Methoden voor de studie van regeneratie in de Stentor

Samenvatting

De reus Ciliophora, Stentor coeruleus, is een uitstekend systeem voor studeren regeneratie en wondgenezing. We presenteren procedures voor de vaststelling van de Stentor celculturen van afzonderlijke cellen of cel fragmenten, inducerende regeneratie door snijden cellen, chemisch inducerende de regeneratie van de membranellar band en mondelinge toestellen, imaging en analyse van cel regeneratie weer gecontroleerd.

Samenvatting

Cellen moeten zitten kundig voor hun delen om te herstellen van externe verstoringen te regenereren. De eencellige Saw Stentor coeruleus is een uitstekende modelorganisme te bestuderen wondgenezing en latere cel regeneratie. De Stentor -genoom werd onlangs, samen met moderne moleculaire biologiemethodes, zoals RNAi beschikbaar. Deze tools maken het mogelijk om te studeren van eencellige regeneratie op moleculair niveau. De eerste sectie van het protocol omvat vaststelling van Stentor celculturen van afzonderlijke cellen of cel fragmenten, samen met de algemene richtsnoeren voor het behoud van de culturen van de Stentor . Stentor kweken in grote hoeveelheden voorziet in het gebruik van waardevolle hulpmiddelen zoals biochemie, sequencing en massaspectrometrie. Latere secties van het protocol betrekking hebben op verschillende benaderingen inducerende regeneratie in de Stentor. Handmatig snijden van cellen met een naald van glas kunt bestuderen van de regeneratie van grote cel delen, terwijl het behandelen van cellen met sacharose of ureum kunt bestuderen van de regeneratie van specifieke structuren gelegen aan het voorste uiteinde van de cel. Een methode voor imaging afzonderlijke regeneratie cellen is voorzien, samen met een rubriek voor enscenering en analyseren van de dynamiek van regeneratie. Het gehele proces van regeneratie is verdeeld in drie fasen. Door het visualiseren van de dynamiek van de progressie van een bevolking van cellen door de stadia, is de heterogeniteit in regeneratie timing aangetoond.

Inleiding

Cellen zijn geen eenvoudige zakken van enzymen, maar eerder ingewikkelde machines waarvan de onderdelen zijn zorgvuldig geschaald naar het juiste formaat en gerangschikt in welomschreven posities. De morfogenese van afzonderlijke cellen vertegenwoordigt een belangrijke proces in de cel en ontwikkelingsbiologie, maar het moleculaire mechanisme is onbekend^1,2. Terwijl sommige gekweekte cellen lijken op vlekjes, kunnen eencellige organismen hebben uiterst gecompliceerd platforms, wordt geïllustreerd door de complexe corticale patronen te zien in de categorieën^3,4.

Misschien is het meest extreme voorbeeld van een zeer gestructureerde cel Stentor coeruleus, een gigantische heterotrichous Saw verwant onderzocht en Paramecium. Stentor is 1 mm lang en is bedekt met meer dan 100 longitudinale strepen van blauw pigment afgewisseld met rijen van cilia georganiseerd door parallelle stapels microtubulus linten die de lengte van de gehele cel worden uitgevoerd. De cel is trompet-vorm (Figuur 1), met een membranellar band en een mondelinge apparatuur (OA) op het voorste uiteinde en een holdfast dat de cel hecht aan de ondergrond op zijn achterste einde. Naast de duidelijke anterior-posterior polariteit, de cel ook ziet u een onderscheidende chirale patronen, zodanig dat de afstand tussen Ciliaire rijen geleidelijk toeneemt in een richting van de klok. Dit resulteert in een discontinuïteit waar het smalste rij voldoet aan de breedste rij, en dit gebied van het celoppervlak, bekend als de locus van stripe contrast, kan leiden tot de vorming van de tweede reeks van anterior einde structuren als geënt op een andere cel⁵, waardoor het formeel gelijk aan Spemann de organisator. Dus, alle belangrijke processen van de ontwikkelingsbiologie hebben hun analogen in de Stentor: axiation, patroonformatie en inductie. In een embryo, deze processen worden gedreven door lot verschillen tussen de verschillende cellen, maar in de Stentor, ze moeten worden gedreven door lot verschillen tussen verschillende regio's binnen een enkele cel. Wat definieert de verschillen tussen de regio's binnen de Stentor is een raadsel.

Als enig deel van de Stentor is afgesneden, kan het ontbrekende stuk van de cel regenereren zodanig dat deze een normale cel in een kwestie van uren. Als een cel is gesneden in de helft, of zelfs in veel kleinere stukken, elk stuk reorganiseert in een cel normaal uitziende, maar kleiner en herstelt de juiste evenredigheid tussen cel deel^6,7. Zelfs kleine fragmenten, 1/64^th de grootte van de oorspronkelijke cel, kunnen regenereren in een kleine, maar normaal geproportioneerd cel, en vervolgens uitgroeien tot de volledige grootte⁶. Stentor dus presenteert een unieke gelegenheid om de mechanismen van organel grootte schalen en cel groeiregulatie met chirurgische methoden die gewoonlijk op het niveau van de weefsels of hele organismen toegepast worden te bestuderen.

Een van de eigenschappen van de Stentor waarmee het te genereren uit een breed scala van chirurgische operaties is dat het een interne nodulated macronucleus (Figuur 1) met de ongeveer 50.000 exemplaren van de gehele genoom⁸bevat. Zolang een cel fragment ten minste één macronuclear knooppunt bevat, heeft het de mogelijkheid om het volledig te regenereren. Een andere eigenschap die ten grondslag liggen aan de StentorRegeneratie vermogen is de wonderbaarlijke wondgenezing mogelijkheid. Hoewel veel celtypen geschikt zijn voor de genezing van hun wonden⁹, vermag Stentor herstellen uit een buitengewone hoeveelheid lichamelijke verstoringen. Een voorbeeld van de terugwinning van de Stentor van een drastische perturbation, samen met de methoden voor het visualiseren van cytoplasmatische stroming in Stentor¹⁰ waren eerder gemeld. Deze methoden toestaan de studie hoe verwonden en de daaropvolgende regeneratie van invloed op de fysieke status van het cytoplasma.

Stentorvan enorme omvang, buitengewone Regeneratie vermogen, en het feit dat het veel van de ontwikkelingstoxiciteit verschijnselen gezien in meercellig embryo's (zoals organisatoren, axiation en patronen) manifesteert zich aangetrokken veel developmental biologen tijdens het begin van de vorige eeuw, met inbegrip van Thomas Hunt Morgan⁷. Microchirurgische benaderingen aangetoond tijdens de 50 's en 60 's, een verrassende scala van regeneratieve en morfogenetische processen in deze eencellig organisme¹¹. Echter is Stentor ontwikkeld als een modelsysteem moleculaire biologie pas onlangs. Tijdens de afgelopen jaren, het genoom van de Stentor was sequenced en geassembleerd⁸, en de methode erover genexpressie RNAi via voeding ontwikkelde¹²was.

Onlangs was een van de redenen dat de Stentor was uitgegroeid tot een modelorganisme voor moderne moleculaire biologie alleen de moeilijkheid van het kweken van de grote culturen te wijten aan haar lange celcyclus (3 tot 5 dagen). Echter, moderne genomic en proteomic methoden vereisen minder materiaal dan ze gewend, en het volume van een eencellige Stentor voldoende voor deze methoden, is zelfs zonder toevlucht te nemen tot ultrasensitive methoden die zijn ontwikkeld voor de analyse van single cellen die veel kleiner dan de Stentor zijn. Sectie 1 van het protocol een overzicht van de procedure voor de vaststelling van een grote cultuur van een enkele cel van de Stentor . Dezelfde aanpak kan worden gebruikt om een grote cultuur van een fragment van de cel verkregen door het snijden van een cel. Deel 1 bevat ook de richtlijnen voor het behoud van gezonde Stentor culturen gedurende lange perioden van tijd. Afdeling 2 van het protocol voorziet in de methodologie inducerende cel regeneratie door het snijden van de cellen handmatig met een naald van glas. Sectie 3 van het protocol is gewijd aan twee methoden voor het induceren van de regeneratie van specifieke cel structuren (membranellar band en orale apparatus): behandeling van de cellen met sacharose of ureum leidt tot het vergieten van deze structuren, gevolgd door hun regeneratie weer gecontroleerd. Deel 4 van het protocol gegevens een methode voor de beeldvorming van afzonderlijke regeneratie cellen gedurende lange perioden van tijd. Sectie 4 eindigt met de beschrijving van de stadia van regeneratie en tips over de analyse van de dynamiek van de regeneratie.

Protocol

1. het kweken van Stentor en tot oprichting van de Stentor culturen van afzonderlijke cellen of cel fragmenten

1. Bereiden Chlamydomonas reinhardtii cultuur moet worden gebruikt als voedsel voor de Stentor.
   1. Chlamydomonas reinhardtii cellen verkrijgen bij een commerciële leverancier (Tabel van materialen).
   2. Een 500 mL vloeibare cultuur van Chlamydomonas reinhardtii in verkrijgbare TAP media met behulp van steriele techniek¹³vast.
   3. Houd de Chlamydomonas cultuur onder een lamp met een concentratie in de buurt van verzadiging (bij od van ongeveer 1) door het verdunnen met TAP media tweemaal per week.
      Opmerking: De Chlamydomonas cultuur kan worden gekweekt op een shaker.
   4. Controleer regelmatig of de Chlamydomonas cultuur gezond is door het plaatsen van een daling van de cultuur op een dia, bedekken met een dekglaasje aan en controleren van het onder een microscoop op 40 X vergroting.
      Opmerking: Gebruik niet de cultuur voor de Stentor voeden als het is besmet met bacteriën of als Chlamydomonas cellen zijn samengevoegd in clusters. Als een van deze problemen zich voordoet, start u een nieuwe Chlamydomonas cultuur.
2. Stentor coeruleus cellen verkrijgen bij een commerciële leverancier (Tabel van materialen).
3. Als Stentor cellen van hun natuurlijke habitat nodig zijn, kunt u ze verzamelen uit een vijver, meer of rivier¹¹.
   1. Stentor verzamelen uit een vijver, meer of rivier, een gebied met wat vegetatie waar het water relatief rustige, schaduwrijke en duidelijk is te zoeken.
      Opmerking: Er is een hogere waarschijnlijkheid van het vinden van de Stentor op de locaties waar kroos groeit.
   2. Het verzamelen van ten minste 2 liter water in een container die is gemakkelijk te gieten van.
   3. Nadat detritus en zwevende deeltjes hebben zich aan de onderkant van de container, zachtjes een paar kleinere containers te onderzoeken voor de Stentor, wacht een paar seconden na elke collectie voor de detritus te vestigen in de grote container te vullen.
   4. Zodra het verzamelen van de monsters is voltooid op een locatie, verplaatsen naar een nieuwe locatie die ten minste 10 meter en herhaal monsters er.
      Opmerking: Niet elke vijver heeft een bevolking van de Stentor , zodat meerdere vijvers wellicht te bemonsteren.
   5. Terug met de monsters naar het lab en breng het water uit de containers in individuele petrischalen.
   6. In elke petrischaal, zoeken naar Stentor onder een stereomicroscoop met scheerlicht bij 5 X vergroting. Overdracht van afzonderlijke Stentor cellen met behulp van een pipet 1 mL in een putje van een glasplaat plek met ten minste 100 µL van verkrijgbare gepasteuriseerde bronwater (PSW).
      Opmerking: Stentor cellen hebben een trompet-achtige vorm wanneer ze zijn aangesloten op een substraat (Figuur 1). Zwemmen Stentor cellen zijn minder uitgebreid dan de cellen die zijn aangesloten op een substraat (Video 1).
   7. Stentor wassen in de PSW minstens 3 x. Uitvoeren van de wasbeurten door ongeveer 90% van het water uit de put te verwijderen terwijl de Stentor cellen in de put, gevolgd door het toevoegen van 500 µL van PSW in de put.
      Opmerking: Voordat de behandeling Stentor met pipetten met pipet tips van 10 µL of kleinere, snijden ongeveer 0,5 mm uit het einde van het uiteinde van de pipet met een schaar om te voorkomen dat de cellen als gevolg van de shear krachten die worden gegenereerd als een grote cel stroomt door verwonding te klein voor een tip op ening.
4. Bereiden Chlamydomonas voordat elke voeding van de Stentor.
   1. Breng 1 mL van Chlamydomonas cultuur bereid zoals in stap 1.1 in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Centrifugeer bij 2.095 x g gedurende 3 minuten.
   2. Verwijder het supernatant en resuspended van de pellet in 1 mL van PSW. Centrifugeer bij 2.095 x g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 µL van PSW.
      Opmerking: Dus, gewassen en geconcentreerde Chlamydomonas zal worden verwezen als "bereid Chlamydomonas"in de volgende stappen. TAP media is schadelijk voor de Stentor, dus wassen Chlamydomonas voordat voederen Stentor belangrijk is.
5. Als een klonale Stentor cultuur nodig is, start u de cultuur van een afzonderlijke cel van de Stentor of een fragment van de cel.
   1. Aangezien één Stentor cellen niet goed in de PSW groeien, bereiden geconditioneerde media door filter steriliseren van 500 µL van media uit een bestaande, gezonde Stentor -cultuur.
   2. Breng 500 µL van geconditioneerde media naar één van de putten van een plek glasplaat.
   3. Pipetteer een Stentor in het putje van de glasplaat plek met geconditioneerde media. Gebruik als kleine medium mogelijk te maken van de overdracht.
   4. Voer elke Stentor 5 µL van bereid Chlamydomonas elke 48 uur. Wanneer Stentor kloof, telt het aantal cellen in de put en voeg 5 µL van bereid Chlamydomonas per cel.
   5. Stentor in een schaduwrijke plek houden, aangezien de cellen gevoelig voor licht (bijvoorbeeld, in doorzichtige plastic dozen bedekt met keukenpapier zijn).
   6. Stentor medium in de put met verse geconditioneerde medium elke 96 h uit te wisselen.
      1. Bereiden van verse geconditioneerde media zoals in stap 1.5.1.
      2. Controleer alle cellen van de Stentor loskoppelen van de bodem van de put waarbij de vloeistof zachtjes op en neer in de put.
      3. Zorgvuldig gecombineerd de vloeistof uit het goed met behulp van een pipet 1 mL, ervoor te zorgen dat alle cellen blijven in de put. Voeg 500 µL van verse geconditioneerde media naar de waterput.
   7. Wanneer het aantal cellen in de put 20 overschrijdt, verplaatsen de cellen aan een grotere container, bijvoorbeeld, een wide-mouth glazen pot.
      1. Voeg 20 mL PSW in een gesteriliseerde met autoclaaf wide-mouth glazen pot.
         Opmerking: Autoclaaf van glaswerk voor Stentor kan worden vervangen door voorzichtig wassen en spoelen.
      2. Pipetteer de media zorgvuldig op en neer in de put loskoppelen van alle cellen van de bodem van de put. Verzamel alle Stentor cellen met behulp van een 1 mL pipet tip en zachtjes overbrengen naar de glazen pot.
   8. Niet scherpen de deksels op de potten met Stentor culturen, voldoende toegang tot lucht toestaan.
   9. PSW aan de pot elke 48 h toevoegen om te houden van de Stentor dichtheid bij ongeveer 20 cellen/mL. Schatting van de dichtheid van de cellen met het blote oog.
      Opmerking: Gebruik als alternatief, een 1 mL pipet zeepbel lucht in de kruik om cellen loskoppelen van de muren, Pipet van 1 mL van de cultuur, en het aantal cellen in het uiteinde van de pipet.
   10. Elke 48 h, feed willen Chlamydomonas Stentor culturen in potten (zie stap 1.4). Start met het voeden van de cultuur met 200 µL van bereid Chlamydomonas. Als het volume van de cultuur verhoogt, geleidelijk verhogen de hoeveelheid bereid Chlamydomonas gebruikt voor het voederen van maximaal 1 mL.
   11. Wanneer het volume van de cultuur bereikt ongeveer 90% van de pot de capaciteit, de cultuur overbrengen in een grotere container.
       1. Pipetteer de cultuur binnen de pot, op en neer, met een pipet 1 mL Stentor loskoppelen van het glas.
       2. Giet de hele inhoud van de pot in een 2-cup glas-container.
       3. Spoel de pot met ongeveer 25 mL van PSW naar de 2-cup glas-container voor het verzamelen van de resterende Stentor.
6. Handhaven van gezonde culturen in 2-cup glazen containers.
   1. Feed Stentor culturen 2 mL bereid Chlamydomonas per 100 mL van de cultuur van elke 4-5 dagen. PSW toevoegen aan de container voor glas, wordt elke 4-5 dagen om te houden van de Stentor dichtheid bij ongeveer 20 cellen/mL.
      Opmerking: 450 mL is het maximale volume dat een 2-cup container bezit.
   2. Eenmaal per week, Inspecteer de culturen onder een 5 X ontrafeling van Microscoop voor raderdiertjes, schimmel en andere groei. Verwijder te verlengen van de gezondheid van de cultuur, contaminerende micro-organismen samen met abnormaal gevormde en kleurloze Stentor cellen met behulp van een precisiepipet 1 mL.
   3. Wanneer de container voor glas ongeveer 90% vol is, splitsen de cultuur.
      1. Voeg 25 mL van PSW aan de container voor glas. Gebruik een 25 mL pipet om de pipet op en neer om los te Stentor van het glas. Zet ongeveer 50% van de cultuur in een nieuwe 2-cup glas-container.
      2. Voeg 25 mL van PSW aan beide culturen en aanhouden van de twee culturen zoals beschreven in deze sectie van het protocol.
         Opmerking: Aangezien de Stentor cellen zijn gevoelig voor hoge temperaturen, de handhaving van de temperaturen bij 25 ° C of lager in de kamer waar de culturen worden gehouden. Als alternatief kunnen de culturen in een incubator worden gehouden. Zie tabel 1 voor probleemoplossing voor het kweken van de Stentor .

2. inducerende regeneratie door snijden Stentor cellen

1. De trekker van een naald gebruiken om verschillende naalden van capillaire buisjes met behulp van het programma als volgt: warmte - 735, pull - 100, snelheid - 110, tijd - 150, druk - 400.
2. Bereid een 4% methylcellulose oplossing in 50 mL PSW.
   1. Voeg 1 g methylcellulose (viscositeit: 1500 cP) tot 50 mL van PSW.
   2. Incubeer bij 4 ° C gedurende ten minste 8 h tot het vergemakkelijken van de ontbinding van methylcellulose.
   3. Bewaar 4% methylcellulose oplossing bij kamertemperatuur.
3. Bereiden een plek glasplaat voor het opslaan van de fragmenten van de cel na het uitvoeren van de bezuinigingen.
   1. Filter steriliseren media uit een gezonde cultuur, 500 mL per plek glasplaat goed nodig.
   2. Overdracht 500 mL gesteriliseerde media in elk van de putten nodig.
4. Een gezonde Stentor (met een gedefinieerde trompet-vorm, levendige blauw-groene kleur, en geen grote vacuolen) verzamelen in een droplet 2 µL en plaats deze op een dekglaasje aan of dia. Voeg 2 µL van 4% methylcellulose (Figuur 2). Laat de Stentor vertragen voordat het te snijden (Video 2).
5. Houd de naald glas als parallel aan het snijvlak mogelijk om te voorkomen dat het breken van de naald.
6. Met behulp van een stereo microscoop ontleden, zoek het puntje van het glas naald en dichter te verplaatsen naar de cel (figuur 3A). Observeer de Stentor contract bij contact met de naald (figuur 3B en C).
   Opmerking: Als de cel zich in een richting waardoor het scheiden van het anterieure einde van het posterieure einde moeilijk, draaien heel voorzichtig met de kant van de naald.
7. Druk zachtjes op de gecontracteerde Stentor met de zijde van de glazen naald te snijden van de cel in twee (figuur 3D en E, Video 3). Verplaatsen van de twee fragmenten uit elkaar ervoor te zorgen dat er geen cytoplasmatische verbinding tussen hen is, om te voorkomen dat fragment fusion (figuur 3F).
8. Controleer of beide fragmenten ten minste één macronuclear knooppunt elke door het onderzoek van de fragmenten onder een ontleden Microscoop met schuine verlichting.
   Opmerking: Hebben van ten minste één macronuclear knooppunt is essentieel voor de overleving van de cel. De cel kan zijn pellicle (transparante shell) samen met de blauw-groene pigment werpen tijdens of na de cut. In de meeste gevallen zal dit geen invloed op de levensvatbaarheid op lange termijn van de cel.
9. Verplaats de fragmenten naar putten van een glasplaat ter plaatse bereid in stap 2.3.
10. Meerdere cellen knippen omdat een fractie van de geknipte cellen zal niet regenereren.
11. Als meerdere bezuinigingen in één sessie wilt uitvoeren, vervang de naald glas wanneer het wordt zwaar gecoat met Stentor residu of wanneer haar tip wordt verbroken. Als alternatief, reinig de naald door afvegend het zachtjes op een stuk van silicium spacer.
    Opmerking: Glas naalden kunnen worden gebruikt voor meerdere cel knippen sessies.
12. Houd de plek glasplaat met fragmenten van de cel in een kamer vochtigheid.
13. Ga verder met deel 4 van het protocol voor meer informatie over beeldvorming en interpretatie van de Stentor regeneratie resultaten.

3. inducerende regeneratie van de Membranellar Band en mondelinge toestellen sacharose of ureum behandelingen

1. Membranellar band en orale apparaat verwijderen met behulp van sacharose
   1. Bereid een 25%-oplossing van sacharose in de PSW.
   2. 500 µL van 25% sucrose in PSW toevoegen aan een microcentrifuge-buis met een module cap.
   3. Bereiden 3 microcentrifuge buizen met module caps met 1 mL van PSW in elke buis voor het wassen van de cellen na sacharose behandeling.
   4. 30-60 Stentor cellen in 1 mL van de media van hun cultuur in een aparte microcentrifuge buis met behulp van een precisiepipet 1 mL (Figuur 4, pijl A) verzamelen.
   5. Verzamel alle cellen uit de buis in 125 µL eindvolume met behulp van een 200 µL precisiepipet in één remise. Overbrengen naar de buis met 500 µL van 25% sucrose (bereid in stap 3.1.2) om te verkrijgen van 625 µL van 20% sacharoseoplossing (Figuur 4, pijl B). Beginnen met een stopwatch.
   6. Incubeer Stentor in deze 20% sacharoseoplossing en flick-spin de microcentrifuge buis in het rek voor 1 min.
   7. Verzamelen van alle cellen in één Remise (pas de pipet 200 µL max capaciteit voor gemakkelijker collectie).
   8. De cellen in de pipet tip houden totdat de stopwatch 2 min van sacharose behandeling toont.
   9. Stentor werpen in een van de buizen van de microcentrifuge bereid in stap 3.1.3 (Figuur 4, pijl C). Film-spin de buis in het rek.
   10. Wassen van de cellen twee meer tijden, eenmaal in elk van de twee resterende microcentrifuge buizen met PSW bereid in stap 3.1.3 (Figuur 4, pijlen, D en E).
       Opmerking: Single draw cel collectie techniek is niet belangrijk tussen de wasbeurten.
   11. Ga verder met deel 4 van het protocol voor meer informatie over beeldvorming en interpretatie van de Stentor regeneratie dynamiek (Figuur 4, pijlen F en G).
2. Membranellar band en orale apparaat verwijderen met behulp van ureum
   1. Bereid een oplossing van 4% ureum in de PSW.
   2. 300 µL van 4% ureum in de PSW toevoegen aan een microcentrifuge-buis met een module cap.
   3. Bereiden 3 microcentrifuge buizen met module caps met 1 mL van PSW in elke buis voor het wassen van de cellen na de ureum behandeling.
   4. 30-60 Stentor cellen in 1 mL van de media van hun cultuur in een aparte microcentrifuge buis met behulp van een precisiepipet 1 mL (Figuur 4, pijl A) verzamelen.
   5. Verzamel alle cellen uit de buis in 300 µL eindvolume met behulp van een pipet 1 mL in een enkele trekken. Overbrengen naar de buis met 300 µL van 4% ureum (bereid in stap 3.2.2) om te verkrijgen van 600 µL van 2% ureumoplossing (Figuur 4, pijl B). Beginnen met een stopwatch.
   6. Incubeer Stentor in deze 2% ureumoplossing en flick-spin de microcentrifuge buis in het rek voor 1 min.
   7. Het verzamelen van alle cellen in een enkele trekken.
   8. De cellen in de pipet tip houden totdat de stopwatch 2 min van ureum behandeling toont.
   9. Stentor werpen in een van de buizen van de microcentrifuge bereid in stap 3.2.3 (Figuur 4, pijl C). Film-spin de buis in het rek.
   10. Wassen van de cellen twee meer tijden, eenmaal in elk van de twee resterende microcentrifuge buizen met PSW bereid in stap 3.2.3 (Figuur 4, pijlen, D en E).
       Opmerking: Single draw cel collectie techniek is niet belangrijk tussen de wasbeurten.
   11. Ga verder met deel 4 van het protocol voor meer informatie over beeldvorming en interpretatie van de Stentor regeneratie dynamiek (Figuur 4, pijlen F en G).

4. imaging en analyseren van de cel regeneratie

1. Als een rechtop microscope, gebruiken de opknoping druppel methode aan afbeelding regeneratie van afzonderlijke cellen.
   1. 100 µL van PSW in een put van een plek glasplaat plaatsen
   2. Isoleren van 1 Stentor cel in 4 µL van voedingsbodems (de media dat zij in), met behulp van een 10 of 20 µL Pipetteer. Storten van de druppel in het midden van een dekglaasje aan van 22 x 22 mm,² (Figuur 5).
      Opmerking: Als de cellen die 1) ongezond zijn (abnormaal gevormde of zwaar vacuolated) of 2) nog steeds membranellar bands of mondelinge toestellen (voor chemische behandeling experimenten), gebruik geen voor imaging.
   3. 4 meer druppeltjes van de Stentor in de media van de cultuur rond de vorige druppel, terwijl er genoeg ruimte tussen de druppels te regelen.
   4. Omkeren van het dekglaasje aan met druppels en plaats deze zachtjes over de waterput van de glasplaat plek waaraan PSW is toegevoegd in stap 4.1.
   5. Opmerking: PSW in de put zal het minimaliseren van de verdamping van de druppels (Figuur 5).
   6. De resterende cellen voorbereiden op imaging als volgt 4.1.1 - 4.1.4.
   7. Het imago van de regeneratie cellen onder een microscoop met de resolutie van de gewenste tijd. U kunt ook observeren de regeneratie met behulp van een ontleden stereomicroscoop.
      Opmerking: Regeneratie begint deze onmiddellijk na de cel knippen of behandeling met sacharose of ureum. Echter zal zichtbaar nieuwe mondelinge structuren vormen ongeveer 3 uur na het begin van de regeneratie.
2. Voor elk punt van de tijd, een van de drie stadia van regeneratie toewijzen aan elk van de cellen. Om dit te doen, vergelijk elke cel aan de representatieve beelden ter illustratie van de fases (Figuur 4 en Figuur 6).
   1. Fase 1 toewijzen aan de cellen die niet over een membranellar band nog (figuur 6A).
   2. Fase 2 toewijzen aan de cellen met een membranellar band.
      Opmerking: Een membranellar-band verschijnt 3-6 h na behandeling (Figuur 4, figuur 6B). Aan het einde van deze etappe verschijnt een extra kromming van het achterste uiteinde van de membranellar band net voordat een mondelinge primordium wordt weergegeven.
   3. Fase 3 toewijzen aan de cellen met een mondelinge primordium.
      Opmerking: Een mondelinge primordium is een invagination 6-8 h verschijnen na de behandeling aan het achterste uiteinde van de membranellar band (Figuur 4, Figuur 6 c en 6 D). Regeneratie is voltooid wanneer de cellen een band van de membranellar aan hun voorste eind en de karakteristieke trompet cel vorm (Figuur 4, Figuur 6 sexies hebben). Meeste Stentor cellen zijn volledig opnieuw gegenereerd binnen 8-9 uur sinds de start van de regeneratie.
3. Het uitzetten van het percentage van de cellen in elk van de fasen van de regeneratie voor elk punt van de tijd in de vorm van een gestapelde Boxplot (Figuur 7).
   Opmerking: Dit type van perceel maakt het mogelijk de visualisatie van regeneratie dynamiek in een bevolking van cellen.

Resultaten

Stentor culturen zijn betrouwbaar opgericht en onderhouden van afzonderlijke cellen of fragmenten van de cel met behulp van sectie 1 van het protocol. Een representatief voorbeeld van een grote gezonde cultuur wordt weergegeven in de Video 1.

Het tijdsverloop van regeneratie werd gemeten in Stentor met de sacharose behandelingsmethode voor het inleiden van de regeneratie beschreven in stap 3.1, gecombineerd met de beeldvorming en de methode van de analyse besproken in hoofdstuk 4 (Figuur 7). Dit perceel geeft aan dat er een één-uur-lange spreiding in de tijd genomen door de bevolking van cellen om het bereiken van een bepaalde fase. Dit soort analyse kan de studie van temporele heterogeniteit in de regeneratie-proces in een bevolking van cellen te regenereren.

Het volgende is een samenvatting van regeneratie timing die tot nu toe heeft waargenomen na tientallen sacharose behandelingen (Figuur 4 en Figuur 6). Fase 1 is wanneer de Stentor cellen eruit teardrops zonder enige band van de membranellar (deze fase start onmiddellijk na sacharose wassen). Deze fase duurt voor 3-6 h. fase 2 is wanneer een band membranellar verschijnt en groeit (3-6 uur na de behandeling van sacharose). Deze fase duurt 3-4 h. fase 3 is wanneer een mondelinge primordium op het achterste uiteinde van de membranellar band (6-8 uur na de behandeling van sucrose verschijnt), en beide structuren worden verplaatst naar de voorste einde van de cel. Deze fase duurt 1-2 h. Wanneer zowel de band van de membranellar en de mondelinge toestellen de anterior einde van de cel bereikt, dit aangegeven de voltooiing van de regeneratie. De cel heeft karakteristieke Stentor trompet-achtige vorm aangenomen. Cellen werden volledig geregenereerde 8-9 h na sacharose behandeling.

Figuur 1. Momentopname van de Stentor. De band van de membranellar en de mondelinge toestellen staan anterior eind van de cel. De holdfast is aan het achterste einde van de cel. Stentor macronucleus is nodulated. Een goed gevoed Stentor heeft groene voedsel vacuolen met meestal Chlamydomonas. De bar van de schaal is 0,5 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2. Stentor snijden set-up. Cel snijden wordt uitgevoerd door het handmatig manipuleren van een glas naald tijdens het kijken naar de cel met behulp van een commercieel beschikbare ontleden stereomicroscoop. Het doel van het weefsel papier is zodat de witte achtergrond om te zien de cellen beter. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3. Momentopnamen van de Video 3 illustreren hoe te snijden een Stentor met een glas naald. (A) A Stentor onmiddellijk voordat de naald het raakt. (B) een Stentor zachtjes ingeklemd tussen de dia van een naald en glas. (C) A gecontracteerd Stentor reageren op de kracht van de naald. (D) A Stentor ingekrompen door zachtjes te drukken op de cel met de kant van de naald. (E) A Stentor nu doormidden gesneden maar niet gescheiden. (F) twee Stentor fragmenten. De bar van de schaal is 0,25 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4. Schematische visualisatie van deel 3 en deel 4 van het protocol. Dit is een geïllustreerde protocol voor het uitvoeren van sacharose of ureum behandeling en observatie van de cel regeneratie. De tijd die is aangegeven in het onderste paneel wordt gemeten vanaf het begin van the Wash 1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5. De setup voor imaging en/of directe observatie van regeneratie met een rechtop Microscoop. In elke 4 µL druppel opknoping van het dekglaasje aan, is er één cel regeneratie ondergaan. Water in de putten van de plek glasplaat beperkt verdamping van de druppels. Deze setup kan na de regeneratie van meerdere cellen parallel geschakeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6. Momentopnamen van de Stentor in elke fase van de membranellar band en de mondelinge apparaat regeneratie. (A) fase 1 wordt gekenmerkt door een teardrop-achtige cel vorm en het ontbreken van de membranellar band. (B) Stage 2 is gekenmerkt door het verschijnen van de membranellar band, een cilia gebaseerde structuur die voortdurend verslaat. Membranellar banden zijn gemarkeerd met witte stippellijnen in panelen B - D. (C en D) fase 3 wordt gekenmerkt door de verschijning van orale primordium (gemarkeerd met een pijl). Mondelinge primordium ziet eruit als een invagination op het achterste uiteinde van de band membranellar. De mondelinge primordium zal vervolgens omhoog naar de voorste van de cel tot het mondeling apparaat. (E) regeneratie is voltooid wanneer de cel de karakteristiek Stentor trompet-achtige vorm heeft aangenomen, en de mondelinge apparaten (gemarkeerd met een pijl) heeft verbreed anterior eind van de cel. De bar van de schaal is 0,25 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7. Gestapeld vak perceel weergegeven: hoe de verhoudingen van cellen in alle stadia van regeneratie na sacharose behandeling na verloop van tijd verandert. De plot geeft heterogeniteit in de timing van de regeneratie stadia in een populatie van regeneratie cellen. "Reg. end" geeft aan de voltooiing van de regeneratie. Het aantal cellen: 28. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Video 1. Voorbeeld van een gezonde cultuur van de Stentor . In het algemeen, als een cultuur dit geconcentreerd is, splitsing van de cultuur wordt aanbevolen. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Video 2. Stentor vertragen met methylcellulose. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Video 3. Snijden Stentor. Afzonderlijke cellen kunnen handmatig worden gesneden in meerdere stukken onder een stereo microscoop ontleden door te drukken op een glas naald door de cel. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Probleem met cultuur	Mogelijke oplossing	Mogelijke preventie
Cultuur is overweldigd door raderdiertjes of andere grote organismen.	Verwijder zoveel Stentor mogelijk in een nieuwe cultuur schotel. Daarna wassen de cellen drie keer.	Stentor grondig wassen bij het ontvangen van hen, zelfs wanneer het kopen van hen van een commerciële leverancier.
Cultuur is overweldigd door de schimmel of andere kleine organismen.	Identificeren van een hoek waar zich het minst Stentor. In dat gebied, zo veel media verwijderen als mogelijk is zonder het verwijderen van vele Stentor en voeg in nieuwe PSW. Meng voorzichtig maar grondig te distrubute de binnenvallende organismen. Sla de volgende voederplaats en de Stentor zal opeten.	Regelmatig observeren van de cultuur en verwijderen van kleine verontreinigingen door media voor verse PSW uit te wisselen.
Stentor gelegd bovenop elkaar.	Splitsen de cultuur, zodat de concentratie minder dan 20 cellen/mL is.	Culturen vaker splitsen.
Stentor cellen zijn paring.	Voer elke 4 dagen in plaats van elke 5 dagen.
Cultuur heeft een heleboel donkere afvalmateriaal.	Verwijder zo veel van het donkere materiaal, Stentor afval, mogelijk zonder de cellen te verwijderen. Als Stentor zijn gekoppeld aan het donkere materiaal, Pipetteer omhoog en omlaag om de release van de Stentor -cellen uit hun afval en vervolgens de media met de afvalstoffen te verwijderen zonder de cellen te verwijderen. Of, verwijder de Stentor en diervoeders dienovereenkomstig minder.	Feed Stentor 1 mL minder voedsel per 100 mL van de cultuur.
Ongezond ogende (vacuolated/opgeblazen of afgeronde) Stentor.	Verwijder zo veel media mogelijk zonder veel Stentor cellen verwijderen en toevoegen van nieuwe PSW.	De media regelmatig wisselen.

Tabel 1. Probleemoplossing voor het kweken van de Stentor.

Discussie

Kweken van de Stentor presenteert een aantal uitdagingen. Eerst, voor het uitvoeren van experimenten die grote aantallen cellen vereisen, moet een groot aantal Stentor culturen, handhaven als culturen worden ongezond als Stentor concentratie groter is dan 20 cellen/mL. Ten tweede, de organismen die Stentor culturen vaak besmetten kunnen sneller dan de Stentor verdelen en overweldigen de cultuur (een gemeenschappelijk verontreinigingen is raderdiertjes). Het is dus noodzakelijk de cultuur onder een Microscoop periodiek inspecteren en verwijderen van de verontreinigingen. Af en toe, moet een nieuwe cultuur worden gestart vanuit een klein aantal cellen handmatig gered uit een verontreinigde cultuur. Dit verhoogt de tijd die nodig is om gezonde Stentor culturen. Ten derde, een eencellige uitbreiden naar een cultuur van 400 mL vereist ten minste één maand omdat Stentor celcyclus 3-5 dagen is. Ten vierde, in tegenstelling tot andere model categorieën, Stentor zelden gaan in de vorm van de cyste en zij kunnen niet worden ingevroren.

Een belangrijk aspect van het kweken van de Stentor is de selectie van een geschikte voedsel organisme. Verschillende methoden voor het kweken van de Stentor werden eerder beschreven. Een van hen stelt voor het gebruik van afgeroomde melk voor cultuur-bacteriën die vervolgens Stentor voeden. Deze techniek is effectief in het kweken van de Stentor; toepassing van genomische technieken vereist echter puur monsters om verwarring als gevolg van genomic leesbewerkingen van ongedefinieerde voedsel organismen te voorkomen. Met behulp van het huidige protocol, Stentor kunnen worden geteeld in massa en omdat hun voedsel, Chlamydomonas, heeft zijn sequenced, de aanwezigheid van genomic verontreiniging van de voedsel-organisme kan worden gedetecteerd en gecontroleerd voor. Om onbekende redenen moest tandsteen vullen zijn voorraden door terug te keren naar waar hij vond Stentor vóór. Met het huidige protocol, heeft men kunnen houden Stentor jarenlang.

Regeneratie experimenten met Stentor zijn over het algemeen eenvoudig, maar er zijn een paar kritische details in gedachten te houden. Met betrekking tot paragraaf 2, snijden Stentor cellen doormidden kunnen worden beheerst in minuten. Beheersen van meer geavanceerde procedures voor microchirurgie van Stentor voorschrijven een week van de praktijk. Terwijl het uitvoeren van een sacharose of ureum behandeling (sectie 3), als aan het begin van de beeldvorming van de meeste cellen nog hun membranellar bands, verhogen incubatietijd door 10-30 s voor wanneer sacharose behandeling wordt vervolgens uitgevoerd. De tijd van sacharose behandeling na 3 min incubatie niet verhogen omdat het leiden celdood tot zal.

Beeldvorming van de Stentor vereist regeneratie methoden naar afbeelding grote cellen gedurende lange perioden van tijd. De beeldvorming methode gedetailleerd beschreven in sectie 4 kan alleen worden gebruikt met een rechtop Microscoop. Als een omgekeerde Microscoop beschikbaar in plaats daarvan is, kunnen vervolgens cellen worden geplaatst op een dia of een dekglaasje aan in kleine kamers. Een methode is het maken van een kamer van vaseline en cover met een dekglaasje aan ter voorkoming van verdamping. Als alternatief, een kamer voor een afzonderlijke cel kan worden gemaakt door een gat met een perforator voor de gewenste grootte in een 1 x 1 cm² vierkante van silicium spacer (tabel van materialen), de spacer te plaatsen op een dekglaasje aan, waardoor cellen in de zaal , en die betrekking hebben op de kamer met een dekglaasje aan. Wanneer imaging, als Stentor niet in de juiste stand te observeren de meest karakteristieke kenmerken van elke fase van de regeneratie, tikt u op de plaat stevig om het contract van de cel. Bekijk de cel uitbreiden ter identificatie van de fase van de regeneratie (volledig uittrekbaar neemt ongeveer 45 s). Als de cel zich nog steeds in de verkeerde richting, herhaalt u het afluisteren. De beelden weergegeven in Figuur 1 en Figuur 6 werden genomen door een Microscoop stereo zoom; alle experimenten gedetailleerde, kunnen echter wel worden uitgevoerd met behulp van een 5 X de ontrafeling van de stereomicroscoop.

Een andere uitdaging naast kweken en imaging Stentor is het volgen van regeneratie, specifiek de hoeveelheid tijd die nodig is om de stadia te identificeren. Als de cel regeneratie perfect georiënteerd met de regio van de mondelinge primordium duidelijk zichtbaar is, duurt identificatie van de etappe een paar seconden. De Stentor -cel is echter soms in een oriëntatie die is preventie van duidelijke toewijzing van regeneratie fase, dus meer tijd neemt om te identificeren. De aanzienlijke hoeveelheid benodigde tijd voor fase afzonderlijke regeneratie cellen zou kunnen de kwantificering van alle regeneratie cellen vertragen, dus het verminderen van de temporele precisie van enscenering en de eis dat de waarnemer te wachten en herstellen via een image de cel toe achter het is verhuisd naar een nieuwe oriëntatie. Dit experiment is derhalve zowel tijd en arbeidsintensief. Om deze redenen zou het zeer wenselijk om geautomatiseerde methoden voor het opsporen van de Stentor cellen en stadia van regeneratie in videomicroscopie gegevens toewijzen. Dit zou ook voor meer reproduceerbare experimenten, toename van de grootte van de steekproef en de verwijdering van menselijke bias.

De opkomst van zeer gevoelige genomic en proteomic methoden is begonnen met studies van afzonderlijke cellen in bereik gebracht. Voor dergelijke eencellige analyses maakt de enorme grootte van de cel van een Stentor het een wenselijk proefpersoon voor proof-of-concept experimenten. Voor dergelijke experimenten mogelijk, culturing Stentor is van fundamenteel belang, en dus de hier beschreven methoden een rol moeten spelen in de verdere ontwikkeling van meer geavanceerde technieken van eencellige.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Stentor coeruleus levende cultuur	Carolina Biological Supply	131598
Chlamydomonas reinhardtii op agar	Carolina Biological Supply	152040
Gepasteuriseerd bronwater, fles van 1 liter	Carolina Biological Supply	132458
Methylcellulose, 1500 cP	Millipore Sigma	M0387
Pyrex glazen spotplaat	Fisher Scientific	13748B
Glaspot met brede hals en schroefdop, 60 mL	Carolina Biological Supply	715740
2-kops glazen bakje met glazen deksel	Pyrex	1095600
CultureWell siliconen plaatmateriaal	Grace Bio Labs	664475
Kimwipes	Kimberly Clark	34155
Posi-Click 1,7 mL microcentrifugebuisje	Denville	C2170
Dekglas	Fisher finest	12-548-B
TAP-groeimedia, geoptimaliseerd voor Chlamydomonas-cultuur	ThermoFisher	A1379801
Siliconen afstandhouder, CultureWell siliconen plaat, 0,25 mm dik/13 cm x 18 cm	Grace Bio Labs	664475
Petrolatum, petroleumgel, wit	Spectrum	P1037
Borosilicaat glazen capillaire buisjes. OD: 1,2 mm, ID: 0,9 mm, lengte: 10 cm.	Sutter Instrument	B120-90-10
Naaldtrekker P-87	Sutter Instrument
Stemi 2000 stereomicroscoop	Zeiss
Axiozoom V16, stereo zoom microscoop	Zeiss