Hier presenteren we een protocol om te onderscheiden van de retinale pigment epitheel (RPE) cellen van menselijke pluripotente stamcellen rekening houdend met patiënt afkomstige mutaties. De mutant cellijnen kunnen worden gebruikt voor functionele analyses, met inbegrip van immunoblotting, immunofluorescentie, en patch klem. Deze aanpak van ziekte-in-a-schotel omzeilt de moeilijkheidsgraad van het verkrijgen van inheemse menselijke RPE cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Differentiatie, onderhoud en analyse van menselijke retinale Pigment epitheel cellen: een ziekte-in-a-schotel-Model voor BEST1 mutaties
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hoewel meer dan 200 genetische mutaties in het menselijk BEST1 -gen zijn geïdentificeerd en gekoppeld aan retinale degeneratieve ziekten, blijven de pathologische mechanismen ongrijpbare voornamelijk te wijten aan het ontbreken van een goede in-vivo -model voor het bestuderen van BEST1 en zijn mutaties onder fysiologische omstandigheden. BEST1 codeert een ionkanaal, namelijk BESTROPHIN1 (BEST1), die werkt in de retinale pigment epitheel (RPE); echter vormt de uiterst beperkte toegankelijkheid aan inheemse menselijke RPE cellen een grote uitdaging voor wetenschappelijk onderzoek. Dit protocol beschrijft hoe te genereren van menselijke RPEs, rekening houdend met BEST1 ziekte-veroorzakende mutaties door geïnduceerde differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs). Als hPSCs zelf hernieuwbare zijn, deze aanpak kan onderzoekers hebben een constante bron van hPSC-RPEs voor verschillende experimentele analyses, zoals immunoblotting, immunofluorescentie, en patch-klem, en biedt dus een zeer krachtige model van het ziekte-in-a-schotel voor BEST1-netvlies voorwaarden verbonden. Met name kan deze strategie worden toegepast om te studeren RPE (patho) fysiologie en andere genen van belang native uitgedrukt in RPE.
Inleiding
Het is gedocumenteerd die ten minste vijf retinale degeneratieve ziekten worden veroorzaakt door genetische mutaties in het BEST1 gen1,2,3,,4,5,6 , 7 , 8, met het aantal gerapporteerde mutaties al meer dan 200 en nog steeds groeiende. Deze BEST1-geassocieerde ziekten, ook bekend als bestrophinopathies, progressieve visie verlies en zelfs blindheid veroorzaken en er zijn momenteel geen d....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. differentiatie van hPSC aan RPE
- Onderhouden en passage hPSCs18zoals hiervoor is beschreven.
Opmerking: Alle cellen (met inbegrip van hPSCs en hPSC-RPEs) worden gekweekt in 37 ° C bij 5% CO2 gedurende de looptijd van de groei en differentiatie protocollen. -
Voorafgaand aan de differentiatie, splitsen confluente hPSCs aan vooraf gecoate 6-Wells-platen.
- Jas van platen, kelder membraan matrix op ijs gedurende ongeveer 1 uur ontdooien, schorten liquidized matrix in 4 ° C DMEM medium op een 1:50 verdunning, 800 µL coating mengsel toevoegen aan elk putje en incubeer gedurende ten minste 1....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De meest technisch uitdagende stap is de handmatige isolatie, die streeft naar een hoge zuiverheid van een gedifferentieerde P0 hPSC-RPE bevolking. Na een succesvolle isolatie, > 90% cellen in de P0 bevolking zal groeien en volwassen om handtekening RPE morphologies (Figuur 1 c) weer te geven. Het bestaan van een kleine gedeelte van niet-RPE of onrijpe RPE cellen in de P0 bevolking is bijna onvermijdelijk, maar zal niet interf.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De belangrijkste procedure voor de ziekte-in-a-schotel-benadering is om te onderscheiden van hPSCs met een ziekte-veroorzakende mutatie naar de juiste cel bloedlijn, oftewel RPE voor BEST1. Dus, na elk experiment van differentiatie, de resulterende hPSC-RPE-cellen moeten worden zorgvuldig gevalideerd voor hun volwassen status RPE-specifieke morphologies en eiwit markeringen16,17,18. U wilt minimaliseren klonale artefact.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit project werd gefinancierd door de NIH grants EY025290, GM127652 en Universiteit van Rochester start-up financiering.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
Referenties
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
