Methodenartikel

Optimalisatie van Laser-Capture Microdissection voor de isolatie van darmen Ganglia van menselijk weefsel vers bevroren

DOI:

10.3791/57762

⸱

14 juni 2018

 ,  , 
1Vanderbilt University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is het verkrijgen van hoge-integriteit RNA monsters van darmen ganglia geïsoleerd van nietgefixeerde, vers gereseceerd menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM). Dit protocol omvat voorbereiding van monsters van menselijke intestinale weefsels, cryosectioning, ethanolbevattend kleuring en uitdroging, LCM, flash-bevroren en RNA extractie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze methode is te verkrijgen van hoge-integriteit RNA monsters van darmen ganglia verzameld uit losse, vers gereseceerd menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM). We hebben geconstateerd dat vijf stappen in de workflow die cruciaal zijn voor het verkrijgen van RNA isolaten van darmen ganglia met voldoende kwaliteit en kwantiteit voor RNA-seq. Ten eerste, bij de voorbereiding van intestinale weefsel, moet elk monster alle overtollige vloeistof verwijderd door bevlekken voorafgaand aan het sereus vlies zoveel mogelijk over de bodem van grote basis mallen afvlakken. Monsters zijn dan snel bevroren bovenop een gier van droogijs en 2-methylbutane. Ten tweede, wanneer afdelen van het weefsel, is het belangrijk om te cryomolds plaatsen, zodat de intestinale secties parallel het volledige vliegtuig van de plexus myenteric, waardoor de opbrengst van de grootste oppervlakte van darmen ganglia per dia. Derde, tijdens de LCM, polyethyleen napthalate (PEN)-membraan dia's bieden de grootste snelheid en flexibiliteit in het overzicht van de niet-uniforme vormen van darmen ganglia bij het verzamelen van darmen ganglia. Ten vierde, voor verschillende visualisatie van darmen ganglia binnen secties, ethanol-compatibele kleurstoffen, zoals Cresyl Violet, bieden uitstekende behoud van RNA integriteit ten opzichte van waterige kleurstoffen. Tot slot, voor de extractie van RNA van vastgelegde ganglia waargenomen we verschillen tussen commerciële RNA extractie kits die leverde superieure RNA hoeveelheid en kwaliteit, terwijl het elimineren van verontreiniging van het DNA. Optimalisatie van deze factoren in het huidige protocol sterk versnelt de workflow en levert darmen ganglia monsters met uitzonderlijke RNA kwaliteit en kwantiteit.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode is ontworpen om kwalitatief hoogwaardige RNA monsters van darmen ganglia van menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM) krijgen. Het protocol hier beschreven is geoptimaliseerd om te zorgen voor voldoende RNA kwaliteit en opbrengsten voor RNA sequencing (RNA-seq) en is bedoeld om te worden gebruikt met vers gereseceerd nietgefixeerde, flash-bevroren intestinale menselijk weefsel.

Functionele gastro-intestinale en gut motiliteit aandoeningen invloed op één van de vier mensen in de Verenigde Staten. De darmen zenuwstelsel (ENS), ook wel aangeduid als de tweede hersenen1, is vaak in het midden van deze aandoeningen, zoals het speelt een cruciale rol in de homeostase van de darm en beweeglijkheid. Manipulatie van de beweeglijkheid van de darm is over het algemeen beperkt tot chirurgische resectie van de aganglionic/noncontractile weefsel, chronische dieet wijziging en/of medicijnen. Verrassend, de volledige transcriptoom van de volwassen ENS moet nog worden sequenced, sterk beperken ons vermogen om te identificeren van moleculen binnen de ENS die kunnen worden gericht farmaceutisch of gebruikt in stamcel-therapieën.

Er zijn relatief weinig methoden voor het isoleren van RNA van menselijke darmen ganglia. De eerste benadering, cel dissociatie2, vereist hoge incubatie temperaturen en lange incubatie tijden; zowel waarvan bekend is dat de aantasting van het RNA bevorderen en veranderen van de transcriptome2,3. Een alternatieve benadering, LCM, meer betrouwbaar transcriptome bewaart en beschermt RNA integriteit. Hoewel verscheidene studies hebben LCM gebruikt voor het verzamelen van de ganglia van vers bevroren menselijk intestinale weefsel4,5,6, deze benaderingen of werden gehinderd door de slechte RNA kwaliteit en kwantiteit, waren heel arbeidsintensief is, of benodigde wijziging van kleuring of RNA extractie technieken aan het werk in onze handen. Andere LCM protocollen ontworpen voor het behoud van RNA die werden gevonden in LCM product handleidingen aanvullende verbeteringen7,8, maar aanpassing nodig was geboden wanneer toegepast op het isolement van de darmen ganglia8, 9. om deze redenen, ontwikkelden we een geoptimaliseerde protocol op basis van deze middelen dat aanzienlijke hoeveelheden van hoog-integriteit RNA van menselijke darmen ganglia oplevert, heeft een relatief snelle workflow en produceert consistente resultaten over een grote het aantal monsters.

In deze studie presenteren wij een synopsis van geoptimaliseerde procedures die het isolement van hoge-integriteit RNA van darmen ganglia afkomstig uit gereseceerd intestinale menselijk weefsel vergemakkelijken. Onze methode bevat vijf belangrijke aspecten. Eerste vers gereseceerd, nietgefixeerde menselijke intestinale monsters moeten worden ontdaan op maat, hebben alle overtollige vocht verwijderd met een weefsel van het laboratorium en afgevlakt in een grote basis mal vóór het flash-invriezen bovenop een gier van droogijs en 2-methylbutane (2-MB). Tweede, histologische secties van darm moeten bereid zijn te verkrijgen van het volledige vliegtuig van de plexus myenteric op een dia, met een grote lading van darmen ganglia. Succes met deze stap is grotendeels afhankelijk van het voorbereidingsproces van weefsel. Ten derde, de niet-uniforme structuur van ganglia in de ENS vereist het gebruik van polyethyleen napthalate (PEN) membraan dia's6, die de grootste snelheid en precisie tijdens het LCM bieden. Vierde, ethanol-compatibele kleurstoffen, zoals Cresyl Violet, moeten worden gebruikt om RNA integriteit behouden blijft terwijl kleuring darmen ganglia. Laatst, het RNA extractieproces is essentieel voor een succesvol resultaat met RNA-Seq. We getracht een RNA extractie benadering die produceert hoge RNA integriteit, maximaliseert RNA opbrengsten bij het starten met kleine collecties van darmen ganglia elimineert DNA besmetting en behoudt zo veel RNA soorten mogelijk.

Tezamen, optimalisatie van deze factoren in de huidige studie sterk versnelt de workflow en levert monsters van darmen ganglia met uitzonderlijke RNA kwantiteit en kwaliteit. Resultaten zijn grotendeels overeen onder een omvangrijke groep van monsters, met vermelding van de samenhang van deze aanpak. Verder, wij zijn gewend deze benaderingen met succes tientallen van RNA samples uit de darmen ganglia volgnummer. De strategieën die gemarkeerd hier kunnen ook in grote lijnen worden aangepast voor het uitvoeren van de LCM van gewenste ganglia of kernen van de perifere en centrale zenuwstelsel en andere gevallen waarin het isolement van kwalitatief hoogwaardige RNA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle protocollen die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Vanderbilt Universiteit institutionele Review Board (IRB).

1. voorbereiding voor weefsel aankomst

  1. Juiste IRB goedkeuring te verkrijgen en te coördineren met menselijke orgaan donatie agentschappen te verkrijgen van vers gereseceerd, nietgefixeerde intestinale weefsel uit donoren die voldoen aan alle criteria van de onderzoek nodig zijn voor de studie.
    Opmerking: Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik met muizen en andere knaagdieren modellen.
    1. Onmiddellijk na resectie van elk intestinale segment, spoel de lumen met gekoeld PBS of weefsel-opslagmedium te verwijderen van de resterende luminal materiaal of ontlasting.
    2. Na het spoelen en teruggooi van afval in een geschikte biohazard recipiënt, onderdompelen van het weefsel in een voldoende hoeveelheid weefsel-opslagmedium (zoals 3 - 5 maal het volume van intestinale weefsel) en op te slaan in individueel gelabelde, waterdichte plastic containers, ondergedompeld in ijs of gekoeld tot gebruik).
    3. Proces het weefsel binnen 18-26 uur vanaf het moment van collectie om te voorkomen dat aanzienlijke aantasting van het RNA.
      Opmerking: Afhankelijk van de zuiverheid van de intestinale segment en de opslag, het mogelijk om onze voorgestelde termijn verlengen.
  2. Bereiden van alle materialen die nodig zijn voor menselijk weefsel collectie van tevoren, zoals aangegeven in dit protocol (Zie de Tabel van materialen voor meer gedetailleerde productinformatie). Zorg ervoor dat alle vereiste persoonlijke beschermingsmiddelen wordt gedragen te allen tijde.
  3. Bereiden droogijs emmers samen met een droog ijs drijfmest zoals in Figuur 1.
    1. Crush voldoende droogijs om te vullen 4 standaard circulaire ijs-emmers en een rechthoekige ijsemmer. Een van de standaard emmers moeten kleine (11 x 21 cm) laboratorium weefsels geplaatst op het oppervlak van het droogijs. Gebruik, indien mogelijk, nieuwe, ongeopende dozen van laboratorium weefsels.
    2. Maak een droogijs drijfmest door powderizing 2 L van droog ijs in een schone rechthoekige ijsemmer.
    3. Tel vooraf gekoelde 2-MB tot het oppervlak van het droogijs. Iets mengen en afvlakken van de drijfmest met behulp van een pipet tip vak cover oppervlak van de vorm van de drijfmest in een kanaal omgeven door grotere brokken van droogijs langs de zijkanten van de rechthoekige emmer.
    4. Plaats meerdere dunne tekstblokken droogijs langs de randen van de ijsemmer ter bevordering van een snellere bevriezing. Er moet ruimte voor ≥4 basis mallen losjes in de droogijs drijfmest emmer past op een bepaald moment.
      1. Stapel de ijsemmer binnen een ander rechthoekig ijsemmer gevuld optioneel, ¼ met droogijs. Deze positionering helpt beter isoleren de droogijs drijfmest en voorkomt de noodzaak van regelmatige aanpassingen van droogijs en 2-MB tijdens de procedure.
    5. Positie van de droog-ijs-emmers in een assemblagelijn in de volgende volgorde: 1) droge drijfmest ijsemmer, 2) laboratorium weefsel-droge ijsemmer, 3 & 4) normale droog ijs-emmers, 5) rechthoekige droog ijsemmer(Figuur 1).

2. voorbereiding van Flash-bevroren menselijke intestinale weefsel

Opmerking: Dit hele proces kan duren tussen 45-80 min per intestinale segment, afhankelijk van de kwaliteit van de intestinale weefsel. We raden ook aan het verzamelen van monsters van de kwaliteitscontrole om RNA kwaliteit en histologie voordat u verdergaat met de LCM te beoordelen.

  1. Vul een grote lade met nat ijs en chirurgische snijplanken bovenop de droogijs plaats.
  2. Chill een 500 mL en 100 mL bekers voor het opslaan van het weefsel en bijgesneden segmenten in koude opslagoplossing bij deze instelling. Vooraf chill base mallen op de snijplanken, zodat ze zijn klaar om te ontvangen van weefsel.
  3. Na ontvangst van vers intestinale weefsel, giet af de media waarin het weefsel wordt vervoerd en behouden in de vooraf gekoeld bekers. Voldoende ruimte is in deze bekers voor de tijdelijke opslag van de intestinale weefsel en bijgesneden segmenten, die zal worden voorbereid in opeenvolgende stappen.
  4. Snijd de intestinale segment tot een lengte van ongeveer 20 cm, waarin ruim voldoende weefsel (40-60 cm2) voor het genereren van RNA voor downstream toepassingen en kwaliteitscontrole monsters. Afhankelijk van de integriteit van weefsel, is het mogelijk te bereiken van RNA isolatie voor downstream processing met een veel kleinere lengte (dat wil zeggen, 5 cm van de darm).
  5. Trim weg adipeus en het bindweefsel van de darm met behulp van chirurgische scharen. Resterende obesitas langs de intestinale sereus vlies in het gedrang brengt de mogelijkheid om volledig plat weefsel in opeenvolgende stappen. Zorgvuldig trimmen het weefsel, teneinde het sereus vlies tijdens het verwijderen van vet en bindweefsel, die structureel kan schade aan de plexus myenteric of maken van de buitenkant van het weefsel plat ongelijk voor afdelen plukt.
  6. Maak een longitudinale incisie langs de gehele lengte van de intestinale monster, bij voorkeur op de site van die bijlage.
  7. Ontleden weg en negeren de tenia coli van de dubbelpunt, zodat het gemakkelijker, worden afgevlakt op spanning wordt verlost.
  8. Splay de darm mucosa-zijde naar beneden op een gekoelde snijplank en snijd 1,25-cm-brede stroken van de volledige lengte van het weefsel.
    Opmerking: Intestinale weefsel vaak breidt na bijsnijden, zodat deze grootte moet dienovereenkomstig worden aangepast.
  9. Tijdelijk opslaan de strips in gekoeld weefsel-opslagoplossing.
    Opmerking: We gebruiken Belzer UW koude opslagoplossing, want het heeft een lange houdbaarheid, relatief kosteneffectief is en kan worden achtergelaten bij kamertemperatuur totdat het nodig is.
  10. Verwijderen van een strook weefsel uit de koude opslagoplossing en snijd het in segmenten ~1.5-2 cm lang.
  11. Snel wissen de intestinale segmenten op een stapel van laboratorium doekjes, verwijderen overtollige vocht en de vorming van ijskristallen langs de intestinale sereus vlies tijdens flash-bevriezing te voorkomen. Indien weefsel is niet voldoende gedroogd, zou het moeilijk te verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige secties van de myenteric plexus zal zijn.
  12. Leg de volgelopen stukken van intestinale mucosa-kant omhoog op een vooraf gekoeld, grote, wegwerp plastic basis mal (37 x 24 x 5 mm).
  13. Zorgvuldig afvlakken elk segment door licht het weefsel die zich uitstrekt over het oppervlak van de base schimmel en het gebruik van pincet gebogen zachtjes druk naar beneden en verdrijven alle luchtbellen die onder het sereus vlies kunnen worden onderschept. Merk op dat het weefsel terwijl afvlakken breidt. Indien nodig, trim de segmenten en snijd de overige monsters op een kleiner formaat.
    Opmerking: Als het weefsel overbelast is, zal dit de plexus myenteric verstoren. Nadat alle luchtbellen zijn verwijderd, beoordelen de dikte van het monster vóór bevriezing. Indien nodig, de randen van het specimen naar binnen duwen totdat de intestinale monster de oorspronkelijke dikte benadert.
  14. Plaats het geladen basis schimmel op het oppervlak van het droogijs, 2-MB drijfmest. Het weefsel moet volledig bevriezen binnen 30-60-s, afhankelijk van de grootte en de dikte van de intestinale segment.
  15. Droog de onderkant van de base schimmel verwijderen van resterende 2-MB door wrijven snel de basis schimmel op de weefsels van de laboratorium vooraf gekoeld in de tweede emmer van droogijs.
  16. Het gedroogde monster overbrengen in het derde bad van droogijs en begraven onder de oppervlakte van het droogijs totdat het is klaar om te worden verpakt.
  17. Snel observeren de onderkant van de base schimmel voorafgaand aan zeewieren, onderzoek naar de kwaliteit van de bereiding van de monsters. Noteer alle voorbeelden die worden niet weergegeven in platte of hebben grote luchtbellen, zoals deze voor cryosectioning en LCM moeten worden vermeden.
  18. Wikkel het monster in vooraf gelabelde aluminiumfolie die wordt gelegd op droog ijs in een emmer zodat inwikkeling van weefsel optreedt terwijl volledig bevroren worden gehouden.
  19. Wikkel het monster met een laagje plastic omslag, tot een minimum beperken van weefsel uitdroging tijdens de opslag bij-80 ° C.
  20. Monsters in de rechthoekige emmer opslaan totdat ze klaar om te worden verplaatst naar de vriezer.
  21. Vooraf label en vooraf chill vriezer vakken-80 ° C voor onmiddellijke opslag van de monsters na collectie.
  22. Neem een klein gedeelte van weefsel van elk intestinale segment voor beoordeling van RNA integriteit vóór het uitvoeren van de LCM.
    1. Label vooraf een 2-mL RNase-gratis buis voor elk segment, gevuld met ≥500 µL van lysis buffer. Het is raadzaam om met behulp van RNA extractie Kit "D", vermeld in de Tabel van materialen.
    2. Meng een kleine (2 x 2 mm) stuk van de darm in een standaard weefsel micro-homogenizer (20-40 s, totdat er geen stukjes weefsel blijven). Vervolgens bevriezen onmiddellijk het RNA lysate op droog ijs en winkel bij-80 ° C tot u verdergaat met RNA extractie.
    3. Eventueel insluiten enkele van de secties in weefsel bevriezing medium (TFM) als een back-up. Bereiden van weefselsecties in exact dezelfde manier beschreven in deze sectie, maar monsters in TFM binnen de basis mal voorafgaand aan flash-bevriezing dompelen.

3. Cryosectioning

  1. Voor cryosectioning, voorbereiden van alle benodigde materialen voor de kleuring en uitdroging en breng de gewenste weefselsteekproeven uit de diepvries-80 ° C in een emmer van droogijs.
  2. Voorbereiden van de cryostaat voor gebruik door op de optimale scherpe temperatuur (-18 tot-22 ° C) en vegen beneden oppervlakken met 100% ethanol en behandeling van het mes en borstel dienblad met RNase decontaminatie oplossing.
  3. Om het beste voldoen aan de chuck monster, gebruiken de volgende aanpak.
    1. Plaatsen van de verlostang in droog ijs voor ten minste 30 s voordat de intestinale monster uitpakken en plaatsen van het aan de oppervlakte van het droogijs sereus vlies-side-up.
    2. Giet een 3-5 mm grafheuvel van weefsel bevriezing medium (TFM) op een grote cryostaat monsterhouder en onmiddellijk overdracht de intestinale monster sereus vlies-side-up op de TFM.
    3. Snel overbrengen in de monsterhouder droogijs en bedek met powderized droogijs na waardoor de TFM vast te houden aan het monster voor 2-5 s bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de TFM onder het vlak van de plexus myenteric blijft.
      Opmerking: in het ideale geval het buitenoppervlak van de intestinale mucosa volledig voldoet aan de TFM voordat de TFM begint te bevriezen zonder ontdooien van het monster.
  4. Monteren van de monsterhouder in van de cryostaat specimen hoofd en uitlijnen van het model met de cryostaat mes, zodanig dat het vliegtuig van de myenteric plexus zal parallel aan het maaimes.
  5. De vectorafbeeldingsbestanden dikte aangezet de cryostaat tot 8 µm. Het doel van perfect het uitlijnen van het model is te verkrijgen van de grootst mogelijke oppervlakte van myenteric plexus op elke dia. Deze dikte wordt algemeen aanbevolen voor zowel menselijke als knaagdier weefsel, maar kan worden aangepast, indien nodig.
  6. Sectie door de sereus vlies en de Musculus longitudinalis tot het bereiken van de myenteric plexus.
    1. Voor het opzoeken van de plexus myenteric, monteren van een monster sectie op een dia en vlekken van de sectie met een waterige kleurstof, zoals 1% Cresyl violet of toluïdine blauw, enz.
    2. Zie de sectie onder een lichte Microscoop bij 40-2000 X vergroting te identificeren van de kruising tussen de lengterichting en spier-lagen. Microscoop parameters vindt u in de Tabel van materialen. Aan het begin van het segmenteren, zal het sereus vlies worden gekenmerkt door de aanwezigheid van bindweefsel. Sommige resterende mesenterische vet kan ook worden langs het sereus vlies aanwezig. Een blad van de buitenste Musculus longitudinalis laag dan begint. Zodra de grens tussen de lagen van de lengterichting en spier wordt bereikt, zal een deel van de darmen ganglia in acht worden genomen.
      Opmerking: In de volgende verschillende secties, de myenteric plexus zal blijken zeer, met grote zwaden van ganglia aanwezig binnen een enkele sectie (Figuur 2C). Als het weefsel aan het begin van het segmenteren niet volledig vlak is, dan is slechts een gedeelte van de ganglia zullen aanwezig zijn in elke sectie op een bepaald moment. Soms, wellicht de intestinale monster een inherent ongelijke myenteric plexus, ondanks het weefsel perfect vlakke verschijnen. Dit geldt met name voor monsters van de twaalfvingerige darm. In onze ervaring, deze monsters kunnen veel langer duren om te verwerken met de LCM, maar voldoende RNA kan worden verzameld in een enkele dag sessie. De exacte locatie van de plexus myenteric kan aanzienlijk variëren tussen monsters, gebaseerd op het weefsel en de voorbereiding voorafgaand aan invriezen.
  7. Beginnen met het verzamelen van seriële secties voor LCM, met optimale collecties, het grootste aantal neuronen en glia per dia. Afhankelijk van de oppervlakte van het monster, kunnen meerdere secties worden gecombineerd in een enkele dia PEN-membraan.
  8. Monteer de secties in PEN membraan dia's, gekoeld kort in de cryostaat voor 5-10 s. Bij het monteren, is het moet dat het weefsel slechts licht, smelt maximaal behoud van RNA integriteit.

4. vlekken

Opmerking: Voor een overzicht van de kleuring proces, verwijzen naar tabel 1. Alle oplossingen gebruikt worden bereid in standaard conische flesjes van 50 mL. Behandeling van de buitenkant van de buisjes met RNase decontaminatie oplossing lijkt niet te verbeteren van de resultaten (gegevens niet worden weergegeven).

  1. Een verzadigde oplossing van 4% Cresyl violet in 95% ethanol ten minste een dag van tevoren bereiden en volledig resuspendeer de Cresyl violet vóór het laden van de spuit.
    Opmerking: De concentratie van ethanol wellicht worden verlaagd voor effectieve kleuring, zoals beschreven in de sectie discussie. We hebben niet getest of RNA integriteit met behulp van 50% of 75% ethanol tijdens kleuring aanzienlijk vermindert. Cresyl violet is lichtgevoelig en dus moet worden beschermd tegen licht.
  2. Na montage secties van myenteric plexus in de dia verschijnt, onmiddellijk dompelen de dia in een conische flesje van 95% ethanol (vooraf gekoeld op-20 ° C) voor 30 s.
    1. Als de secties niet volledig aan de dia in de vorige stap voldoen, enigszins warm onderin de dia met een gehandschoende hand (het wissen van een laboratorium moet worden geplaatst tussen de dia en handschoen), voor volledige naleving vóór het dompelen in 95% ethanol. Deze oplossing kan worden hergebruikt voor ten minste 3-6 dia's zonder vermindering van de integriteit van het RNA.
  3. Leg de gezicht-omhooggaande dia op een lab veeg geplaatst bovenop een vooraf behandeld, RNase-gratis container-8.
  4. Vul vooraf een 3-mL injectiespuit met 4% Cresyl violet en hechten een 0,2-µm spuit filter.
    Opmerking: Het is raadzaam celluloseacetaat filters.
  5. 6-10 druppels van de vlek direct op het weefsel secties8 toepassen en incubeer voor 10-30-s, of totdat voldoende kleurstof blijft behouden wanneer-gekleurd. Terwijl de kleuring, zachtjes draaien de container van de dia met de hand om ervoor te zorgen dat de weefselsecties gelijkmatig zijn bekleed met een vlek.
  6. Giet af de vlek en de vlek onmiddellijk de dia in een flesje van 75% ethanol. Herhaaldelijk dompelen de dia totdat de overtollige kleurstof meestal off van het monster sijpelde heeft. Dit kan duren tussen 10-20 s.
  7. Finaliseer de kleuring door herhaaldelijk dompelen het monster in een flesje van 95% ethanol voor 10 s. Submerge het monster herhaaldelijk totdat alle overtollige vlek is verwijderd.
    1. Wijzig de duur van de destaining, waar nodig, voor het optimaliseren van de kleuring van de ganglia. Als teveel vlek is verwijderd, kan het monster wordt ook transparant en moeilijk te visualiseren
      Opmerking: Dit kleuring protocol is geoptimaliseerd op basis van verschillende publicaties5,8,10,11 die wijziging vereist voordat bevredigende resultaten werden verkregen. Dus, de concentratie van ethanol gebruikt in de kleurstof en tijdens de destaining moet worden gewijzigd, indien nodig, om een optimaal resultaat te verkrijgen.

5. uitdroging

  1. Onmiddellijk Dompel de dia in 100% ethanol 2 - 3 keer, voor een totaal van 10-20 s.
  2. Onderdompelen van de dia in watervrij 100% ethanol voor ten minste 30 s. Watervrij ethanol is erg hygroscopisch, moleculaire zeef (8-12 mesh) toevoegen aan de flacon van 100% ethanol voor de aanvang van de procedure voor het verwijderen van alle opgenomen water en dus meer volledig uitdrogen van het monster5.
  3. Herhaaldelijk Dompel de dia in xyleen voor 15-20 s. Deze stap wordt volledig verwijderd van de laag van ethanol op de dia. Moleculaire zeef tevoren aan de buizen van xyleen, om volledig adsorberen overtollige ethanol en water moleculen5toevoegen.
    Let op: Xylenen zijn ingedeeld als een irriterend voor de ogen en de bovenste luchtwegen en moeten worden gebruikt in een chemische zuurkast.
  4. De dia in xyleen (met moleculaire zeef, maaswijdte 8-12) voor ten minste 10 min. onderdompelen.
    Opmerking: Een korte pauze kan worden genomen nadat deze stap indien nodig. Monsters kunnen worden overgelaten in xyleen voor 4-5 uur zonder nadelige gevolgen aan kleuring, LCM of RNA opbrengst/integriteit.
  5. Optioneel, afzonderlijk bereiden verschillende extra dia's op dit punt. Als voorbereiding een tweede ronde van de dia na het voltooien van de LCM op alle voorbereide dia's, moet het weefsel in de cryostaat mogelijk worden refaced, als gevolg van uitdroging van het oppervlak van het weefsel. Één tot vier gedeelten wellicht moeten worden afgevoerd voordat bruikbaar secties kunnen worden verzameld.

6. de laser vangt Microdissection (LCM)

  1. Verwijder de dia uit xyleen en het drogen in een chemische zuurkast voor ten minste 1 min. invoegen een cartridge voor LCM caps de LCM Microscoop fase. Laden van de dia op het podium en de afbeelding van een overzicht van de dia te verwerven.
  2. Identificeren van de gewenste locatie voor LCM en een cap op de dia laden.
  3. Uitlijnen van de infrarood (IR) laser en aanpassen van zijn kracht en duur om te maken een diameter van 20-30 µm vangen plek.
  4. Zoek de ultraviolet (UV) laser en stel een passende snijsnelheid en intensiteit.
  5. Een overzicht van de gewenste ganglia worden verzameld met behulp van de software van de LCM, ervoor zorgend om blijven binnen de grenzen van de collectable gebied op het GLB (afgebeeld in het overzicht van de dia van het softwareprogramma als een groene cirkel).
  6. Pas in elk van de sporen, de IR-plekken zodanig dat er ten minste één IR spot elke 100-500 µm.
  7. Druk op de knop IR/UV gesneden om door te gaan met de collectie van alle gemarkeerde ganglia.
  8. Zodra collecties zijn voltooid, ofwel het GLB te verplaatsen naar een nieuwe locatie en herhaal het proces van het verzamelen of onderzoeken het LCM GLB op het QC-station zodra het GLB wordt voldoende gevuld met ganglia (of totdat de aanbevolen termijn van 60-80 minuten is bereikt).
  9. Als puin op het GLB aanwezig zijn, veeg het weg met een boete-tipped penseel dat is vooraf behandeld met RNase decontaminatie oplossing, gespoeld met water nuclease-vrij, en volledig gedroogd.
  10. Zorgvuldig onderzoeken van het GLB op het oog of met vergroting onder een Microscoop helder veld om alle puin is verwijderd. Als het puin kan niet worden verwijderd door gebruik te maken van de vooraf behandelde verfkwast, gebruikt u een fijne pipette uiteinde (RNase-vrij) om het puin weg te schrapen.
  11. Beveilig het GLB op een 0,5 mL microfuge buis gevuld met 230 µL van RNA lysis buffer (Buffer RLT uit RNA extractie Kit "B", met β-mercaptoethanol toegevoegd in een concentratie van 10 µL/mL).
  12. Omkeren van het GLB, kort vortex en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  13. Centrifugeer bij ≥ 5000 x g voor 5 min en dan overdracht de microfuge buis te droog ijs.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. RNA lysates kan worden achtergelaten bij-80 ° C zonder een duidelijke invloed op aantasting van het RNA voor ten minste 1 week. Als RNA isolatie wordt uitgevoerd op dezelfde dag, dan koelen de monsters op ijs totdat ze klaar voor extractie zijn.
  14. Alle extra collecties binnen de aanbevolen maximale termijn van 80-90 min uitvoeren nadat de dia is verwijderd van xyleen. Zoals de gedehydrateerde secties worden blootgesteld aan luchtvochtigheid, kan RNases geleidelijk worden gereactiveerd. Beperking van de periode kan dergelijke effecten te minimaliseren en maximaal RNA integriteit behouden blijft.

7. RNA isolatie

  1. Een werkstation RNase-gratis voorbereiden op RNA extracties.
  2. Alle buizen en reagentia volgens de handleiding voorbereiden door de RNA extractie Kit.
    Opmerking: Hoewel er veel kits beschikbaar voor RNA isolatie na LCM, we hebben beste succes met behulp van de RNA extractie Kit "B", opgenomen in de lijst van de materialen. Zie Figuur 5 voor een side-by-side vergelijking van RNA extractie reagentia.
  3. Verwijderen van monsters uit de diepvries-80 ° C en snel ontdooien in een waterbad 37 ° C.
  4. Onmiddellijk vortex ontdooid monsters voor 2-3 s gelijkmatig verdelen de guanidinium kaliumthiocyanaat zouten.
  5. Elk monster combineren met een gelijk volume van 70% ethanol. Zwembad 2 of meer lysates samen, indien nodig, tot een concentratie van RNA.
  6. Ga te werk volgens de aanwijzingen in de handleiding voor het proces van extractie van RNA, via het protocol geoptimaliseerd voor microdissected monsters.
  7. Elueer RNA bij de laatste stap in de minimale aanbevolen hoeveelheid nuclease-gratis water (14 µL).
  8. Naar aanleiding van RNA isolatie, aliquoot 1-2 µL van RNA van elk monster af in een nieuwe vooraf label RNase-gratis buis voor de beoordeling/kwaliteit kwaliteitscontrole met een microfluidics apparaat dat kleine hoeveelheden van RNA, zoals een Bioanalyzer kunt visualiseren. Aliquot een extra 1 µL in een aparte buis voor kwantificering met een hoog-gevoeligheids RNA kwantificering kit.
    1. Pas deze stappen, zo nodig, te verkrijgen van een voldoende hoeveelheid van RNA downstream p.a. (dwz., bundelen van een groter aantal LCM caps vóór RNA extractie).
  9. Winkel RNA bij-80 ° C tot het verzamelen van voldoende monsters voor downstream-analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben verschillende verbeteringen aan bestaande protocollen waarmee de relatief snelle collectie van darmen ganglia van menselijke intestinale monsters met behulp van LCM, voldoet aan de normen voor RNA-Seq. aangebracht Ten eerste, we geoptimaliseerd de snelle bevriezing van intestinale weefsel segmenten in grote basis mallen geplaatst op het oppervlak van een gier van droogijs in 2-MB (Figuur 1B). De beste succes tijdens cryosectioning e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met deze procedure kunt het efficiënt verzamelen van talrijke darmen ganglia als een bron voor het afleiden van RNA voor RNA-seq. Hier hebben we de processen die worden beschreven in de bestaande protocollen maximaal behoud van RNA integriteit versneld. Zoals alle stappen in deze procedure onderling afhankelijk zijn zijn, is het belangrijk dat alle kwesties vanaf het begin van de studie worden geëlimineerd en dat alle monsters bereid zijn zo op dezelfde manier aan elkaar mogelijk te verkrijgen van betrouwbare RNA-seq.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij zijn dankbaar aan de donoren en hun families die dit werk mogelijk gemaakt. Wij waarderen ook de hulp van medewerkers aan het International Institute of Medicine en Tennessee donorschap voor het helpen van de coördinaat collectie van weefsel in deze studie gebruikt. Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 tot EMS2 en toelage ondersteuning van NIH T32-DK007673 naar AMZ. We zijn dankbaar voor personeel van de Vanderbilt translationeel pathologie gedeelde Resource voor toegang tot de LCM Instrument en adviezen over de voorbereiding van het weefsel. De Vanderbilt weefsel pathologie gedeelde Resource wordt gedeeltelijk ondersteund door de NIH grants P30-CA068485-14 en U24-DK059637-13. Wij danken het genoom Technology Access Center in het departement van genetica aan de Washington University School of Medicine voor hulp bij genomic analyse. De GTAC is slechts gedeeltelijk ondersteund door NCI Cancer Center ondersteuning Grant #P30 CA91842 aan de Siteman Cancer Center en ICT/CTSA Grant #UL1TR002345 van het National Center voor onderzoek middelen (NCRR), een onderdeel van de National Institutes of Health (NIH) en NIH Routekaart voor medisch onderzoek. Deze publicatie is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs, en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van NCRR of NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% Neutral-buffered formalinSigmaHT501128-4L
2-MethylbutaneFisherO3551-4
3-mL syringeBD309628
50-mL conical tubes, polypropylene Corning05-526B
Base molds 37x24x5mm, disposableElectron Microscopy Sciences5025511
Belzer UW  Cold Storage SolutionBridge to LifeN.A.
CapSure Macro LCM capsArcturus, ThermoFisherLCM0211
Cling Wrap, Press’n Seal   Glad  N.A. 
Cresyl Violet AcetateAcros OrganicsAC405760025
Cutting BoardElectron Microscopy Sciences63308
Ethanol, 190-proofPharmco-AAPER111000190
Ethanol, 200-proofPharmco-AAPER111000200
Glass Microscope slidesFisher12-550-343
Gloves, extended cuffMicroflex 19010144
Gowns, surgical-disposableKimberly-Clark 19-088-2116
Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)Nalgene  1335920B
Kimwipes (large)Kimberly-Clark 34120
Kimwipes (small)Kimberly-Clark 34133
Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)ThermoFisherN.A.
Leica Cryostat Chuck, large,  40 mm Southeast Pathology Instrument ServiceN.A. 
Light MicroscopeOlympusCX43
Microscope objective (20X)Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17N.A.
Microscope objective (10X)Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-N.A. 
Molecular SievesAcros OrganicsAC197255000
Nuclease-free waterAmbionAM9937
PicoPure RNA extraction kitApplied Biosystems12204-01
Pellet PestleKimble Kontes4621973
PEN membrane LCM slidesArcturus, ThermoFisherLCM022
RNase-free tubes, 1.5 mLAmbionAM12400
RNaseZAP SigmaSigma-R2020
RNA Extraction Kit "A" (PicoPure)Applied Biosystems12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy  Micro kit)Qiagen74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol)Invitrogen15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit)Qiagen74134
Splash Shield, disposable faceshieldFisher17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp"Fine Science Tools14002-14
Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm)Nalgene  190-2520
Tissue Freezing MediumGeneral Data HealthcareTFM-5
XylenesFisherX3P1GAL

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
  2. Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226(2015).
  3. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36(2010).
  4. Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
  5. Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  6. Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276(2014).
  7. PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011).
  8. Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015).
  9. Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
  10. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  11. Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
  12. Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
  13. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42(2014).
  14. Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851(2014).
  15. Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
  16. Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
  17. Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17(2016).
  18. Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9(2009).
  19. Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
  20. Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  21. Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575(2015).
  22. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van enterische gangliamenselijk darmweefseloptimalisatie van RNA extractiePEN membraanpreparatencresylvioletkleuringcryostaatsectieslokalisatie van de myenterische plexusTFM inbeddingbeoordeling van RNA integriteit

Gerelateerde artikelen