Zebravis zijn een natuurlijke Vibrio cholerae host en kan worden gebruikt om te recapituleren en de studie van de gehele besmettelijke cyclus van kolonisatie tot transmissie. Hier laten we zien hoe V. cholerae kolonisatie niveaus beoordelen en kwantificeren van diarree in zebrafish.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantificeren van de kolonisatie van Vibrio cholerae en diarree in het volwassen Zebrafish Model
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vibrio cholerae is het best bekend als het infectieuze agens dat ervoor zorgt dat de cholera van ziekten bij de mens. Buiten de menselijke gastheer bestaat V. cholerae hoofdzakelijk in het aquatisch milieu, waar deze met een scala aan hogere aquatische soorten samenwerkt. Gewervelde vis bekend is dat ze een milieu host en een potentiële V. cholerae reservoir in de natuur zijn. Zowel V. cholerae en de teleost vissoorten Danio rerio, kortweg zebrafish, zijn afkomstig uit het Indiase subcontinent, suggereren een langdurige interactie in aquatische milieus. Zebravis zijn een ideale modelorganisme voor het bestuderen van vele aspecten van de biologie, met inbegrip van besmettelijke ziekten. Zebrafish kan worden gemakkelijk en snel gekoloniseerd door V. cholerae na blootstelling in water. Intestinale kolonisatie door V. cholerae leidt tot de productie van diarree en de uitscheiding van gerepliceerde V. cholerae. Deze bacteriën kunnen uitgescheiden dan gaan koloniseren nieuwe vis hosts. Hier, laten we zien hoe te beoordelen V. cholerae-intestinale kolonisatie in zebrafish en hoe te kwantificeren V. cholerae-geïnduceerde zebrafish diarree. De kolonisatie-model moet zinvol zijn voor onderzoekers die studeren of genen van belang belangrijk voor de kolonisatie van de gastheer en/of milieu overleven zijn kunnen. De kwantificering van de zebravis diarree moet zinvol zijn voor onderzoekers bestuderen van een intestinale pathogenen die geïnteresseerd zijn in het verkennen van de zebravis als modelsysteem.
Inleiding
Vibrio cholerae is een aquatische, gram-negatieve bacterie, waardoor de cholera van ziekten bij de mens, alsmede de sporadische diarree1,2. V. cholerae wordt gevonden in het milieu in veel gebieden van de wereld, vaak geassocieerd met andere aquatische organismen. Deze associëren organismen bevatten plankton, insecten ei massa's, schelpdieren en vis van de gewervelde soorten3,4,5,6,7. Verschillende studies hebben geïsoleerd V. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Wayne State University. Deze methode werd voor het eerst beschreven in Runft et al. 12
1. bepaling van de niveaus van de intestinale kolonisatie
Opmerking: Intestinale kolonisatie is het nuttigste statistiek in het model van de zebravis als het kan worden gebruikt om de relatieve geschiktheid van verschillende V. cholerae stammen of de gevolgen van mutaties of gene uitsparingen te vergelijken.
- Inoculatie van zebravis door onderdom....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
V. cholerae kolonisatie van zebravis intestinale traktaten
Om een voorbeeld van de niveaus van de typische kolonisatie die we observeren, geënt wij 5 x 106 CFU van de pandemische EL Tor V. cholerae stam N16961 in 200 mL water in een bekerglas van verschillende zebrafish. Na 6 h van besmetting, waren de vissen in zoet water gewassen en overgebracht in een bekerglas van 200 mL gesteriliseerde met autoclaa.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De zebravis is een relatief nieuw model voor het bestuderen van V. cholerae maar houdt veel belofte voor de toekomstige ontdekking van voorheen onbekende aspecten van V. cholerae biologie en pathogenese11,12,13 . De volwassen zebrafish model heeft de voordelen van beide een natuurlijke V. cholerae host die intact, volwassen intestinale microbiota en een milieu-model bevat. Nadelen van het model zijn da.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dankzij het Melody Neely, Jon Allen, Basel Abuaita en Donna Runft voor hun inspanningen bij het ontwikkelen van de zebravis model. Het onderzoek hier gemeld werd gesteund door de National Institute of Allergy and Infectious Diseases van de National Institutes of Health onder award nummers R21AI095520 en R01AI127390 (voor Jeffrey H. Withey). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenisator | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weegmachine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Brander | |||
| automatische kolonieteller | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glazen bekers | Pyrex | ||
| geperforeerde deksels | Microtip houder met gaten van tipbox | ||
| wegwerp plastic lepels | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Vissen Tank Systeem | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Visnet | Marina | ||
| visvoer | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pinnen | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Pincet | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scharen | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml schroefdopbuizen | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glazen kralen | Bio Spec | 11079110 | |
| Glazen kralen voor verspreiden | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petrischaal | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1,5 ml centrifugebuis | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifugebuis | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Testbuizen | Pyrex | 9820 | |
| Glazen Pipet | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipetten | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean zouten | |||
| fosfaat gebufferde zoutoplossing | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloo-3-indolyl-β-D-galactopyranosid | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagens | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodienzuur | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucine van varkensmaag | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumine | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Eiwit Assay Reagens | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
Referenties
- Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
- Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (201....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
