Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry

Summary

Hier beschrijven we een eencellige proteomic aanpak om te evalueren van immuun fenotypische en functionele (intracellulaire cytokine inductie) veranderingen in het perifere bloedmonsters geanalyseerd via massale cytometry.

Abstract

Cytokines spelen een centrale rol in de pathogenese van auto-immune ziekten. Vandaar, de meting van cytokine niveaus is de focus van meerdere onderzoeken in een poging om de precieze mechanismen die tot de verdeling van self-tolerance en latere autoimmuniteit leiden begrijpen. Benaderingen tot nu toe zijn gebaseerd op de studie van een specifiek aspect van het immuunsysteem (een single of paar celtypes of cytokines), en bieden niet een algemene beoordeling van ingewikkelde auto-immuunziekte. Terwijl de patiënt sera gebaseerde studies veroorloofd hebben belangrijke inzichten in autoimmuniteit, bieden ze niet de specifieke cellulaire bron van de dysregulated cytokines gedetecteerd. Een totaalaanpak van de eencellige te evalueren van cytokine productie in meerdere immuun cel subsets, in het kader van "intrinsieke" plasma van de patiënt-specifieke factoren, circulerende wordt hier beschreven. Deze aanpak maakt controle van de patiënt-specifieke immune fenotype (oppervlakte markeringen) en functie (cytokines), beide in de native "intrinsieke pathogene" ziekte staat, of in de aanwezigheid van therapeutische agenten (in vivo of ex vivo).

Introduction

Auto-immune ziekten zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit 3-8% van de bevolking. In de Verenigde Staten, auto-immune aandoeningen behoren tot de belangrijkste doodsoorzaken onder jonge en middelbare leeftijd vrouwen (leeftijden < 65 jaar)^1,2. Auto-immune aandoeningen worden gekenmerkt door heterogene Vaatwandpathologie en diverse onderliggende immunologische processen. Het spectrum van heterogeniteit is goed vertegenwoordigd in verschillende aandoeningen, zoals gezamenlijke betrokkenheid bij reumatoïde artritis (RA) en neurologische ziekte bij multiple sclerose (MS). Echter, dit niveau va....

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Colorado meerdere institutionele Review Board (COMIRB) van de Universiteit van Colorado. Alle onderstaande beschreven procedures moeten worden uitgevoerd in een steriele weefselkweek kap, tenzij anders aangegeven, met gefilterde Pipetteer tips, en alle reagentia gefilterd.

1. bereiding van reagentia voor perifere bloed verwerking

1. Bereiden ruxolitinib voorraad aliquots (10 – 15 μl/injectieflacon voor eenpersoonsgebruik) op 10 mM door verdunning van het gelyofiliseerd reagens in DMSO volgens de instructies van de fabrikant (winkel bij-80 ° C). DMSO concentraties in al....

Results

Figuur 1 toont de workflow voor de stimulatie en verwerking van de monsters van perifeer bloed, met inbegrip van de toewijzing van bloed monster aliquots, timing van de toevoeging van stimulatie agenten, eiwit transport remmer cocktail en incubatie maal totdat de lysis van de rode bloedcellen (RBC) en fixatie. De keuze van de stimulerende agenten zal afhangen van de signalering en cytokine trajecten die voor beoordeling gericht zijn. Bijvoorbeeld, in het prot.......

Discussion

Hier beschrijven we een roman, eencellige, proteomic aanpak gelijktijdig controleren meerdere soorten van immuun cellen en hun verschillende cytokine verstoringen op te sporen in de omgeving van de patiënt specifieke "pathogene" perifere bloed plasma circulerende factoren. Deze methode maakt gebruik van perifere bloed als het analytische voertuig, en de massale cytometry als instrument voor de evaluatie van immuun cellulaire fenotypische en functionele afwijkingen. De methode is gemakkelijk van toepassing op de mens en m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ruxolitinib	Santa Cruz	SC-364729A	Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM
R848	Invivogen	tlrl-r848-5	Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL
LPS-EK	Invivogen	tlrl-eklps	Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL
Sterile PBS	Lonza	17-516F
Lyse/Fix Buffer	BD biosciences	558049	Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)
BD Phosflow perm/wash buffer I	BD biosciences	557885	Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)
RPMI	Gibco	21870-076
Sodium Azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	S-8032	Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002
Protein Transport Inhibitor (PTI)	eBiosciences	00-4980-93	Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X
DNA Intercalator	Fluidigm	201192B	Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM
Cell Staining Media (CSM)			PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3
MaxPar Barcode Perm Buffer	Fluidigm	201057	Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
20-plex Pd Barcode Set	Fluidigm	S0014	Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
EQ TM Four Element Calibration Beads	Fluidigm	201078	Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
16% MeOH-free Formaldehyde Solution	Thermo	28908	Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)
Sterile round bottom polystyrene tubes	VWR	60818-496	Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Polypropylene cluster tubes	Light Labs	A-9001	Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Helios CyTOF instrument	Fluidigm	Helios	All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies used for Mass Cytometry
Surface markers
CD1c	Biolegend	L161	Mass: 161
CD3	BD	UCHT1	Mass: 144
CD4	Biolegend	SK3	Mass: 174
CD7	BD	M-T701	Mass: 149
CD8	Biolegend	SK1	Mass: 142
CD11b	Fluidigm	ICRF44	Mass: 209
CD11c	BD	B-ly6	Mass: 152
CD15	BD	HI98	Mass: 115
CD14	Biolegend	M5E2	Mass: 154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	Mass: 165
CD19	Santa Cruz	SJ25C1	Mass: 163
CD21	Biolegend	Bu32	Mass: 141
CD27	BD	L128	Mass: 155
CD38	Fluidigm	HIT2	Mass: 172
CD45 total	Biolegend	HI30	Mass: 89
CD45RA	Biolegend	HI100	Mass: 153
CD56	Miltenyi	REA196	Mass: 168
CD66	BD	B1.1/CD66	Mass: 113
CD86	Fluidigm	IT2.2	Mass: 150
CD123	Fluidigm	6H6	Mass: 143
CD278/ICOS	Biolegend	C398.4A	Mass: 156
CD179/PD1	Biolegend	EH12.2H7	Mass: 162
IgD	Biolegend	IA6-2	Mass: 146
IgM	Biolegend	MHM-88	Mass: 151
CXCR5	BD	RF8B2	Mass: 173
HLADR	Biolegend	L243	Mass: 167
Cytokines
IL-1α	Biolegend	364-3B3-14	Mass: 147
IL-1β	Biolegend	H1b-98	Mass: 169
IL-1RA	Santa Cruz	AS17	Mass: 157
IL-6	Biolegend	MQ2-13A5	Mass: 164
IL-8	BD	E8N1	Mass: 160
IL-12/IL-23p40	Biolegend	C8.6	Mass: 171
IL-17A	Biolegend	BL168	Mass: 148
IL23p19	eBioscience/Thermo	23dcdp	Mass: 176
MIP1β	BD	D21-1351	Mass: 158
MCP1	BD	5D3-F7	Mass: 170
IFNα	Miltenyi	LT27:295	Mass: 175
IFNγ	Biolegend	4S.B3	Mass: 165
PTEN	BD	A2B1	Mass: 159
TNFα	Biolegend	Mab11	Mass: 166
Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling  Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol.