Methodenartikel

Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry

DOI:

10.3791/57780

⸱

26 juni 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een eencellige proteomic aanpak om te evalueren van immuun fenotypische en functionele (intracellulaire cytokine inductie) veranderingen in het perifere bloedmonsters geanalyseerd via massale cytometry.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytokines spelen een centrale rol in de pathogenese van auto-immune ziekten. Vandaar, de meting van cytokine niveaus is de focus van meerdere onderzoeken in een poging om de precieze mechanismen die tot de verdeling van self-tolerance en latere autoimmuniteit leiden begrijpen. Benaderingen tot nu toe zijn gebaseerd op de studie van een specifiek aspect van het immuunsysteem (een single of paar celtypes of cytokines), en bieden niet een algemene beoordeling van ingewikkelde auto-immuunziekte. Terwijl de patiënt sera gebaseerde studies veroorloofd hebben belangrijke inzichten in autoimmuniteit, bieden ze niet de specifieke cellulaire bron van de dysregulated cytokines gedetecteerd. Een totaalaanpak van de eencellige te evalueren van cytokine productie in meerdere immuun cel subsets, in het kader van "intrinsieke" plasma van de patiënt-specifieke factoren, circulerende wordt hier beschreven. Deze aanpak maakt controle van de patiënt-specifieke immune fenotype (oppervlakte markeringen) en functie (cytokines), beide in de native "intrinsieke pathogene" ziekte staat, of in de aanwezigheid van therapeutische agenten (in vivo of ex vivo).

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auto-immune ziekten zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit 3-8% van de bevolking. In de Verenigde Staten, auto-immune aandoeningen behoren tot de belangrijkste doodsoorzaken onder jonge en middelbare leeftijd vrouwen (leeftijden < 65 jaar)1,2. Auto-immune aandoeningen worden gekenmerkt door heterogene Vaatwandpathologie en diverse onderliggende immunologische processen. Het spectrum van heterogeniteit is goed vertegenwoordigd in verschillende aandoeningen, zoals gezamenlijke betrokkenheid bij reumatoïde artritis (RA) en neurologische ziekte bij multiple sclerose (MS). Echter, dit niveau van heterogeniteit ook binnen een enkele stoornis, zoals systemische lupus erythematosus (SLE) wordt geïllustreerd: sommige patiënten kunnen presenteren met Renale pathologie, terwijl anderen van hematologic of gezamenlijke betrokkenheid3 last.

De onderliggende immunopathogenese in auto-immune aandoeningen komt overeen met de klinische heterogeniteit, met betrekking tot auto - en hyper-activering van meerdere aangeboren en adaptieve immuun cel subsets, en daarmee gepaard gaande dysregulated cytokine productie. Hoewel cytokines een centrale rol in de pathogenese van auto-immune ziekte spelen, heeft inzicht in hun specifieke rol in het mechanisme van de ziekte bewezen uitdagend. Cytokines worden gekenmerkt door Pleiotropie (een cytokine kan het hebben van meerdere effecten op verschillende soorten cellen), redundantie (meerdere cytokines kan hetzelfde effect hebben), dualiteit (een cytokine kan pro - of anti - inflammatory effecten onder verschillende omstandigheden hebben), en plasticiteit (cytokines kan worden gegoten in een rol die verschillend van de "originele", afhankelijk van de omgeving)4,5,6. Bijgevolg onderscheiden niet populatieniveau methoden heterogene cellulaire reacties op de dezelfde "cytokine milieu". Studie ontwerpen die zich richten op een specifiek aspect van het immuunsysteem (één celtype of cytokine), bieden ook niet een algemene beoordeling van alle elementen die betrokken zijn bij complexe auto-immuunziekte. Terwijl de patiënt sera gebaseerde studies veroorloofd hebben belangrijke inzichten in autoimmuniteit, bieden ze niet de specifieke cellulaire bron van de dysregulated cytokines gedetecteerd.

Onlangs, we een eencellige proteomic benadering om gelijktijdig controleren meerdere immuun celtypes, en sporen van hun verschillende cytokine verstoringen in de omgeving van de patiënt specifieke "pathogene" perifere bloed plasma circulerende factoren ontwikkeld. De hier beschreven werkstroom wordt gekenmerkt door het gebruik van intact perifere bloedmonsters, in tegenstelling tot geïsoleerde perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs). Perifere bloed vertegenwoordigt het meest fysiologisch desbetreffende voertuig te bestuderen van systemische immuun-gemedieerde ziekte, met inbegrip van 1) niet-mononucleaire bloedcellen vaak betrokken in de auto-immune ziekte (d.w.z., neutrofielen, bloedplaatjes), en 2) plasma factoren, zoals nucleïnezuren, immuuncomplexen en cytokines, circuleren die immuun activerend rollen hebben. Te vangen de "intrinsieke pathogene" dysregulated cytokine productie, perifeer bloed monsters worden verwerkt onmiddellijk na de loting van het bloed (T0, tijd nul), en na 6 uur incubatie bij 37 ° C (fysiologische lichaamstemperatuur) met een eiwit transport de Inhibitor van de omwenteling in het ontbreken van een exogene stimulerende aandoening (T6, tijd 6 h), om op te sporen van cytokine productie (accumulatie, T6-T0) dat bij de status van "intrinsieke" ziekte (Figuur 1 aansluiten zou). Om te studeren van dysregulated processen die weerspiegelen over of onder activering van signalering trajecten die betrokken zijn bij de immuunrespons die relevant zijn voor de ziekte, perifeer bloedmonsters zijn behandeld (6 uur incubatie bij 37 ° C met een eiwit vervoer-remmer) een exogene stimuleren van de voorwaarde dat weerspiegelt de pathogenese van de ziekte, zoals Toll-Like-Receptor (TLR) agonisten in het geval van SLE (T6 + R848, tijd 6 h met 1 µg/mL R848), op te sporen van cytokine productie die bij een reactie op nucleic zuren aansluiten zou (T0 vs. T6 vs. T6 vergelijken + R848, Figuur 1). Studeren immunomodulerende effecten van beschikbare therapeutics ex vivo, aangezien ze betrekking op de precieze immuun dysregulated processen voor specifieke patiënten hebben, worden perifeer bloedmonsters behandeld met een JAK-remmer bij de relevante therapeutische concentratie (hier, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tijd 6 h met 5 uM ruxolitinib), aan de opsporing van wijzigingen in "intrinsieke" ziekte staat naar aanleiding van de drug (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, Figuur 1). Een JAK-remmer werd gekozen voor deze studie omdat JAK-remmers is gebleken dat succesvol te zijn in de behandeling van auto-immune aandoeningen zoals RA.

Om tegelijkertijd het evalueren van de processen van de dysregulated in meerdere immuun cel subsets perifeer bloedmonsters van SLE hierboven beschreven werden patiënten en gezonde controles verwerkt zoals hierboven beschreven en geanalyseerd door massale cytometry. Massa cytometry, ook bekend als Cytometry-Time-Of-Flight, biedt eencellige analyse van meer dan 40 parameters zonder problemen van spectrale overlap7,8,9. Deze techniek maakt gebruik van zeldzame aarden metalen isotopen in de vorm van oplosbare metaalionen als tags gebonden aan antilichamen, in plaats van fluorophores10. Aanvullende gegevens met betrekking tot de massa cytometry technologische platform (dat wil zeggen, tuning en kalibratie, monster overname) kunnen worden gevonden in Leipold et al. en McCarthy et al. 11 , 12 de hoge-dimensionaliteit van massale cytometry waardoor gelijktijdige meting van meerdere cytokines in aangeboren en adaptieve immuun cel subsets met eencellige granulariteit (Tabel van materialen).

Huidige conventionele klinische en laboratorium parameters zijn vaak niet gevoelige of specifiek genoeg is voor het opsporen van voortdurende ziekte-activiteit of het antwoord op de specifieke immunomodulators13, als gevolg van de noodzaak om het beter af te bakenen de onderliggende immuun wijzigingen die flare-ups rijden. Gezien de alomtegenwoordigheid van cytokine disregulatie in auto-immuunziekte, een overvloed aan behandeling benaderingen die gebruikmaken van antilichamen of kleine moleculaire remmers targeting cytokines of signalering eiwitten die betrokken zijn in de regulatie van cytokine productie hebben onlangs naar voren gekomen. In zijn elementaire vorm biedt de hier beschreven perifeer bloed analytische aanpak een platform om patiënt-specifieke dysregulated cel subsets en hun abnormale cytokine productie in auto-immune ziekten met systemische weerslag te identificeren. Deze methode zorgt voor de personalisatie van therapeutische keuzes, zoals specifieke dysregulated cytokines kunnen worden geïdentificeerd, en specifieke behandeling opties kunnen ex vivo getest te beoordelen van hun vermogen om te immunomodulate de patiënt specifieke ziekte proces.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Colorado meerdere institutionele Review Board (COMIRB) van de Universiteit van Colorado. Alle onderstaande beschreven procedures moeten worden uitgevoerd in een steriele weefselkweek kap, tenzij anders aangegeven, met gefilterde Pipetteer tips, en alle reagentia gefilterd.

1. bereiding van reagentia voor perifere bloed verwerking

  1. Bereiden ruxolitinib voorraad aliquots (10 – 15 μl/injectieflacon voor eenpersoonsgebruik) op 10 mM door verdunning van het gelyofiliseerd reagens in DMSO volgens de instructies van de fabrikant (winkel bij-80 ° C). DMSO concentraties in alle tests met inbegrip van ongestimuleerde controles minder dan 0,2% (vol/vol) houden
  2. Bereiden van R848 (resiquimod) voorraad aliquots (10 – 15 μl/injectieflacon voor eenpersoonsgebruik) bij 1 μg/μL door verdunning van het gelyofiliseerd reagens in steriel water als de per de instructies van de fabrikant. Winkel bij-80 ° C.
  3. Lipopolysaccharide (LPS) voorraad aliquots (5 μL per flacon voor slechts één keer wordt gebruikt) op 1 μg/l bereid door verdunning van het gelyofiliseerd reagens in steriel water volgens instructies van de fabrikant. Winkel bij-80 ° C.
  4. De cel kleuring Media (CSM) met behulp van PBS, 0,5% BSA en 0,02% NaN3voor te bereiden.
  5. Verwerven en de eiwit vervoer remmer (PTI) cocktail (Tabel of Materials) klaar te houden.
  6. Ontdooien en Verdun de ruxolitinib voorraad flacon (10 mM) 1:10 in steriele PBS (1 mM). Gereserveerd bij kamertemperatuur in een weefselkweek kap.
  7. Ontdooien en Verdun de R848 voorraad flacon (1 μg/µL) 1:10 in steriele PBS (0.1 μg/µL). Gereserveerd bij kamertemperatuur in een weefselkweek kap.
  8. Ontdooien en Verdun de LPS voorraad flacon (1 μg/µL) 1:100 in steriele PBS (0,01 μg/µL). Gereserveerd bij kamertemperatuur in een weefselkweek kap.
  9. Vooraf warm steriele RPMI (geen L-glutamine) in een waterbad standaard 37 ° C (voor minstens 10 min).
  10. Verdun de lyse/fix buffer door 1:5 in gefilterde ddH2O (werken concentratie) op de benchtop (hoeft niet te worden steriel).
    Opmerking: vereist 1 mL bloed 20 mL werken concentratie van lyse/fix buffer.
    1. Maken van lyse/fix buffer voor 5 voorwaarden voor 1 mL volbloed elke (minstens 100 mL). Aliquot 20 mL van de concentratie van de werken van lyse/fix buffer in de conische buizen 50 mL per milliliter van volbloed (Houd de lyse/fix oplossing bij 37 ° C, totdat het nodig is). De omstandigheden op de conische buisjes met lyse/fix buffer als volgt labelen: T0 (tijd nul), T6 + 5R (tijd 6 h met 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (tijd 6 h met 1 μg/mL R848), T6 + LPS (tijd 6 h met 0,1 μg/mL LPS), T6 (tijd 6 h).
  11. Label ronde onder steriele polystyreen buizen met caps en 1 mL microcentrifuge buizen met de dezelfde nomenclatuur zoals in stap 1.10.

2. stimulatie en verwerking van perifere bloed (Figuur 1)

  1. Plaats de gelabelde ronde onderkant polystyreen buizen uit stap 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) op een rek.
    Opmerking: Al de volgende stappen worden uitgevoerd in dit soort buis tenzij anders is bepaald. Cap de buizen bij het overbrengen van tussen de weefselkweek kap en incubator te handhaven van de steriliteit.
  2. Voeg 1 mL van 37 ° C RPMI (geen L-glutamine) toe aan elk van de buizen (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). De bloed collectie buis meerdere malen omkeren, voeg 1 mL bloed aan elke buis en Pipetteer op en neer meerdere keren meng met RPMI (verdunning met RPMI verhindert samendoen van het bloed tijdens de incubatietijd van 6 h).
  3. Voeg 10 μL van de 1:10 ruxolitinib T6 + 5R. Meng met een pipet P1000. Plaats het rek van buizen in de incubator bij 37 ° C en beginnen timing de incubatie (T = 0).
  4. De T0-monster als volgt verwerken.
    1. Pipetteer de volledige inhoud van de T0-buis in een gelabelde conische buis met 20 mL van 37 ° C werken concentratie lyse/fix buffer. Spoel voor het optimaliseren van herstel van de cel, de buis met werken concentratie lyse/fix buffer. Meng door het omkeren van de conische buis.
    2. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten zodat lysis en fixatie. Voer alle volgende stappen bij de benchtop na fixatie. Centrifugeer cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Giet het supernatant. Resuspendeer de cellen in de koude PBS ijs te breken van de pellet 1 mL, vul dan de conische tot een volume van 15 mL met PBS.
    4. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Giet het supernatant. Herhaal de PBS wash (stappen 2.4.3–2.4.4) als pellets rood zijn. Resuspendeer de cellen in 1 mL van CSM te breken van de pellet, dan naar de gelabelde microcentrifuge buis (stap 1.11) voor het antilichaam kleuring. Neemt een 10 µL monster aan cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller of hemocytometer tellen.
      Opmerking: Aangezien alle cellen op dit punt worden opgelost, is het niet nodig om een vlek van de levensvatbaarheid.
    5. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De bovendrijvende vloeistof, waardoor de pellet in ~ 60 µL van restvolume gecombineerd. Houd deze pellet op ijs totdat monsters van andere voorwaarden hebt voltooid verwerking.
  5. Bij T = 30 min, de buis rack (stap 2.3) naar de weefselkweek kap en uitvoeren van de volgende handelingen uit.
    1. Voeg 10 μL van de 0.1 μg/μL R848 T6 + R848. Meng met een pipet P1000.
    2. Voeg toe 10 μL van de 0,01 μg/μL LPS aan T6 + LPS. Meng met een pipet P1000.
    3. 4 μL van eiwit vervoer remmer (voorraad bij 500 X) toevoegen aan T6, T6 + 5R, en T6 + LPS (maar niet naar T6 + R848) en terug van de monsters naar de incubator tot T = 6 h. Mix grondig met een pipet P1000 elke 2 h.
      Opmerking: R848 is een endoplasmic TLR-agonist en vereist bijgevolg een tijdelijke vertraging in de toevoeging van de eiwit-vervoer-remmer te voorzien in toegang tot haar doel-receptor.
  6. Op T = 2 h, 4 μL van eiwit vervoer remmer cocktail (voorraad bij 500 X) toevoegen aan de T6 + R848 buis. Meng alle monsters met een pipet P1000 en terug het rack naar de incubator tot T = 6 h.
  7. Meng de monsters met een P1000 nog een keer op T = 4 h.
  8. Op T = 6 h, verwerken T6, T6 + LPS T6 + R848 en T6 + 5R bloed monster buizen zoals beschreven in stap 2.4 voor de T0-monster.
  9. Bewaar de cel pellets in restvolume CSM-80 ° c te verwerken op een toekomstige datum. U kunt ook overgaan tot barcoding en antilichaam kleuring zonder op te slaan.

3. de Barcode van bloedcellen Lysed/vast

  1. Ontdooi de lysed/vaste celsteekproeven van de opslag-80 ° C langzaam op het ijs; een maximum van 20 monsters kan worden aangeduid met unieke barcodes en gebundeld met behulp van dit systeem. Verdun de 10 X barcoding perm buffer door 1:10 met PBS; het maken van genoeg buffer voor ~ 3 mL per monster.
  2. Vul één niet-steriele trog met de CSM en één met de 1 X barcoding perm buffer. Voeg vervolgens 1 mL van ijs koud CSM aan vers ontdooid samples, meng met een pipet en overbrengen naar de respectieve vooraf gelabelde polypropyleen cluster buizen.
  3. Neemt een 10 μL monster aan cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller of hemocytometer tellen. Normaliseren van de graven van de cel voor 1.5-2 x 106 cellen per monster in elke cluster buis: verwijderen en het volume van overtollige cellen boven 2 x 106 cellen negeren.
  4. Centrifugeer de cellen bij 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in 1 mL van de 1 X barcoding perm buffer met een meerkanaalspipet en centrifuge op 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gecombineerd uit het supernatant.
  5. Line-up de cluster buizen op een rek in dezelfde volgorde zoals aangegeven op de barcode-sleutel, zodat het monster overeenkomt met met de barcode. Voeg toe aan alle monsters in de cluster buizen 800 μL 1 X barcoding perm buffer door meerkanaalspipet zonder te raken de pellet van de cel met de uiteinden van de Pipet (geen menging) te verminderen cel verlies. Terzijde van het rek met de cluster-buizen.
  6. Verwijder 20-plex Pd Barcoding Kit buis strips van-20 ° C en ontdooien bij kamertemperatuur. Voeg 100 l 1 X barcoding perm buffer, meng en breng 120 μl van de geresuspendeerde barcode mix in de overeenkomstige celsteekproeven in de cluster buizen.
  7. Meng door meerkanaalspipet zodat er geen kruisbesmetting tussen individueel barcoded monsters. Incubeer cluster buizen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur toe de barcodes op het etiket van de cellen.
  8. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer in 1 mL van CSM.
  9. Centrifugeren en resuspendeer in CSM weer zoals in stap 3.8.
    Opmerking: Elk monster wordt nu aangeduid met een unieke barcode en monsters zijn klaar om te worden samengevoegd.
  10. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de bovendrijvende substantie gecombineerd. Met een enkele pipet en gebruik van de dezelfde tip, overdracht van alle cel pellets in ~ 70-80 μL restvolume aan één polystyreen buis. Het uiteinde van de pipet; verwijdert niet gereserveerd de één pipet met deze tip.
  11. Toevoegen met een meerkanaalspipet en nieuwe tips, ~ 100 μl CSM aan elke oorspronkelijke cluster buis te maximaliseren van de terugwinning van de cel. Met de één pipet met de tip dat opzij werd gezet, door alle cel pellets in ~ 100 μl restvolume te overbrengen in de dezelfde polystyreen buis.
  12. Het toevoegen van CSM naar boven uit de polystyreen buis (~ 3 mL). Graaf en record het nummer van de cel voor de gepoolde barcode ingesteld. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de bovendrijvende substantie gecombineerd. Ga verder met de monsters barcoded kleuring op dezelfde dag.
    Opmerking: Het is normaal te verwachten ~ 20-30% cel verlies in het barcoding proces.

4. vlekken van Barcoded vaste Lysed/bloedcellen en voorbereiding voor analyse op massale Cytometry Instrument

Opmerking: Elke 1 X titer van kleuring van antilichaam (1 μL van antilichaam per 100 μl kleuring reactie), meestal 3-4 x 106 cellen kan vlek. Daarom, wanneer alle barcoded monsters zijn samengevoegd in één buis, de hoeveelheid antilichaam moet worden opgeschaald. Als 20 barcoded monsters bedraagt 30 x 106 cellen, en elk 1 X titer kan 3-4 x 106 cellen vlek, vereist het monster barcoded slechts een 10 X titer, in tegenstelling tot de kleuring van elk monster individueel, die zou vereisen een 20 X hoeveelheid antilichaam (1 X per individuele buis). De concentratie van het antilichaam aan celaantal moet zorgvuldig worden getitreerd voor elke individuele antilichaam cocktail (hier niet besproken).

  1. Vlek de cellen met behulp van antilichamen (Tabel of Materials) voor oppervlakte kleuring en cytokine inductie.
    1. Maken door de berekening worden toegevoegd en de boekhouding voor pipetting fout met de oppervlakte kleuring cocktail (dat wil zeggen, als de kleuring van 20 barcoded monsters van 2 x 106 cellen in elk monster, een 10 X titer vlek is vereist; voor eindvolume berekeningen, compenseren pipetting fout door het maken van een 10.5 X laatste kleurstofoplossing).
    2. Voeg toe 10 X waard van oppervlak vlekken van volume dat u wilt de barcoded cel pellet. Ter vermindering van verlies van de cel, met de dezelfde tip, meng en meten van de hoeveelheid oppervlak vlekken en cel pellet.
    3. Op basis van het volume van cellen en vlekken cocktail, CSM aan een kleuring eindvolume van 50 μl per aantal celsteekproeven (dat wil zeggen, als een set van 20 monsters, 50 μl X 20 = 1 mL) toevoegen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Het monster iedere 15 minuten doorroeren om zelfs kleuring.
    4. Tijdens de oppervlakte vlek incubatie, bereiden de Perm/afwas buffer (Tabel van materialen) door verdunning 1:10 met gefilterde ddH2O. voorbereiden hoeveelheden van 2 mL voor permeabilization, en 5 mL voor wassen. Bewaren bij 4 ° C of op ijs.
    5. Boven uit het oppervlak vlekken van buis met CSM en centrifugeer bij 600 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. gecombineerd het supernatant. Resuspendeer de barcoded monster in 2 mL zuiver 4 ° C, 1:10 verdunning Perm/afwas buffer. Incubeer bij 4 ° C gedurende 20-30 minuten om volledig permeabilize van de cellen.
    6. Centrifugeer bij 600 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten en het supernatant gecombineerd.
    7. Voor het intracellulaire kleuring, stappen vergelijkbaar kleuring (wat betreft oppervlakte kleuring). Echter gebruiken de 4 ° C, 1:10 verdunning Perm/afwas buffer in plaats van de CSM om het totaal volume kleuring, zodat de cellen in een permeabilizing omgeving gedurende de intracellulaire kleuring blijven.
    8. Voeg het intracellulaire antilichaam cocktail aan het oppervlak gekleurd en permeabel cel pellet (stappen 4.1.2–4.1.17). Brengen het totaal volume naar 50 μl per aantal celsteekproeven kleuring. Incubeer gedurende 60 min bij 4 ° C. Het monster iedere 15 minuten doorroeren om ervoor te zorgen zelfs kleuring.
    9. Tijdens de intracellulaire kleuring, bereid de intercalatorethidium oplossing: 900 μL van gefilterde PBS + 100 μl van gefilterde 16% PFA (eindconcentratie van 1,6% PFA) + 0,2 μL van 500 uM van intercalatorethidium kleurstof (Tabel van materialen).
    10. Top af de cel pellet + intracellulaire antilichaam cocktail met koude 1:10 Perm/afwas buffer.
    11. Centrifugeer bij 600 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten, en het supernatant gecombineerd. Top af de kleuring buis met CSM. Tellen en noteer het nummer van de cel. Centrifugeer bij 600 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten, en het supernatant gecombineerd. Resuspendeer de cellen in 1 mL van de intercalatorethidium oplossing van stap 4.9. Incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur voor volledige bekomt, of overnacht bij 4 ° C (monsters in intercalatorethidium oplossing kunnen verblijf bij 4 ° C voor maximaal 1 week voordat u ze op de massale cytometry instrument).
  2. De cellen voor te bereiden voor de massale cytometry instrument.
    1. Top uit de buis met 3 mL gefilterde ddH2O en centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cellen in 3 mL gefilterde ddH2O. Pass deze schorsing door een 100 μm filter verwijderen puin of aggregaten die potentieel het massale cytometry instrument kunnen verstoppen.
    2. Tellen en registreren van de cel nummer na filtratie. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 min bij 4 ° C
  3. De kraal ijkoplossing (Tabel of Materials) voor te bereiden door verdunning het 1:10 in gefilterde ddH2O.
  4. Resuspendeer de gekleurde cellen in het vereiste volume van 1:10 kraal kalibreervloeistof voor de verwezenlijking van de concentratie van een cel ~ 1 x 106 cellen/mL verdund.
    Opmerking: Voor een CyTOF1 op 45 µL/min is het aanbevolen optimum 5 x 10,5 cellen/mL; voor Helios op 30 µL/min, 7,5 x 105 cellen/mL.
  5. Ga verder met het uitvoeren van het monster op de massale cytometry instrument9.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont de workflow voor de stimulatie en verwerking van de monsters van perifeer bloed, met inbegrip van de toewijzing van bloed monster aliquots, timing van de toevoeging van stimulatie agenten, eiwit transport remmer cocktail en incubatie maal totdat de lysis van de rode bloedcellen (RBC) en fixatie. De keuze van de stimulerende agenten zal afhangen van de signalering en cytokine trajecten die voor beoordeling gericht zijn. Bijvoorbeeld, in het prot...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een roman, eencellige, proteomic aanpak gelijktijdig controleren meerdere soorten van immuun cellen en hun verschillende cytokine verstoringen op te sporen in de omgeving van de patiënt specifieke "pathogene" perifere bloed plasma circulerende factoren. Deze methode maakt gebruik van perifere bloed als het analytische voertuig, en de massale cytometry als instrument voor de evaluatie van immuun cellulaire fenotypische en functionele afwijkingen. De methode is gemakkelijk van toepassing op de mens en m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zouden graag bedanken Aimee Pugh-Bernard voor haar intellectuele input en nuttige opmerkingen. Dit werk werd gesteund door de biomedische Research Award Boettcher Stichting Webb-Waring en getal K23-1K23AR070897 van de NIH tot Elena W.Y. Hsieh. Ze werd ook ondersteund door award aantal K12-HD000850 van het nationale Instituut van Eunice Kennedy Shriver Child Health en menselijke ontwikkeling en de Lucile Packard Foundation voor kinderen gezondheid, Stanford CTSA UL1 TR001085 en kind gezondheidsonderzoek Instituut van Stanford University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RuxolitinibSanta CruzSC-364729AStock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM
R848Invivogentlrl-r848-5Stock Conc: 1 μg/&/μL; Final Conc: 1 μg/mL
LPS-EKInvivogentlrl-eklpsStock Conc: 1 μg/&/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL
Steriel PBSLonza17-516F
Lyse/Fix BufferBD biosciences558049Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (verdunnen in ddH2O)
BD Phosflow perm/wash buffer IBD biosciences557885Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (verdunnen in ddH2O)
RPMIGibco21870-076
Sodium Azide (NaN3)Sigma-AldrichS-8032Stock Conc: >99,9%; Final Conc: 0,0002
Protein Transport Inhibitor (PTI)eBiosciences00-4980-93Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X
DNA IntercalatorFluidigm201192BStock Conc: 500 μM; Final Conc: 0,1 μM
Cell Staining Media (CSM)PBS + 0,5% BSA, 0,02% NaN3
MaxPar Barcode Perm BufferFluidigm201057Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
20-plex Pd Barcode SetFluidigmS0014Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
EQ TM Four Element Calibration BeadsFluidigm201078Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
16% MeOH-vrije Formaldehyde-oplossingThermo28908Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1,6% (w/v)
Steriel ronde bodem polystyreen buizenVWR60818-496Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Polypropyleen cluster buizenLight LabsA-9001Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Helios CyTOF-instrumentFluidigmHeliosAlle oplossingen die worden gebruikt in CyTOF-analyse moeten vrij zijn van metaalverontreiniging. ddH2O wordt gebruikt bij de bereiding van eventuele oplossingen en moet een weerstand van minimaal 18,0 MΩ.cm hebben. ddH2O en alle zelfbereide oplossingen moeten worden bewaard in nieuwe plastic of glazen flessen die nooit zijn geautoclaveerd.
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antilichamen gebruikt voor massa cytometrie
Oppervlaktemarkers
CD1cBiolegendL161Massa: 161
CD3BDUCHT1Massa: 144
CD4BiolegendSK3Massa: 174
CD7BDM-T701Massa: 149
CD8BiolegendSK1Massa: 142
CD11bFluidigmICRF44Massa: 209
CD11cBDB-ly6Massa: 152
CD15BDHI98Massa: 115
CD14BiolegendM5E2Massa: 154
CD16eBioscience/ThermoB73.1Massa: 165
CD19Santa CruzSJ25C1Massa: 163
CD21BiolegendBu32Massa: 141
CD27BDL128Massa: 155
CD38FluidigmHIT2Massa: 172
CD45 totaalBiolegendHI30Massa: 89
CD45RABiolegendHI100Massa: 153
CD56MiltenyiREA196Massa: 168
CD66BDB1.1/CD66Massa: 113
CD86FluidigmIT2.2Massa: 150
CD123Fluidigm6H6Massa: 143
CD278/ICOSBiolegendC398.4AMassa: 156
CD179/PD1BiolegendEH12.2H7Massa: 162
IgDBiolegendIA6-2Massa: 146
IgMBiolegendMHM-88Massa: 151
CXCR5BDRF8B2Massa: 173
HLADRBiolegendL243Massa: 167
Cytokines
IL-1αBiolegend364-3B3-14Massa: 147
IL-1βBiolegend H1b-98Massa: 169
IL-1RASanta Cruz AS17Massa: 157
IL-6BiolegendMQ2-13A5Massa: 164
IL-8BDE8N1Massa: 160
IL-12/IL-23p40Biolegend C8.6Massa: 171
IL-17ABiolegend BL168Massa: 148
IL23p19eBioscience/Thermo23dcdpMassa: 176
MIP1βBDD21-13

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
  2. Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
  3. Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039(2016).
  4. Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257(2009).
  5. Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
  6. Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
  7. Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
  8. Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
  9. Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  10. Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398(2012).
  12. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
  13. Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
  14. O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
  15. O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
  16. Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
  17. Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
  18. Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
  19. Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
  20. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
  21. Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425(2015).
  22. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
  23. Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
  24. Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  25. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
  26. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
  27. Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
  28. Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mass CytometryPeripheral BloodCytokine ProductionImmunophenotype AnalysisAutoimmune DiseaseSingle cell AnalysisBlood StimulationBarcoding ProtocolCell Surface MarkersProtein Transport Inhibitor

Gerelateerde artikelen