Hier presenteren we een protocol voor antilichaam arrays om te identificeren van de wijzigingen in de signaalroutes in verschillende cellulaire modellen. Deze veranderingen, veroorzaakt door drugs/hypoxie/ultra-violet licht/straling, of overexpressie/Downregulatie/uitsparingen, zijn belangrijk voor verschillende modellen van de ziekte en kunnen aangeven of een therapie effect sorteren zullen of mechanismen van drugs kan identificeren weerstand.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beoordeling van weerstand tegen Tyrosine Kinase remmers door een ondervraging van signaaltransductie trajecten door antilichaam Arrays
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Kankerpatiënten met een afwijkende regeling van de proteïne fosforylatie netwerken worden vaak behandeld met de tyrosine-kinase-remmers. Berekening van responsrates bijna 85% zijn gemeenschappelijk. Helaas, patiënten vaak geworden vuurvaste op de behandeling door een wijziging van hun signaaltransductie trajecten. Een implementatie van de expressie profilering met microarrays kan het identificeren van de wijzigingen die over het algemeen mRNA-niveau, en proteomics herkent de algemene veranderingen in eiwitniveaus of herkent de eiwitten die betrokken zijn, maar de activiteit van de signaaltransductie trajecten kunnen alleen worden vastgesteld door het ondervragen van posttranslationele modificaties van de eiwitten. Dientengevolge, is de mogelijkheid om te identificeren of een medicamenteuze behandeling succesvol is of weerstand ontstaan, of de mogelijkheid te karakteriseren van eventuele wijzigingen in de signaalroutes, een belangrijke klinische uitdaging. Wij bieden hier een gedetailleerde uitleg van antilichaam arrays als een hulpmiddel dat systeembrede wijzigingen in verschillende posttranslationele modificaties (b.v., fosforylatie identificeren kan). Een van de voordelen van het gebruik van antilichaam arrays omvat hun toegankelijkheid (een matrix hoeft niet een expert in proteomics of dure apparatuur) en snelheid. De beschikbaarheid van arrays gericht op een combinatie van posttranslationele modificaties is de primaire beperking. Bovendien, wellicht onbevooroordeelde benaderingen (Fosfoproteomics) meer geschikt voor de nieuwe ontdekking, overwegende dat antilichaam-arrays ideaal voor de meest gekarakteriseerd doelstellingen zijn.
Inleiding
Klinische deimplementatie van de gerichte tyrosine kinase remmers (TKI) veranderd de behandeling van kanker door artsen voorzien van effectieve instrumenten te richten op de specifieke proteïnen die schijf neoplastische transformatie. Deze stoffen remmen of blokkeren de fosforylering van eiwitten doelwit van tyrosine kinases1,2. TKIs werden ontwikkeld, gedeeltelijk omdat genetische wijzigingen in verschillende sleutel signalering genen zijn voldoende om station kanker initiatie en progressie [bijvoorbeeld, epidermale groeifactor receptor (EGFR), oncogen tyrosine-proteïne kinase Src (SRC), BCR-ABL en m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. eiwit extractie
- Plaat 5 x 106 cellen op een 10 mm weefselkweek plaat (of kolf) in een weefselkweek kap. Cellen tellen op het moment van beplating met een automatische cel teller of hemocytometer. Anderzijds schatten de telling van de cel.
- Spoel de cellen geteeld op de 10 mm plaat (of kolf) grondig 3 x met 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH = 7.4). Zorg ervoor dat alle PBS verwijderen voordat u de lysis-buffermengsel toevoegt.
Opmerking: De lysis-buffermengsel is meestal voorzien van de kit. Als dat niet het geval is, gebruik dan een radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA), of elke andere cellysis-buffermengsel met....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om te onderzoeken van het effect van TKI weerstand op signaaltransductie trajecten in cellijnen, werden vier monsters geanalyseerd. Een controlemonster (H3255r1) en 3 TKI-resistente cellijnen (H3255r2-4) (Figuur 2) hadden betrekking op de plek antilichaam-sjabloon (Figuur 3). Alle 4 monsters werden opgesteld op basis van dit protocol. Zes phosphoproteins met differential activiteit werden gekozen voor de demonstratie van de analy.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Benaderingen die vele biologische uitlezingen combineren zijn inherent meer nauwkeurige representaties van de cellulaire machines in een experiment uitgevoerd. De komst van phospho-antilichaam matrices kan een snelle karakterisering van het patroon van wijzigingen die mogelijk meer informatief dan de status van de wijziging van elk één eiwit. De algemene workflow voor de toepassing van phospho-antilichaam matrices is gebaseerd op een wijziging in de serine en threonine tyrosine. In het volgende voorbeeld gericht op het k.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We zijn dankbaar voor de genereuze financiële steun van de Lawrence J. Ellison Instituut voor Transformatieve geneeskunde van USC (een geschenk aan David Agus). Wij waarderen de steun van herfst Beemer en Lisa Flashner die leiden tot de generatie en de publicatie van dit manuscript. Wij danken Laura Ng voor haar administratieve ondersteuning.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer voor eiwitextractie |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL voor naaldbehandeling van eiwitmonsters |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Humane fosfo MAPK-array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Humane fosfo kinase-array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Tischzentrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorptiometer voor eiwitkwantificering | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidine-conjugaat voor fluorescente detectie |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Weefselkweekkap |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Celteller |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | Sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institute JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
Referenties
- Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
- Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
