Methodenartikel

Analyse van intrinsieke wanorde van de AtHIRD11 en bindende naar metaalionen door capillaire gelelektroforese en affiniteit capillaire elektroforese

5.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57749

⸱

22 augustus 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol combineert de karakterisering van een eiwitsteekproef door capillaire gelelektroforese en een snel-bindende screening voor geladen liganden door affiniteit capillaire elektroforese. Het wordt aanbevolen voor eiwitten met een flexibele structuur, zoals intrinsiek ongeordende eiwitten, om te bepalen van eventuele verschillen in bindende voor verschillende conformeren.

Samenvatting

Planten zijn sterk afhankelijk van hun omgeving. Om aan te passen aan stressvolle veranderingen (bijvoorbeeld, droogte en hoge zoutgehalte), evolueren hogere planten klassen van intrinsiek ongeordende eiwitten (ontheemden) oxidatieve en osmotische stress te verminderen. Dit artikel maakt gebruik van een combinatie van capillaire gelelektroforese (CGE) en affiniteit elektroforese (ACE) van de verschuiving van de mobiliteit om te beschrijven het bindingsgedrag van verschillende conformeren van de IDP-AtHIRD11 van Arabidopsis thaliana. CGE is gebruikt om te bevestigen de zuiverheid van AtHIRD11 en tot uitsluiting van fragmenten, posttranslationele modificaties, en andere verontreinigingen als redenen voor complexe piek patronen. In dit deel van het experiment, zijn de verschillende monster onderdelen gescheiden door een viskeuze gel binnen een capillair door hun verschillende massa's en met een diode array detector gedetecteerd. Daarna wordt het bindingsgedrag van het monster naar verschillende metaalionen onderzocht door ACE. In dit geval de ligand is toegevoegd aan de bufferoplossing en de verschuiving in de migratietijd wordt gemeten om te bepalen of een bindende gebeurtenis heeft plaatsgevonden of niet. Een van de voordelen van het gebruik van de combinatie van CGE en aas om te bepalen van het bindingsgedrag van een IDP is de mogelijkheid om de Elektroforese van het gel en de bindende bepaling te automatiseren. Bovendien CGE toont een ondergrens voor detectie dan de klassieke gelelektroforese en ACE vermag bepalen de wijze van bindende een ligand in een snelle manier. ACE kan daarnaast ook worden toegepast op andere geladen soorten dan metaalionen. Het gebruik van deze methode voor het binden van experimenten wordt echter beperkt in zijn vermogen om te bepalen van het aantal bandplaatsen. De combinatie van CGE en ACE kan echter worden aangepast voor het karakteriseren van het bindingsgedrag van een eiwitsteekproef naar talrijke geladen liganden.

Inleiding

Planten zijn meer afhankelijk van hun omgeving dan vele andere levensvormen. Aangezien planten niet naar andere plaatsen verplaatsen, moeten ze zich aanpassen aan veranderingen in hun omgeving (bijvoorbeelddroogte, koude en hoge zout concentraties). Daarom ontwikkelde hogere planten gespecialiseerde stress eiwitten zoals dehydrins, die vele taken vervullen ter vermindering van de spanning van de cel aan hoge zoutgehalte gerelateerde. Deze proteïnen binden van water en ionen binnen cellen, vermindering van oxidatieve stress door bindende Cu2 +-ionen, en interactie met fosfolipiden, evenals de cytoskeletons. Bovendien bindend Zn2 +-ionen kan deze eiwitten als transcriptiefactoren op te treden. Hun vermogen om te binden Ca2 +-ionen nadat fosforylatie ook is gemeld1.

De multifunctionele werking van deze proteïnen is gerelateerd aan het ontbreken van hydrofobe aminozuurresidu's. Zij missen dus een hydrofobe interacties binnen de keten van peptide en ook een beperkte structuur. Echter, omdat deze proteïnen een restrictieve structuur ontbreekt, zij verschillende conformeren onder dezelfde voorwaarden kunnen innemen. Dus kunnen ze beschreven worden best als een ensemble van structuren in plaats van een enkele bevleesdheid. Eiwitten met deze eigenschappen staan bekend als intrinsiek eiwitten (ontheemden ontregelde) en een veelgebruikt concept voor stress-eiwitten en overspraak tussen verschillende trajecten in eukaryote cellen2 zijn.

Een van deze stressgerelateerde ontheemden is AtHIRD11. Het is een van Arabidopsis thalianade meeste zeer droogte-uitgedrukt ontheemden. Vandaar, de verschillende conformeren kunnen worden gescheiden door hun effectieve straal te rekenen verhouding en capillaire elektroforese (CE) is gebruikt voor verder onderzoek. Vorige ACE experimenten aangetoond dat de interactie tussen AtHIRD11 en overgangsmetalen ionen zoals Cu2 +-, Zn2 +- Co2 +en Ni2 +-ionen. De gedetailleerde resultaten kunnen worden gevonden in Hara et al. 3 en Nachbar et al. 4.

De ACE-methode die hier wordt gebruikt is gebaseerd op onze eerder gepubliceerde werken6. De toevoeging van het EOF marker acetanilide aan de eiwitSteekproef is echter niet geschikt. AtHIRD11 toont brede piek patronen, en de EOF-markering toe te voegen aan het monster twee pieken zou verhullen. De markering wordt daarom gebruikt in een aparte run. Voordat het bindingsgedrag wordt onderzocht, wordt bevestigd dat de pieken gevonden tijdens eerdere experimenten van verschillende conformeren zijn. Dus, CGE is gebruikt om te onderscheiden tussen de eiwit conformeren, de posttranslationele gemodificeerde eiwitten en onzuiverheden, zoals fragmenten van AtHIRD11, door hun verschillende massa's. Daarna wordt het gekenmerkt AtHIRD11 monster bindingsgedrag naar diverse verschillende metaalionen onderzocht.

Het doel van dit artikel is voor het beschrijven van een experimentele opstelling onderscheid maken tussen een IDP en andere componenten van een monster teneinde de verschillen in het bindingsgedrag van verschillende conformeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. bereiding van de capillaire elektroforese instrumenten

  1. Voorbereiden van de haarvaten
    1. Gebruik een glassnijder te snijden een bare-gesmolten siliciumdioxide capillair met een externe coating van polyimide en een inwendige diameter van 50 µm tot 33 cm (voor de CGE experiment) en 30 cm (voor de ACE-experiment) lange haarvaten. Voer het stekje op een glazen plaat.
      Opmerking: De 2 verschillende experimentele opstellingen werden ontwikkeld voor 2 verschillende instrumenten. Om ze te gebruiken op andere instrumenten, een juiste methode transfer moet worden uitgevoerd en de capillaire lengte moet worden aangepast aan de toegestane lengte van het instrument.
    2. Gebruik een pen om te markeren van het midden van het venster van een 1 cm brede detectie op een afstand van 24,5 cm vanaf een uiteinde van het capillair voor het experiment CGE en 21.5 cm van het ene eind van het capillair voor de ACE experiment (effectieve lengte).
    3. Verwijder de externe coating van polyimide uit de haarvaten door branden het af met een steekvlam, 0.5 cm voor en na het merk. Ook gebruiken de steekvlam verwijderen 1 cm van de coating aan beide uiteinden van de haarvaten.
      Opmerking: De effectieve lengte kan enigszins variëren omdat het berust op het instrument van de capillaire elektroforese gebruikt.
    4. Reinig de uiteinden van de haarvaten en de ramen van de detectie met ethanol en een zacht weefsel.
      Opmerking: De ongecoate haarvaten zijn minder flexibel en waarschijnlijk te breken.
  2. Installeren van de haarvaten
    1. Installeer een capillair in het CE-systeem met het detectie-venster in de buurt van de uitlaat.
      Opmerking: De verschillende CE instrument modellen hebben verschillende bedrijf systemen voor de haarvaten. Raadpleeg de handleiding van het gebruikte instrument voor de precieze instructies.

2. het bereiden van de oplossingen

  1. Bereiden van de oplossingen voor de analyse van CGE
    1. Voorbereiden van de tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)-SDS buffer (100 mM/1% w/v) op pH 8,0.
      1. Gebruik een respiratoire masker en een stand voor het wegen van 1.00 g natrium dodecyl sulfaat (SDS) in een bekerglas van 100 mL.
      2. Voeg 1,21 g van Tris in het bekerglas van 100 mL en los met behulp van 50 mL gedeïoniseerd water en een magnetische roer bar op een magneetroerder.
      3. Zet een pH-elektrode in de oplossing en breng de pH op 8.0 met behulp van 1,0 M HCl.
      4. Vul de oplossing in een maatkolf van 100 mL en Voeg gedeïoniseerd water aan tot de streep. Schud het voorzichtig en voorkom de vorming van een schuim.
    2. Bereid de 0,1 M NaOH oplossing.
      1. Weeg 4.0 g van NaOH in een 100 mL maatkolf. Vullen tot de maatstreep met gedeïoniseerd water om een voorraad van 1 M.
      2. Gebruik een pipet 10 mL lamp Pipetteer 10 mL van deze oplossing in een maatkolf van 100 mL en vul het met gedeïoniseerd water aan tot de streep.
    3. Bereid de 0,1 M HCl oplossing.
      1. 10 mL 10 M HCl gestoken in een maatkolf van 100 mL met behulp van een volumetrische pipet 10 mL en vul het met gedeïoniseerd water aan tot de streep. Herhaal deze stap om het verkrijgen van de 0,1 M HCl.
    4. Stellen van de monsteroplossing.
      1. Weeg 0.5 mg van het eiwit in een 1 mL-buis. Voeg 0,5 mL van de Tris-SDS gel-buffer uit stap 2.1.1 met een micropipet.
      2. Los het eiwit door zachtjes schudden om te voorkomen dat eventuele schuim vorming en afbraak van het eiwit.
        Opmerking: Gebruik met ultrasone trillingen, indien het eiwit niet kan worden opgelost, zoals wordt beschreven; Vermijd elke verwarming van de oplossing.
    5. Vul de oplossingen in de flesjes.
      1. Filteren van elke oplossing door een 0,22 µm Polyvinylideenfluoride (PVDF) filteren met behulp van een adequate injectiespuit rechtstreeks in de flacon.
        Opmerking: Voor de gel-bevattende oplossingen, de tegendruk kan hoog zijn als gevolg van de hoge viscositeit.
      2. Bereiden van 15 flesjes in totaal en Markeer elke webserver zodanig dat elke verwisselingen te voorkomen.
        1. 3 flesjes te vullen met een commercieel beschikbare natrium dodecyl sulfaat (SDS) gel buffer bij pH 8.
          Opmerking: Het gebruik van een commercieel beschikbare SDS gel-buffer biedt nauwkeurigere resultaten.
        2. Vul 1 flacon met 0,1 M NaOH en 1 flacon met 0,1 M HCl voor het spoelen.
        3. Vul 1 flacon met de oplossing van het monster.
        4. 5 flesjes vullen met gedeïoniseerd water en 4 flesjes met 0,1 mL gedeïoniseerd water (dompelen flesjes).
          Opmerking: De dompelen flesjes dienen als afval flesjes tijdens het afboeken van het capillair vóór elke run. De capillaire uiteinden worden ondergedompeld in water te spoel af geen gel-residuen.
  2. Bereiden van de oplossingen voor de ACE-analyse
    1. Bereid de 1 M NaOH oplossing.
      1. Weeg 4.0 g van NaOH in een 100 mL maatkolf.
      2. Vullen tot de maatstreep met gedeïoniseerd water om een voorraad van 1 M.
    2. De 0,1 M ethylendiaminetetraacetic azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in een 0,1 M NaOH-oplossing te bereiden.
      1. Pipetteer 10 mL van 0,1 M NaOH in een maatkolf van 100 mL met behulp van een precisiepipet 10 mL lamp. Vullen tot de maatstreep met gedeïoniseerd water.
      2. Weeg 2.42 g van EDTA op een gewicht boot en los van de vaste stof in de 100 mL 0,1 M NaOH.
    3. Bereiden de Tris-bufferoplossing (30 mM).
      1. Voeg 3.63 g van Tris, 200 mL gedeïoniseerd water en een roer-bar in een bekerglas van 500 mL. Plaats het bekerglas op een bord roer en schakel het.
      2. Zet een pH meter elektrode in het bekerglas en breng de pH op 7.4 met 0,1 M HCl.
      3. Vul de oplossing in een maatkolf van 1 L en vul tot de maatstreep met gedeïoniseerd water.
        Opmerking: Deze procedure moet worden herhaald of een grotere maatkolf sinds meer dan 1 L nodig is voor de hele analyse nodig is.
    4. Bereiden de acetanilide electroosmotic stroom (EOF)-marker (60 µM) oplossing.
      1. Voeg 6 mg acetanilide en 100 mL Tris buffer in een maatkolf van 100 mL.
      2. Zet de maatkolf in een ultrasoonbad en zet het gedurende 30 minuten.
    5. Stellen van de monsteroplossing (1 mg/mL).
      1. Zet een tube van 0,5 mL microcentrifuge op een precisie-evenwicht en Voeg 0.3 mg van gevriesdroogd poeder van de AtHIRD11 in de buis.
      2. Gebruik een micropipet om te voegen 0.3 mL van een 30 mM Tris buffer (pH 7.4) in de buis. Schud de buis zorgvuldig te ontbinden van het eiwit.
    6. Bereiden de ligand-oplossingen.
      1. Voorbereiden van de stockoplossing van CaCl2 (5 mM).
        1. Neem een wegende boot, zet het op een analytische balans en weeg 36.76 mg CaCl2* H2O.
        2. Met behulp van een micropipet, spoel de CaCl2* H2O van het gewicht van de boot in een maatkolf van 50 mL met de eerder bereid Tris-buffer.
        3. Vul de maatkolf met de Tris buffer aan tot de streep.
      2. Voorbereiding van de resterende voorraadoplossingen (5 mM).
        1. Herhaal stap 2.2.6.1 met behulp van de andere metalen zouten in plaats van CaCl2* H2O [MgCl2: 23.80 mg, BaCl2: 26.02 mg, Sr (3)-2: 52.91 mg, MnCl2: 31.46 mg, SeCl4: 52.91 mg, CoCl 2* 2 H2O: 41.47 mg, CuCl2* 2 H2O: 42.62 mg, ZnCl2: 3.41 mg en NiCl2* 6 H2O: 59.43 mg].
          Opmerking: De ZnCl2 oplossing heeft een concentratie van 0,5 mM. Aangezien de sterke wisselwerking tussen de ionen en de binnenwand van de capillaire werden waargenomen, de concentratie werd teruggebracht met een factor 104.
      3. Bereid de 500 µM CaCl2 oplossing.
        1. 10 mL van de stockoplossing van de2 CaCl vullen en zet het in een maatkolf van 100 mL.
        2. Vul de maatkolf met een buffer van Tris tot de maatstreep en schud de kolf.
      4. Bereid de 250 µM CaCl2 oplossing.
        1. Vullen van 5 mL van de stockoplossing van de2 CaCl en zet het in een maatkolf van 100 mL.
        2. Vul de maatkolf met een buffer van Tris tot de maatstreep en schud de kolf.
      5. Herhaal stap 2.2.6.3 en 2.2.6.4 voor de andere voorraadoplossingen.
    7. De oplossingen in de flesjes te vullen.
      Opmerking: Elke herhaalde run moet een aantal inlaat en uitlaat flesjes. Het gebruik van verse ligand oplossingen op de inlaat en uitlaat vermindert de verschuivingen in migratietijd na elke run.
      1. Vul de 250 µM CaCl2 oplossing in een 10 mL spuit.
      2. Zet een 0,22 µm PVDF filter op de spuit en de push 2 mL van de oplossing door de filter door middel van de spuit om te negeren deze gefilterde oplossing.
      3. Vul 10 flesjes tot de maximaal toegestane volume met de resterende 250 µM CaCl2 oplossing van de spuit. Mark elk als 250 µM CaCl 2 oplossing inlaat flacon.
      4. 10 flesjes te vullen totdat ze half gevuld met de 250 µM CaCl2 oplossing. Mark elk als 250 µM CaCl 2 oplossing outlet flacon.
      5. Herhaal stap 2.2.7.1 - 2.2.7.4 voor de andere metalen zout-bevattende oplossingen.
      6. Herhaal de stappen voor elk paar van inlaat en uitlaat flesjes in plaats daarvan gebruik van de 30 mM Tris-bufferoplossing (pH 7.4).
        Opmerking: De 30 mmol/L Tris buffer pH 7.4 wordt gebruikt tussen de pistes migratie tijd om gegevens te verkrijgen voor de proteïne in afwezigheid van metaalionen. Het is noodzakelijk om de verwaarlozing van de veranderingen in het EOF.
      7. Herhaal de bovenstaande stappen voor een flacon met behulp van de EOF-marker (60 µM) oplossing van acetanilide plaats. Ook, herhaalt u deze stappen met behulp van de monsteroplossing (1 mg/mL) plaats.

3. de capillaire Gel elektroforetische scheiding

Opmerking: De scheiding volgens de methode die wordt beschreven in eerdere werk Nachbar et al. bereiden 4.

  1. De analyse voorbereiden
    1. Voorwaarde het capillair
      1. Stel de thermostaat op 23 ° C.
      2. Spoel het capillair gedurende 10 minuten bij 2.5 bar met 0,1 M NaOH.
      3. Spoel het capillair gedurende 5 minuten aan 2.0 bar met 0,1 M HCl.
      4. Spoel het capillair gedurende 2 minuten bij 2,0 bar met gedeïoniseerd water.
    2. Vul in de buffer van de gel SDS
      1. Vul een capillair gedurende 10 minuten bij 2,0 bar met de verkrijgbare SDS gel-buffer met een pH van 8.0.
    3. Spoelen van het capillair vóór elke scheiding run
      1. Spoel het capillair gedurende 3 minuten op 4,0 bar met 0,1 M NaOH.
      2. Spoel het capillair voor 1 min op 4,0 bar met 0,1 M HCl.
      3. Spoel het capillair voor 1 min op 4,0 bar met gedeïoniseerd water.
      4. Spoel het capillair voor 10 min op 4,0 bar met de SDS gel-buffer.
  2. Uitvoeren van de scheiding
    1. Injecteer de monsteroplossing voor de experimenten van CGE (stap 2.1.4) hydrodynamica door 0,1 bar voor 4 min aan de inlaat van de toe te passen.
    2. Toepassen van-16.5 kV en een druk van 2.0 bar aan beide uiteinden van het capillair gedurende 25 minuten.

4. affiniteit capillaire elektroforetische analyse

Opmerking: De scheiding volgens de methode beschreven in eerdere werken door Nachbar et al. bereiden 4 en Alhazmi et al. 5.

  1. Voorwaarde het capillair
    1. Stel de thermostaat op 23 ° C.
      Opmerking: De temperatuur wordt gebruikt volgens gepubliceerde protocollen en kan worden gewijzigd in andere temperaturen4,5. Echter de interacties zijn afhankelijk van de temperatuur en zal dienovereenkomstig veranderen.
    2. Spoel een capillair voor 40 min bij 2.5 bar met 0,1 M NaOH.
    3. Spoel het capillair gedurende 10 minuten bij 1.0 bar met gedeïoniseerd water.
    4. Spoel het capillair gedurende 30 minuten bij 1.0 bar met een 30 mM Tris buffer (pH 7.4).
  2. Voorbereiding van de ACE-methoden
    1. De methode voor de metingen zonder liganden voor te bereiden.
      Opmerking: Acetanilide is niet toegevoegd aan de oplossing van het monster, zoals het vermommingen 2 eiwit pieken.
      1. Spoel het capillair voor 1 min bij 2.5 bar met een 0,1 M EDTA-oplossing.
      2. Spoel het capillair voor 1 min bij 2.5 bar met gedeïoniseerd water.
      3. Spoel het capillair 1,5 min bij 2.5 bar met een buffer van Tris voor evenwichtsinstelling.
      4. Injecteer de acetanilide oplossing voor 6 s op 0,05 bar en verandering de inlaat en uitlaat flesjes aan de Tris buffer flesjes.
      5. Toepassen van 0,05 bar voor 2.4 s om de oplossing van acetanilide vanaf de punt van de capillaire verdere binnenkant.
      6. Toepassen van 10,0 kV voor 6 min en detecteren de acetanilide piek bij een golflengte van 200 nm.
      7. Herhaal stap 4.2.1.1. -4.2.1.6. met behulp van het eiwit proef in plaats van de oplossing van acetanilide en detecteren alle pieken van het eiwit.
    2. De methode voor de metingen met liganden voor te bereiden.
      1. Spoel het capillair voor 1 min bij 2.5 bar met een 0,1 M EDTA-oplossing.
      2. Spoel het capillair voor 1 min bij 2.5 bar met gedeïoniseerd water.
      3. Spoel het capillair 1,5 min bij 2.5 bar met de ligand-oplossing voor evenwichtsinstelling.
      4. Injecteer de acetanilide oplossing voor 6 s op 0,05 bar en verandering de inlaat en uitlaat flesjes aan de buffer ligand-bevattende flesjes.
      5. Toepassen van 0,05 bar voor 2.4 s om de oplossing van acetanilide vanaf de punt van de capillaire verdere binnenkant.
      6. Toepassen van 10,0 kV voor 6 min en detecteren de acetanilide piek bij een golflengte van 200 nm.
      7. Herhaal stap 4.2.2.1 - 4.2.2.6 met behulp van de eiwitSteekproef in plaats van de oplossing van acetanilide en detecteren alle pieken van het eiwit.
    3. Afwisselend Herhaal stap 4.2.1 en 4.2.2 ter berekening van de verandering in de verhoudingen van de charge-grootte van de verschillende interacties van de eiwit-metaal ion (beschreven onder Vertegenwoordiger resultaten).
      1. De eiwit-oplossing na elke 60 h u wilt wijzigen in een vers.
        Opmerking: op dit punt, het experiment kan worden onderbroken. Deze procedure is ten minste herhaalde 10 x voor elke concentratie van de liganden sinds de piek patroon enigszins van run naar run verschilt. Als de oplossing meer dan 60 h gebruikt is, wordt de variaties te groot geworden.
    4. Uitvoeren van de methoden
      1. Voer de methode beschreven onder stap 4.2.2, met behulp van de alkaline earth ligand oplossingen (CaCl2, MgCl2, BaCl2en SrCl2 oplossingen).
      2. Blijven met behulp van de methode beschreven onder stap 4.2.2, met behulp van de MnCl2, SeCl4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2en NiCl2 oplossingen in plaats van de alkaline earth ligand oplossingen.
        Opmerking: De laatste overgangsmetalen chloriden bleek sterker interacties met het capillair en kunnen niet volledig worden verwijderd. Het resultaat van deze interacties in verschuivingen in de migratietijd van run naar run. Daarom werden ze onderzocht na de andere metaalionen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 toont de electropherogram voor het AtHIRD11 monster verkregen tijdens de CGE experimenten. De grootte van de peptide neemt toe van links naar rechts. Piek nummer 4 heeft de grootste massa en geeft aan het intact eiwit. De kleinere pieken 2 en 3 vormen kleinere onzuiverheden (bv, afbraakproducten daarvan). De eerste piek en de inconsistentie van de basislijn voor kunnen ook worden gereproduceerd zonder de eiwitSteekproef. Dus, het is verwant ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Voor alle CE experimenten is de voorbereiding van het capillair een cruciale stap. Aangezien het een glazen buis met een kleine diameter, kan het gemakkelijk breken op de plekken waar de coating wordt verwijderd wanneer het wordt behandeld. De installatie van het capillair in het instrument moet zeer zorgvuldig gebeuren.

De kritische stappen betrokken bij het gebruik van de ACE-methode voornamelijk betrekking hebben op de experimentele opzet. Een andere belangrijke stap is het vinden van de ju...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij dankbaar dank Masakuza Hara (het Research Institute of Green Science and Technology, Universiteit van Shizuoka, Japan) voor het verstrekken van de AtHIRD11 EiwitSteekproeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AtHIRD11 sampleShizuoka University (Group Prof. M. Hara)-Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillaryPolymicro Technologies (Phoenix, USA)106815-0017TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600AAgilent Technologies (Waldbronn, Germany)comercially niet meer beschikbaarCapillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE kan in plaats daarvan worden gebruikt
Agilent 7100 CEAgilent Technologies (Waldbronn, Germany)G7100ACapillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mLB. Braun (Melsungen, Germany)4606051VSpuit voor filtratie
Rotilabo-spruitspuitfiltersCarl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)KY62.1PVDF-membraanfilter voor oplossingsfiltratie
Eppendorf Research plus 10 μLEppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)3121 000.023Micropipet voor monsterbehandeling
Eppendorf Research plus 10 μLEppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)3121 000.120Micropipet voor het behandelen van de ligandoplossingen
Bulppipet 10 mLDuran Group GmbH(Mainz, Germany)24 338 08Bereiding van deNaOH-oplossing
Bulppipet 25 mLDuran Group GmbH(Mainz, Germany)24 338 14Bereiding van de ligandoplossing
Duran glas volumetrische kolf 25 mLDuran Group GmbH(Mainz, Germany)24 671 1457Bereiding van de ligand stockoplossing
Duran glas volumetrische kolf 10 mLDuran Group GmbH(Mainz, Germany)24 671 1054Bereiding van de ligand stockoplossing
Proteome Lab SDS MW Gel BufferBeckman Coulter (Brea, USA)comercially niet meer beschikbaarSeparation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer van Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalogusnummer: 1485032 
AcetanilideSigma-Aldrich (Steinheim, Germany)397229-5GElectroosmotisch stromingsmarker
Mangaan(II)chlorideSigma-Aldrich (Steinheim, Germany)13217Ligand
Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)431788-100GSpoelmiddel
BariumchlorideSigma-Aldrich (Steinheim, Germany)202738-5GLigand
NatriumdodecylsulfaatSigma-Aldrich (Steinheim, Germany)71729-100GOplosbaar makend eiwit voor capillaire gelelektroforese
Nikkel(II)chloride hexahydraatSigma-Aldrich (Steinheim, Germany)654507-5GLigand
Selen(IV)chlorideSigma-Aldrich (Steinheim, Germany)323527-10GLigand
2-amino-2-hydroxy-methylpropaan-1.3-diol (Tris)Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)252859-100GBufferingrediënt
Zink(II)chlorideMerck Millipore ( Darmstadt, Germany)1088160250Ligand
StrontiumnitraatMerck Millipore ( Darmstadt, Germany)1078720250Ligand
CalciumchloridedihydraatMerck Millipore ( Darmstadt, Germany)1371015000Ligand
37% zoutzuurMerck Millipore ( Darmstadt, Germany)1003171000Aanpassen pH
Koper(II)chloridedihydraatRiedel-de Haën (Seelze, Germany)31286Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45LAllpax (Papenburg, Germany)10000084;0Ultrasoonbad
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)G2070-91126Softwarepakketten om de CE-instrumenten te bedienen, gegevens te verzamelen en te evalueren

Referenties

  1. Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
  2. Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
  3. Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
  4. Nachbar, M., et al. Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
  5. Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
  6. Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
  7. Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
  8. Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
  9. Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
  10. Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
  11. Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
  12. Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Intrinsiek ongeordende eiwittenbinding van metaalionenAtHIRD11 analyseconformationele veranderingenelektroforetische mobiliteitsverschuivingeiwit ligandinteractiecapillaarvoorbereidingTris bufferoplossing

Gerelateerde artikelen