectiviteit, door een uitgebreide batterij van tests met 2D-afbeeldingen tijdens passieve fixatie taak, in de volgende volgorde te uitvoeren.
      6. Voer een zoekopdracht test. Testen van de visuele selectiviteit van de cel met behulp van een brede reeks van beelden (oppervlakte beelden; Figuur 4A), met inbegrip van de foto's van het object dat is begrepen in de VGG. Vergelijk voor dit en alle latere visuele taken, het beeld oproept van de sterkste reactie (zogenaamde 'preferent spiegelbeeld') naar een tweede afbeelding waarnaar het neuron zwak reageert (genoemd ' nonpreferred image'). Als het neuron bestudeerde ook op de beelden van objecten reageert, zoekt u naar specifieke stimulus onderdelen rijden de responsiviteit van de cel (Contour test, receptieve veld test en vermindering van de test).
      7. Voer een Contour-test. Van de oorspronkelijke oppervlakte beelden van echte objecten (2D of 3D afbeeldingen met textuur, arcering en perspectief), verkrijgen geleidelijk vereenvoudigde versies van dezelfde stimulus shape (silhouetten en contouren; Figuur 4B). Het verzamelen van ten minste 10 proeven per voorwaarde om te bepalen of het neuron geeft de voorkeur aan de oorspronkelijke oppervlakte, het silhouet of het overzicht uit de oorspronkelijke shape.
      8. Voer een receptieve veld (RF) test. Om de kaart van de RF van een neuron, presenteren de beelden van de objecten op verschillende posities op een display (in dit experiment, 35 posities; stimulans grootte van 3°), die betrekking hebben op het centrale gezichtsveld^19,20. Het verzamelen van voldoende herhalingen van de stimulans op alle mogelijke posities in een redelijke termijn, verminderen de duur van de prikkel (geflitste stimuli; duur van de prikkel: 300 ms, intertrial interval: 300 ms).
      9. Voer een vermindering van de test. Voer de test van een vermindering met contour fragmenten gepresenteerd in het midden van de RF te identificeren van de Minimum effectieve Shape functie (MESF). De verzameling van stimuli in Photoshop genereren door het bijsnijden van de omtrek van elk van de oorspronkelijke contour shapes langs de belangrijkste assen (figuur 3B). Het ontwerp van de MESF als het kleinste fragment dat vorm om een antwoord dat ten minste 70% van de reactie van intact overzicht en niet aanzienlijk kleiner dan dat antwoord⁸.
      10. Voor een betere schatting van de afhankelijkheid van de positie (het effect van stimulus standpunt over fragment selectiviteit), moet u twee verschillende tests uitvoeren. Voer een vermindering van de Test met de fragmenten die zich bevindt op de positie ingenomen in de oorspronkelijke vorm van de omtrek. Voer een vermindering van de Test met de fragmenten op het massamiddelpunt van de vorm.
      11. Voer een nieuwe RF-toewijzing met behulp van de MESF in dit stadium.

Results

Figuur 5 percelen de reacties van een voorbeeld neuron opgenomen uit gebied F5p met vier objecten getest: twee verschillende vormen - een bol en een plaat-weergegeven in twee verschillende maten (6 en 3 cm). Deze bijzondere neuron reageerde niet alleen op de grote bol (optimale stimulans; bovenste linker paneel), maar ook aan de grote plaat (lagere linker paneel). Ter vergelijking, was het antwoord op de kleinere objecten zwakker (bovenste en onderste rechts ...

Discussion

Een totaalbenadering van de studie van de dorsale stream vereist een zorgvuldige selectie van gedrags taken en visuele tests: visuele en grijpen paradigma's gecombineerd of afzonderlijk afhankelijk van de specifieke eigenschappen van de regio kunnen worden ingezet.

In dit artikel geven we de voorbeelden van de neurale activiteit opgenomen in zowel de F5p als de AIP in reactie op een subset van visuele en motorische taken, maar zeer soortgelijke reacties kunnen worden waargenomen in andere fron...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grasping robot	GIBAS Universal Robots	UR-6-85-5-A	Robotarm uitgerust met een grijper
Carrouselmotor	Siboni	RD066/†20 MV6, 35x23 F02	Motor die wordt geïmplementeerd in een op maat gemaakte verticale carrousel. Het maakt de rotatie van de carrousel mogelijk.
Oogtracker	SR Research	EyeLink II	Infrarood camerasysteem dat sampleert op 500 Hz
Filter	Wavetek Rockland	852	Elektronische filters voeren een verscheidenheid aan signaalverwerkingsfuncties uit met als doel de ongewenste frequentiecomponenten van een signaal te verwijderen.
Voorversterker	BAK ELECTRONICS, INC.	A-1	Het Model A-1 maakt het mogelijk om de invoercapaciteit en ruisopname te verminderen en maakt het mogelijk om de impedantie voor metalen micro-elektroden te testen
Elektroden	FHC	UEWLEESE*N4G	Metalen micro-elektroden (* = Impedantie, te kiezen door de onderzoeker)
CRT-monitor	Vision Research Graphics	M21L-67S01	De CRT-monitor is uitgerust met een snel afnemende P46-fosfor die werkt op 120 Hz
Ferroëlektrische vloeibare kristalshutters	Display Tech	FLC Shutter Panel; LV2500P-OEM	De shutters werken op 60 Hz voor de apen en zijn gesynchroniseerd met de verticale terugloop van de monitor