Optimalisatie van Laser-Capture Microdissection voor de isolatie van darmen Ganglia van menselijk weefsel vers bevroren

Summary

Het doel van dit protocol is het verkrijgen van hoge-integriteit RNA monsters van darmen ganglia geïsoleerd van nietgefixeerde, vers gereseceerd menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM). Dit protocol omvat voorbereiding van monsters van menselijke intestinale weefsels, cryosectioning, ethanolbevattend kleuring en uitdroging, LCM, flash-bevroren en RNA extractie.

Abstract

Het doel van deze methode is te verkrijgen van hoge-integriteit RNA monsters van darmen ganglia verzameld uit losse, vers gereseceerd menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM). We hebben geconstateerd dat vijf stappen in de workflow die cruciaal zijn voor het verkrijgen van RNA isolaten van darmen ganglia met voldoende kwaliteit en kwantiteit voor RNA-seq. Ten eerste, bij de voorbereiding van intestinale weefsel, moet elk monster alle overtollige vloeistof verwijderd door bevlekken voorafgaand aan het sereus vlies zoveel mogelijk over de bodem van grote basis mallen afvlakken. Monsters zijn dan snel bevroren bovenop een gier van droogijs en 2-methylbutane. Ten tweede, wanneer afdelen van het weefsel, is het belangrijk om te cryomolds plaatsen, zodat de intestinale secties parallel het volledige vliegtuig van de plexus myenteric, waardoor de opbrengst van de grootste oppervlakte van darmen ganglia per dia. Derde, tijdens de LCM, polyethyleen napthalate (PEN)-membraan dia's bieden de grootste snelheid en flexibiliteit in het overzicht van de niet-uniforme vormen van darmen ganglia bij het verzamelen van darmen ganglia. Ten vierde, voor verschillende visualisatie van darmen ganglia binnen secties, ethanol-compatibele kleurstoffen, zoals Cresyl Violet, bieden uitstekende behoud van RNA integriteit ten opzichte van waterige kleurstoffen. Tot slot, voor de extractie van RNA van vastgelegde ganglia waargenomen we verschillen tussen commerciële RNA extractie kits die leverde superieure RNA hoeveelheid en kwaliteit, terwijl het elimineren van verontreiniging van het DNA. Optimalisatie van deze factoren in het huidige protocol sterk versnelt de workflow en levert darmen ganglia monsters met uitzonderlijke RNA kwaliteit en kwantiteit.

Introduction

Deze methode is ontworpen om kwalitatief hoogwaardige RNA monsters van darmen ganglia van menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM) krijgen. Het protocol hier beschreven is geoptimaliseerd om te zorgen voor voldoende RNA kwaliteit en opbrengsten voor RNA sequencing (RNA-seq) en is bedoeld om te worden gebruikt met vers gereseceerd nietgefixeerde, flash-bevroren intestinale menselijk weefsel.

Functionele gastro-intestinale en gut motiliteit aandoeningen invloed op één van de vier mensen in de Verenigde Staten. De darmen zenuwstelsel (ENS), ook wel aangeduid als de tweede hersenen¹

Protocol

Alle protocollen die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Vanderbilt Universiteit institutionele Review Board (IRB).

1. voorbereiding voor weefsel aankomst

1. Juiste IRB goedkeuring te verkrijgen en te coördineren met menselijke orgaan donatie agentschappen te verkrijgen van vers gereseceerd, nietgefixeerde intestinale weefsel uit donoren die voldoen aan alle criteria van de onderzoek nodig zijn voor de studie.
   Opmerking: Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik met muizen en andere knaagdieren modellen.
   1. Onmiddellijk na resectie van elk intestinale segment, spoel de lumen met gekoeld PBS of weefsel-opslagmedium t....

Results

We hebben verschillende verbeteringen aan bestaande protocollen waarmee de relatief snelle collectie van darmen ganglia van menselijke intestinale monsters met behulp van LCM, voldoet aan de normen voor RNA-Seq. aangebracht Ten eerste, we geoptimaliseerd de snelle bevriezing van intestinale weefsel segmenten in grote basis mallen geplaatst op het oppervlak van een gier van droogijs in 2-MB (Figuur 1B). De beste succes tijdens cryosectioning e.......

Discussion

Met deze procedure kunt het efficiënt verzamelen van talrijke darmen ganglia als een bron voor het afleiden van RNA voor RNA-seq. Hier hebben we de processen die worden beschreven in de bestaande protocollen maximaal behoud van RNA integriteit versneld. Zoals alle stappen in deze procedure onderling afhankelijk zijn zijn, is het belangrijk dat alle kwesties vanaf het begin van de studie worden geëlimineerd en dat alle monsters bereid zijn zo op dezelfde manier aan elkaar mogelijk te verkrijgen van betrouwbare RNA-seq.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral-buffered formalin	Sigma	HT501128-4L
2-Methylbutane	Fisher	O3551-4
3-mL syringe	BD	309628
50-mL conical tubes, polypropylene	Corning	05-526B
Base molds 37x24x5mm, disposable	Electron Microscopy Sciences	5025511
Belzer UW  Cold Storage Solution	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM caps	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
Cling Wrap, Press’n Seal	Glad	N.A.
Cresyl Violet Acetate	Acros Organics	AC405760025
Cutting Board	Electron Microscopy Sciences	63308
Ethanol, 190-proof	Pharmco-AAPER	111000190
Ethanol, 200-proof	Pharmco-AAPER	111000200
Glass Microscope slides	Fisher	12-550-343
Gloves, extended cuff	Microflex	19010144
Gowns, surgical-disposable	Kimberly-Clark	19-088-2116
Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)	Nalgene	1335920B
Kimwipes (large)	Kimberly-Clark	34120
Kimwipes (small)	Kimberly-Clark	34133
Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Leica Cryostat Chuck, large,  40 mm	Southeast Pathology Instrument Service	N.A.
Light Microscope	Olympus	CX43
Microscope objective (20X)	Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17	N.A.
Microscope objective (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
Molecular Sieves	Acros Organics	AC197255000
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
PicoPure RNA extraction kit	Applied Biosystems	12204-01
Pellet Pestle	Kimble Kontes	4621973
PEN membrane LCM slides	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
RNase-free tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
RNA Extraction Kit "A" (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy  Micro kit)	Qiagen	74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Splash Shield, disposable faceshield	Fisher	17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp"	Fine Science Tools	14002-14
Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm)	Nalgene	190-2520
Tissue Freezing Medium	General Data Healthcare	TFM-5
Xylenes	Fisher	X3P1GAL