Methodenartikel

Licht vel fluorescentie microscopie 4-dimensionale beelden van de gevolgen van het moduleren van Shear Stress op de ontwikkelingslanden Zebrafish hart

DOI:

10.3791/57763

⸱

10 augustus 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren ontwikkeling van harten in zebrafish in 4 dimensies (4-D). 4-D imaging, via licht-blad fluorescentie microscopie (LSFM), neemt de 3-dimensionale (3-D) beelden na verloop van tijd te reconstrueren ontwikkelende harten. Laten we kwalitatief en kwantitatief dat schuifspanning activeert endocardial Notch signalering tijdens de ontwikkeling van de zaal, die cardiale trabeculation bevordert.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hemodynamische krachten, ervaren door de hart invloed cardiale ontwikkeling, vooral trabeculation, die een netwerk van vertakkende uitwassen van het myocardium vormt. Genetische programma gebreken in de inkeping signalering trapsgewijs zijn betrokken bij ventriculaire gebreken zoals links ventriculaire Non-compactie cardiomyopathie of Hypoplastic links hart syndroom. Met behulp van dit protocol, kan het worden bepaald dat de schuifspanning gedreven trabeculation en Notch signalering zijn gerelateerd aan elkaar. Met behulp van licht vel fluorescentie microscopie, was visualisatie van het ontwikkelende zebrafish hart mogelijk. In dit manuscript, het was beoordeeld of hemodynamische krachten moduleren van de opening van trabeculation via Notch signalering en dus, invloed contractiele functie optreedt. Voor kwalitatieve en kwantitatieve schuintrekken spanningsanalyse, 4-D (3-D + tijd) beelden werden verworven tijdens de zebravis cardiale genuitdrukking en geïntegreerde licht-blad fluorescentie microscopie met 4-D synchronisatie veroverde de ventriculaire motie. Bloed viscositeit werd verminderd via gata1a- morfolino oligonucleotides (MO) micro-injectie te verminderen schuifspanning, daarmee Notch signalering en verzachtende trabeculation down-regulering. Co injectie van Nrg1 mRNA met gata1a MO gered Notch-gerelateerde genen om te herstellen van trabeculation. Om te bevestigen schuifspanning gedreven Notch signalering invloeden trabeculation, gearresteerd cardiomyocyte contractie verder via tnnt2a-MO om hemodynamische krachten, daarmee Notch doelgenen down-regelen om een niet-trabeculated myocard. Ten slotte werd datanauwkeurigheid van de expressiepatronen van shear stress-responsieve Notch genen uitgevoerd door endotheliale cellen te onderwerpen aan gepulseerde stroom. Dus, de microscopie van de licht-blad 4-D ontdekt hemodynamische krachten onderliggende Notch signalering en trabeculation met klinische relevantie voor non-compactie cardiomyopathie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomechanische krachten, zoals hemodynamische schuifspanning, zijn nauw betrokken bij cardiale morfogenese. In reactie op de hemodynamische schuintrekken krachten ontwikkelen myocardiale richels en groeven in een golf-achtige trabecular netwerk in afstemming met de richting van de schuifspanning over de atrioventriculaire (AV) ventiel1. Cardiale trabeculation is noodzakelijk om contractiele functie en myocard massa2te verhogen. Mutaties in Notch signalering trajecten leiden tot congenitale hartafwijkingen bij mensen en andere gewervelde dieren3. Bijvoorbeeld, is gata1a4 en tnnt2a5 morfolino oligonucleotides (MO) aangetoond dat het verminderen van Erytropoëse, terwijl Erytropoëtine (EPO) mRNA6 en Isoproterenol (ISO)7 rood bloed verhogen cellen en hartslag muur respectievelijk, en daarom schuifspanning (WSS). Bovendien, ErbB2 signalering, stroomafwaarts van de inkeping, bevordert cardiomyocyte proliferatie en differentiatie voor het genereren van contractiele force, die op zijn beurt activeert Notch signalering van8,9. Er wordt voorgesteld dat schuifspanning regelt Notch signalering gedreven trabeculation voor ventriculaire ontwikkeling. Op dit moment, er zijn vele studies die poging om verder te begrijpen de genetische programmering gebeurtenissen die leiden tot aangeboren hart gebreken (CHD)10,11,12, maar heel weinig zijn onderzoekt hoe mechanische krachten beïnvloeden de vorming hart.

Om te onderzoeken de mechanische krachten die op het endocard, nauwe waarneming tijdens de periode ontwikkelingsbehoeften worden uitgevoerd. Het is echter wel uitdagend om het verkrijgen van goede kwaliteitsbeelden van het in vivo verslaan monsters als gevolg van de verbondenheid van traditionele microscopie13. Om het observeren van de ontwikkeling na verloop van tijd in een steekproef, moeten fysieke segmenteren en kleuring, daarom optreden van13,14,15. Hoewel confocale microscopie veel gebruikt wordt om het imago van de 3D-structuur van monsters14,16, is deze beeldvormingssystemen overname nog beperkt door langzame digitaliseringsnelheden aan.

Licht vel fluorescentie microscopie (LSFM) is een unieke beeldvormende techniek die de visualisatie van in vivo dynamische evenementen met lang werkende afstand13 toelaat. Deze techniek maakt gebruik van een licht vel fluorescent microscopie optisch deel een monster17. Als gevolg van verlichting van alleen een dun blad van licht op de steekproef is er een vermindering in de foto-bleken en foto toxiciteit13,18. Het grote gebied van weergave en lange afstand zorgt voor grote monsters intact blijven zoals ze verbeelde13,14,17 zijn. De lage vergroting zorgt voor een groter gebied aan het image worden gemaakt, terwijl de lange afstand zorgt voor dikker monsters te worden zonder afbreuk te doen aan de signal-to-noise verhouding beeld. Veel groepen LSFM zijn gewend geraakt afbeelding hele embryo's17, hersenen14,18, spieren en hart19 onder andere weefsels, tonen van de verschillende soorten monsters die image kunnen worden gemaakt.

Hoewel eerder onderzoek aangetoond verminderde hemodynamische schuintrekken kracht door de instroom of uitstroom tracks van de zebravis hart occluding, is de informatie uitsluitend kwalitatieve. Dit resulteert in een abnormale derde kamer, verminderde cardiale looping en verminderde ventiel vorming20. De 4-D LSFM beelden geven een nieuw perspectief in de manier waarop die de hemodynamische schuintrekken dwingt invloed op de ontwikkeling van de cardiale weefsel. Deze mechanische krachten kunnen activeren kracht-gevoelige signalering moleculen en de vorming van de trabecular rimpels veroorzaken. Vanwege de toegevoegde tijd aspect voor 4-D imaging is het kundig voor bijhouden van wijzigingen in ontwikkeling in realtime, die kunnen leiden tot nieuwe onthullingen dat eerder onopgemerkt was gegaan. De zebravis is een ideaal model voor imaging omdat wetenschappers een hele gewervelde dier versus alleen cel-cel interacties kunnen observeren. Zuurstof kan ook diffuus door het gehele embryo, waarmee de ontwikkeling optreden zonder afhankelijk van het vaatstelsel, in tegenstelling tot bij zoogdieren ontwikkeling. Hoewel de zebravis hart de pulmonaire organen, waarvoor een vier-chambered hart ontbreekt, is er een groot aantal cardiale genen die tussen zebravis en mensen21zijn bewaard.

In dit manuscript beschrijven we het gebruik van licht-blad fluorescentie microscopie om het imago van de ontwikkelingslanden trabeculae in zebrafish hart onder verschillende omstandigheden. Ten eerste injectie van gata1a4 of tnnt2a5 Mnd werden gebruikt om lager de viscositeit van het bloed, en dus WSS. De morfologie van het hart werd vervolgens opgenomen. In een afzonderlijke groep van vissen, we de WSS verhoogd door het toedienen van de EOB mRNA6 of isoproterenol7 en de resultaten waargenomen. We voerde ook een onderzoek van de cel met een verschillende gepulseerde of oscillerende spuitsnelheid. Na elke groep imaging, vonden we dat WSS gevoeld door het endocard via Notch signalering ingewijden trabeculation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgende methoden werden uitgevoerd met inachtneming van UTA en UCLA IACUC protocollen. Deze experimentele groepen werden gebruikt met transgene Tg(cmlc2:gfp), de mutanten wea (zwakke atrium) of clo (cloche) : (a) wild-type (WT) controle, (b) gata1a MO en (c) tnnt2a MO injecties (tabel 1).

ModelNaamGemodificeerde genenFenotypeReferentie
ControleWild typeGeenN/B
TG(cmlc2:GFP)Cardiale myosin lichtkettingGroene flourescence specifiek uitgedrukt in het myocardium34
Verminderde muur Shear StressZwakke atrium (wea) mutantAtrium-specifieke myosin heacy kettingAtrium niet vatbaar, compacte ventrikel, dikke myocardiale muur, smalle lumen, dialated atrium,37
Cloche (clo) mutantN/BVolledige verwijdering van endocard, unaturally grote atrium met kleine ventrikel, onbestaande cardiale cushins41
gata1a MO gata1a Bloedarmoede door gebrek aan rode bloedcellen4
tnnt2a MOtnnt2a39
Verhoogde muur Shear Stress EOB mRNAGeenErnstige polycythemie, toename aantal circulerende bloedcellen, verhoogde viscositeit6
IsoprotenerolGeenCardiale tarief verhoogd7

Tabel 1: Zebravis beschrijvingen. Definities en omschrijvingen van de zebravis gebruikt in experimenten.

1. studie Setup

  1. Nrg1 en EOB mRNA voorbereiden door trabeculation redding.
    1. Menselijke Nrg1 cDNA verkrijgen en versterken van een donor-plasmide.
      Opmerking: De menselijke Nrg1 cDNA was begaafd van William Talbot van Stanford University.
      1. Nemen van nodige reagentia en materialen, namelijk PCR mastermix (opgeslagen in de-20 ° C), inleidingen (Zie tabel 2) (opgeslagen in de-20 ° C), een plaat van de PCR (bewaard bij kamertemperatuur) en een 20 μL Pipet (bewaard bij kamertemperatuur). Zie tabel met materialen voor voorbeeld producten.
        figure-protocol-1
        Tabel 2: Inleidingen voor Nrg1 klonen van mensen.
      2. Bereiden de mastermix voor elke primer instellenin drievoudige met behulp van de 20 μL pipet. Gebruik voor 1 set triplicates, 37.5 μL van de mastermix, 3 μL van DNA-gratis water, 4.5 μL van de primer. Voor meer triplicates, gewoon vermenigvuldigen met het aantal monsters.
      3. Verdun de werkoplossing menselijke Nrg1 cDNA (20 ng/μg concentratie) in de strook van de primer met DNA-gratis water zodat er 10 μL totaal per putje per monster.
        Opmerking: Ervoor zorgen dat elke oplossing onder stap 1.1.1 gelijkmatig wordt verdeeld. Doe dit door het mengen van elke oplossing door pipetteren omhoog en omlaag. Voorkom kruisbesmetting en gebruik een pipet tip voor slechts één voorbeeld.
      4. Aliquot Nrg1 cDNA met de 10 μL meerkanaals pipet aan gewenste putjes in de plaat PCR.
      5. 14,5 μL van de mastermix toevoegen aan de cDNA in de putjes. Een kleverige cover toepassen op de plaat van de PCR te verzegelen van de putten in de PCR-machine plaatsen.
      6. De PCR-machine start en zorgen dat de cyclus terechtkomt bij passende temperaturen volgens de enzymen en de inleidingen gebruikt.
    2. Nrg1 cDNA klonen in de plasmide pCS2+ op de BamHI en EcoRI sites met behulp van overtollige enzymen BamHI en EcoRI om cDNA is afgebonden in alle plasmiden.
      1. Meng de Nrg1 cDNA met de donor plasmide pCS2+, verkrijgbare master mix oplossing- en grondlagen (tabel 2).
        Opmerking: Het volume van de totale reactie moet 50 μl met 25 μL van master mix, 3 μL van inleidingen en 1 μL van 20 ng/μL donor plasmide met Nrg1 cDNA.
      2. Plaats de mix uit stap 1.1.2.1 in de PCR-machine en stel de parameters om te voldoen aan de volgende specificaties: 98 ° C voor 10 s 55 ° C voor 5 of 15 s en 72 ° C gedurende 5 s/kb.
      3. Het zuiveren van het PCR-product met behulp van een zuivering kit na instructies van de fabrikant. Elueer het product in 50 μl van elutie buffer.
      4. Verteren het gezuiverde PCR product en 5 μg pCS2+ met BamHI en EcoRI afzonderlijk bij 37 ° C gedurende 2 uur in een volume van 200 μl reactie. Zuiveren van de resulterende spijsvertering met een commerciële kit en elueer in 20 μL en 100 μl van Tris-HCl (pH 8,5), respectievelijk.
      5. Afbinden 4 μL van Nrg1 cDNA en 2 μL van de verteerd pCS2+ plasmide in 25 μL reactie met 1 μL van katalysator ligase bij 16 ° C's nachts.
        Opmerking: De procedure kan hier worden gestopt voor overnachting incubatie.
      6. Gebruik 2 μL van de afbinding oplossing uit stap 1.1.2.5 en de transformatie tot 50 μl van E. coli bacteriën cellen geschikt voor klonen (Zie Tabel van materialen).
    3. Bevestigen dat de transformatie plaatsvond door screening die nrg1 cDNA klonen met behulp van PCR. Klonen willekeurig kiezen en toevoegen aan een oplossing van specifieke primers, polymerase en deoxyribonucleotide trifosfaat (dNTPs).
      Opmerking: De controles waren de vector (pCS2+) met en zonder de insert (menselijke cDNA). Kies niet te groot van een kolonie omdat buitensporige bacteriën PCR remmen kunnen.
      1. Kies 8 kolonies van de transformatie en scherm pCS2+-Nrg1 klonen met behulp van de PCR inleidingen van tabel 2.
      2. Een kloon met Nrg1 cDNA te isoleren van de pCS2 cultuur+-Nrg1 plasmide DNA. Enten met 100 μl van E. coli bacteriën met pCS2+-Nrg1 plasmide in 100 mL van LB-media en cultuur door schudden (160-225 RPM) bij 37 ° C.
    4. Gezuiverde pCS2 transfect+-Nrg1 plasmide in HEK-293 cellen in een 6-well-plate met behulp van een commerciële transfectiereagens na instructies van de fabrikant.
    5. 24 uur na de transfectie, lyse de cellen met behulp van een lysis-buffermengsel doorlopen van een SDS-pagina gel, overbrengen in een gel-membraan en vervolgens vlek met anti-Nrg1 antistof22. Controleer of de Nrg1 eiwit expressie met behulp van een Western Blot.
      Opmerking: Het besturingselement is een lege pCS2+ plasmide. Kan hier worden gepauzeerd als gel membraan overdracht 's nachts gebeurt.
    6. Synthetiseren Nrg1 mRNA met behulp van een commercieel product vergelijkbaar met die in de Tabel van materialen en volg de instructies van de fabrikant.
      1. Neem 5 μL van de pCS2+-Nrg1 DNA uit de bacteriën geïsoleerd cultuur en verteren met kennisgevingen in de reactie van een 200 μl gedurende 2 uur bij 37 ° C aan het plasmide linearize.
      2. Zuiveren van de gelineariseerde plasmide met een commerciële kit en elueer in 20 μL van Tris-HCl (pH 8,5).
      3. In vitro transcriptie met een commerciële RNA isolatie kit in een reactie van de 20 μL 5 μL van de gelineariseerde plasmide na instructies van de fabrikant met het gedrag.
      4. Voeg dat de in vitro herschreven Nrg1 als 350 μL van RNA lysis-buffermengsel en vervolgens zuiveren met een RNA isolatie kit. Elueer de RNA in 60 μL van Tris-HCl (pH 8,5).
      5. Meten van de concentratie van RNA en opslaan bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.
    7. Volg de stappen 1.1.6.1 - 1.1.6.5 boven voor het EOB cDNA en mRNA voorbereiding maar kloon de cDNA in het plasmide pCS2 + EcoRI en XhoI sites in plaats daarvan.
  2. Morfolino injecteren zebravis
    1. Ontwerp23 de MO-injecties met behulp van een online tool (Tabel of Materials) tegen de volgorde van de ATG van gata1a4 (5 '-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3) en tnnt2a5 (5 '-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3).
    2. Gata1a en tnnt2a MO afzonderlijk toevoegen aan de nuclease-gratis water om de eindconcentraties van 8 ng/nL en 4 ng/nL, respectievelijk. Herhaal met EOB mRNA met een eindconcentratie van 20 pg/nL. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume 1 mL.
    3. Injecteren van 1 van de 8 ng/nL van gata1a MO en 1 nL nL voor de 4 ng/nL van tnnt2a MO in aparte zebrafish embryo's bij de 1 naar de 4-cel fase om ventriculaire muur schuifspanning (WSS)24. Het vergroten van WSS, injecteren 1 nL voor 20 pg/nL EOB mRNA6 in de zebravis embryo's in de fase 1 - 4-cel in.
  3. Chemisch behandelen zebrafish om trabeculation te remmen
    1. Met behulp van een precisiepipet van 20 mL, Verdun de 10 mg/mL AG1478 in 1% DMSO in E3 middellange tot een uiteindelijke concentratie van 5 μM op 30 hpf in een tube van 15 mL. Als een besturingselement, elke vis met 1% DMSO alleen te behandelen.
    2. Toevoegen van N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-butyl ester (DAPT) in 1% DMSO (100 μM) naar E3 medium in een tube van 15 mL voor de remming van de inkeping signalering bij 40 hpf op een soortgelijke manier. Als een besturingselement, behandelen met slechts 1% DMSO.

2. imaging technieken

  1. 4-D cardiale LSFM Imaging met synchronisatie algoritme
    1. 2D-beelden van het hele vis embryo overnemen door meerdere cardiale verslaan cycli met gebruik van de volgende stappen (Figuur 1). Zorg ervoor dat de licht-blad dikte ongeveer 5 μm is. 500 x-y-frames met een belichtingstijd van 10 ms. Set de z-virussoftware aan 1 μm voor lossless digitale bemonstering volgens de Nyquist bemonstering principe25nemen.
      1. Maak een agarose gel van 1% (m/v) door toevoeging van 1 g agarose tot 100 mL en verwarming het totdat alle agarose is opgelost. Een kleine plastic buis met het embryo en de agarose met behulp van een precisiepipet 20 μL laden en veilig op het podium.
      2. Open de afbeelding software weergeven en klik op Live om te zien de live view van het monster. Pas de doelstelling met behulp van de knop, zodat het monster in focus is. Op dezelfde manier verplaatsen de fase, zodat de live view van het monster de top van het embryo toont.
      3. Opnamen 500 keer voor 5 s bij 10 X vergroting met behulp van de Microscoop software26.
      4. Verplaats het werkgebied met de motor naar een nieuwe laag (1 micrometer in de z-as) en herhaal de imaging procedure.
      5. Herhaal bovenstaande 2 stappen totdat de gehele hart is volledig beeld.
    2. De gegevensintegriteit van de garanderen door rekening te houden met de beelden van de eerste en laatste cardiale cyclus. Vind de periode van de cardiale cyclus congruente beelden die zijn genomen op het zelfde tijdstip in de cardiale cyclus, maar in verschillende perioden. Gebruik de volgende vergelijking die is ontwikkeld om te zoeken naar de periode:
      figure-protocol-2(1)
      waar D de kosten-functie gebruikt is voor het aanbrengen van een periode hypothese, ikm het gevangen beeld, τ' de tijd het beeld gevangen werd genomen, zk de index z-richting van het beeld, xm is de vector van de pixel-index, en T' is de periodieke hypothese.
    3. De volgende vergelijking gebruiken om te vinden van de relatieve verschuiving tussen twee foto's in vergelijkbare stadia:
      figure-protocol-3(2)
      waar Qk', k duidt op een functie van de kosten voor de relatieve verschuiving, R is de mogelijke ruimtelijke wijk, L is de totale tijd van de opname, x is de pixel-index zk en zk' zijn de eerste en tweede z-richting plakjes, t is tijd en s is de relatieve verschuiving-hypothese.
    4. De relatieve verschuiving omzetten in absolute verschuiving ten opzichte van de eerste afbeelding en de lineaire vergelijking met behulp van de pseudo-omgekeerde benadering te vinden van de absolute relatie met de volgende sectie van beelden als eerder beschreven27uitlijnen oplossen.
    5. De laatste 4 D beelden werden verwerkt met behulp van beeld processing software (Tabel van materialen).
      1. 2D-afbeeldingen stapelen in 3-D
        1. Open een commerciële beeld processing software.
        2. Klik op Open Data.
        3. Selecteer alle beelden om te worden gestapeld in 3-D > Klik op laden.
        4. Voeg in de voxel grootte van 0,65 x 0.65 x 1 > Klik op OK.
        5. Schakel de Multi-Planar weergave in de 3D-beeld visualiseren.
        6. Met de rechtermuisknop op het vak van de blauwe slice_1.tiff > Kies weergave > Selecteer Volren.
        7. Klik op bewerken > Selecteer Opties > Selecteer bewerken kleurenkaart.
        8. De kleur met behulp van de vakken in een rood kader aanpassen > Klik op OK.
      2. 3-D omzetten in 4-D
        1. Klik op "bestand > openen van tijdreeksen.
        2. Selecteer de 3D-TIFF's die werden zojuist > Klik op laden.
        3. Voer dezelfde voxel grootte als vóór.
        4. Klik met de rechtermuisknop het blauwe slice_1.tiff vak > Selecteer "weergave" > Selecteer Volren.
        5. Klik op bewerken > Selecteer Opties > Selecteer bewerken kleurenkaart. De kleur met behulp van de vakken aanpassen > Klik op OK.
        6. Klik met de rechtermuisknop Serie tijdcontrole > Klik op Movie maker > druk op de knop afspelen om te kijken naar de film.
        7. Voeg een bestandsnaam, framegrootte, beeldfrequentie, kwaliteit gelijk is aan 1, typt u Monoscopic > Klik op toepassen
        8. Exporteren van de video. Open de video in een juiste software.

3. qRT-PCR analyse

  1. Zebravis hart van RNA isolatie om te kwantificeren Notch liganden, receptoren, en target genen expressies
    1. De zebravis offeren door hen te onderwerpen aan een overdosis tricaïne methylate28,29. Met behulp van een protocol van de eerder beschreven30, waren de zebravis harten weggesneden en voorbereid voor RNA isolatie.
    2. Isoleren van de totale RNA en synthetiseren cDNA met behulp van de cDNA synthese kit na instructies van de fabrikant.
    3. De PCR inleidingen ontwerpen voor de inkeping liganden Jag1, Jag2, Dll4, receptor Notch1ben signalering gerelateerde genen Nrg1 en ErbB2. Zie tabel 3 voor de inleidingen die we gebruikten.
    4. De inleidingen van stap 3.1.3, de geïsoleerde mRNA uit stap 3.1.2 en een commerciële mastermix toevoegen aan de PCR-plaat. Voer de qRT-PCR op de vereiste temperatuur en de tijden volgens de enzymen gebruikt. Normaliseren de resultaten zebrafish α-actine.
      Opmerking: Dit zal het berekenen van de niveaus van de expressie voor elk van de liganden, receptoren en genen.

4. in vitro menselijke aorta Endothelial cel (HAEC) experimenten

  1. Dynamische schuifspanning Model
    1. Cultuur HAEC cellen met HAEC voedingsbodems. Eenmaal volledig confluente, bloot de cellen laminaire flow en Pulsatiele stroom van 23 x 10-5 N debiet van 1 Hz gedurende 24 uur.
      1. Opwarmen van EG media/DMEM 10% FBS in een water bad voor 20 min.
      2. HAEC cellen ophalen met vloeibare stikstof tank en plaats de ampul in het waterbad tot gesmolten.
      3. Met behulp van een 1.000 μL Pipet, de ontdooide cellen verwijderen en leg ze in een tube van 15 mL met 3-5 mL van de media. Centrifugeer het cell-oplossing bij 53 x g gedurende 3 minuten.
      4. Gecombineerd de oplossing af en voeg voldoende media voor een totaal volume van 10 mL. De oplossing van de cel toevoegen aan een steriele kolf T75, de kolf van het GLB en distribueren van de cellen gelijkmatig over de bodem van de plaat.
      5. Mark de kolf met initialen, datum, celtype, en het nummer van de passage. Incubeer de kolf bij 37 ° C, 5% CO2, totdat de cellen zijn 80% heuvels. Vergeet niet om de media elke 2-3 dagen wijzigen.
      6. Het gebruik van een commerciële pomp, sluit de slang aan de kolf, en stel de parameters hierboven in stap 4.1.131,32,33.
    2. GI254023X toevoegen aan 50 mL HAEC medium bij een eindconcentratie van 5 μM gedurende 30 minuten.
    3. Met de vooraf gemengde GI254023X, een ADAM10-remmer die onderdrukt Notch signalering, voeren de dezelfde laminaire flow of Pulsatiele stroom experimenten zoals in 4.1.1.
    4. Kwantificeren van de inkeping liganden (Jag1, Jag2, en Dll4) en Notch doelgenen (harige en versterker van split [Hes]) met behulp van qRT-PCR voor vier groepen van HAEC monsters (laminaire flow, laminaire flow + GI254023X, Pulsatiele stroom, eerder beschreven Pulsatiele stroom + GI254023X)32.

5. rescue en overmatige uitdrukking van Inkeping signalering

  1. Injecteren van 1 nL van de voorbereide Nrg1 mRNA in een concentratie tussen 5 pg/nL (uit stap 1.1.6) in het stadium van de 1 - tot 4-cel met de gata1a MO om Notch doel genen24overexpress.
  2. Injecteren van 1 nL van de Nrg1 mRNA in wea mutant in een soortgelijke manier24.
  3. Dubbele de concentratie van Nrg1 mRNA (10 pg/nL) en injecteren24 1 nL in zebrafish te observeren de ventriculaire morfologie.
  4. Injecteren van 1 nL voor de 20 pg/nL EOB mRNA6 in de zebravis embryo's in de fase 1 - tot 4-cel uitbreiden van de Haematopoiese te verhogen van ventriculaire WSS24zo eerder te zien.
  5. Injecteren van 1 nL van de 50 μM Isoproterenol7, dat het tarief van contractility, aan het medium van de E3 gedurende 24 uur terwijl de zebravis verhoogt als eerder is laten zien24worden gekweekt.
  6. 4-D LSFM imaging voor elke groep uitvoeren. Volg de instructies in de stappen 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. kwantificering van fractionele verkorten en volume verandering in de tijd

  1. 4-D LSFM imaging uitvoeren voor elke groep bij 50, 75 en 100 hpf. Instructies in stappen 2.1.1-2.1.5.2.8. Verdeel elke afbeelding zodat elk 600 knooppunten te repliceren de beweging van de cardiale muur heeft.
  2. Het meten van de verandering in de diameter van het ventrikel tijdens de diastole en systole met de volgende formule:
    figure-protocol-4(3)
    Laden van 3D-ventriculaire beelden bij elke 0,1 s met visualisatie software en meet het volume.
  3. Uitzetten van de volumeverandering na verloop van tijd voor elke experimentele groep op 75 hpf en 100 hpf.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM werd gebruikt in dit manuscript om verwerven van hoge resolutie 2D en 3D-afbeeldingen. Zoals te zien in figuur 1A en 1B, regisseert de verlichting lens het lichte blad op het monster. Vanwege de dunheid van het lichte blad, slechts een enkel vliegtuig brandt. De detectie-lens is gepositioneerd loodrecht op de lens van de verlichting en is gericht op het verlichte vlak (figuur 1B). Het lichte blad van de verl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol hebben we aangetoond dat 4-D imaging kan worden gebruikt voor het bijhouden van de ontwikkeling van een trabecular netwerk in reactie op veranderingen in de biomechanische krachten. In het bijzonder initieert de shear stress ervaren door endotheliale cellen de inkeping signalering cascade, die op zijn beurt trabeculation bevordert. In dit manuscript, hebben wij aangetoond dat (1) gata1a MO injectie daalde Haematopoiese en daarom het minder muur shear stress, (2) tnnt2a MO injectie geremd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zou dank willen uitspreken aan William Talbot van Stanford University voor het verstrekken van de mens Nrg1 cDNA en Deborah Yelon van UCSD voor het verstrekken van de wea de mutanten. De auteurs ook bedank Cynthia Chen voor het helpen met Beeldacquisitie. Deze studie werd ondersteund door subsidies NIH HL118650 (T.K. Hsiai), HL083015 (naar T.K. Hsiai), HD069305 (naar NC Chi en T.K. Hsiai.), HL111437 (aan T.K. Hsiai en NC Chi), HL129727 (naar T.K. Hsiai), T32HL007895 (naar R.R. Sevag Packard), HL 134613 (naar V. Messerschmidt) en Universiteit van Texas systeem sterren financiering (J. Lee).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Clontech Hifi PCR pre-mix Takara 639298PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNAGift van William Talbot, Stanford University, Stanford, California, VSN/AGebruikt voor trabeculatie redding
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855201PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+GE HealthPlasmid gebruikt om mRNA te synthetiseren
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin zuiveringskit  Clontech740609.25DNA Zuivering
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase Clontech2011APCR Ligatie oplossing
1.1.2.5
Stellar competente cellenClontech636763E. coli cellen gebruikt voor transformatie
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfectiereagensLife Technologies11668027Transfectiereagens
1.1.4
mMessage SP6 kitInvitrogenAM1340Kit gebruikt om mRNA te synthetiseren
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini KitBio-Rad7326820Zuivert RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8GeneToolsN/ASoftware voor primer ontwerp
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNACreative BiogeneCDFH006026Verhoogt WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478Sigma-Aldrich T4182ErbB remmer
1.3.1
E3 mediumOm embryo's te laten groeien
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPTSigma-Aldrich D5942γ-secretase remmer
1.3.2
Agarose Sigma-Aldrich A9539Gebruikt voor het plaatsen van embryo's
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS cameraHamamatsu PhotonicsC11440-42UGebruikt om beelden vast te leggen
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira SoftwareFEI SoftwareN/AVisualiseerde en analyseerde beelden in 3D en 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylaat Sigma-Aldrich 886-86-2Gebruikt om embryo's humaan te sedateren of te doden
3.1.1
iScript cDNA Synthese KitBio-Rad1708890Synthetiseert cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifugeEppendorf05-400-005Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023XSigma-Aldrich 260264-93-5ADAM10 remmer
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochlorideSigma-Aldrich I5627Isoproterenol verhoogt WSS
5.1.5
MATLABMathworksN/AAnalyse van hartmechanica

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924(2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662(2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718(2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898(2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520(2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060(2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818(2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65(2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631(2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081(2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923(2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007(2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
  23. GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
  24. Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
  25. Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489(2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165(2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121(2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109(2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Trefwoorden

TrabeculatieNotch signalering4D beeldvormingGata1a morpholinoNrg1 mRNATnnt2a morpholinohemodynamische krachten

Gerelateerde artikelen