Methodenartikel

Snelle, schaalbare montage en laden van bioactieve eiwitten en Immunostimulants in verschillende synthetische Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

DOI:

10.3791/57793

⸱

11 augustus 2018

 ,  , 
1Interdisciplinary Biological Sciences, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanomaterialen bieden veelzijdige mechanismen van gecontroleerde therapeutische aflevering voor zowel basiswetenschap en translationeel toepassingen, maar hun fabricage vaak vereist expertise die niet beschikbaar is in de meest biomedische laboratoria. Hier presenteren we protocollen voor het schaalbare fabricage en therapeutische laden van uiteenlopende zelf gemonteerd nanocarriers met behulp van flash nanoprecipitation.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanomaterialen presenteren een breed scala van opties voor het aanpassen van de gecontroleerde aflevering van enkelvoudige en gecombineerde moleculaire payloads voor therapeutische en imaging-toepassingen. Deze verhoogde specificiteit kan belangrijke klinische gevolgen, met inbegrip van verminderde bijwerkingen en lagere doseringen met hogere potentie hebben. Bovendien, de in situ richten en gecontroleerde modulatie van specifieke cel deelverzamelingen kunnen verbeteren in vitro en in vivo onderzoeken van elementaire biologische fenomenen en sonde functie cel. Helaas, de daarvoor vereiste deskundigheid in nanoschaal wetenschap, scheikunde en techniek vaak verbieden laboratoria zonder ervaring op deze terreinen fabriceren en aanpassen van nanomaterialen als hulpmiddelen voor hun onderzoek of voertuigen voor hun therapeutische strategieën. Wij bieden hier protocollen voor de synthese en schaalbare vergadering van een veelzijdige niet-toxisch copolymeer bloksysteem vatbaar voor de facile vorming en laden van nanoschaal voertuigen voor biomedische toepassingen. Flash nanoprecipitation wordt gepresenteerd als een methode voor het snelle fabricage van diverse nanocarriers van poly(ethylene glycol) -bl-poly (propyleen sulfide) copolymeren. Deze protocollen zal toestaan laboratoria met een breed scala van deskundigheid en middelen om gemakkelijk en reproducibly fabriceren geavanceerde nanocarrier levering systemen voor hun toepassingen. Het ontwerp en de bouw van een geautomatiseerd instrument die gebruikmaakt van een high-speed-spuitpomp ter vergemakkelijking van de flash nanoprecipitation verwerken en om verbeterde controle over de homogeniteit, grootte, morfologie en laden van polymersome nanocarriers is beschreven.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanocarriers toestaan voor de gecontroleerde aflevering van kleine en macromoleculaire lading, waaronder actieve entiteiten dat als niet ingekapseld, zou een zeer afbreekbaar en/of voor toediening in vivote hydrophobic. Van de nanocarrier morphologies regelmatig vervaardigd, bieden polymere blaasjes analoog aan liposomen (ook wel polymersomes genoemd) de mogelijkheid voor het gelijktijdig laden van hydrofiele en hydrofobe lading1,2. Ondanks hun veelbelovende voordelen zijn polymersomes nog steeds zeldzaam in klinische toepassingen, gedeeltelijk vanwege enkele cruciale uitdagingen goed opgepakt in hun productie. Voor klinisch gebruik moeten polymersome formuleringen plaatsvinden in grootschalige, steriel en consistente partijen.

Een aantal technieken kan worden gebruikt om de vorm polymersomes van een copolymeer van diblock, zoals poly(ethylene glycol) -blok-poly (propyleen sulfide) (PEG -bl- PPS), die bevatten oplosmiddelen dispersie3, dunne film rehydratie1 , 4, microfluidics 5,6en directe hydratatie7. Oplosmiddel dispersie omvat lange incubatie tijden in de aanwezigheid van organische oplosmiddelen, die kunnen sommige bioactieve payloads, zoals eiwitten denatureren. Dunne film rehydratie biedt geen controle over de polydispersiteit van het gevormde polymersomes, vaak duurder en tijdrovender extrusie technieken om aanvaardbare monodispersity vereist. Bovendien zijn zowel microfluids als directe hydratatie moeilijk te schaal voor grotere productievolumes. Van de verschillende nanocarrier fabricage methoden biedt flash nanoprecipitation (FNP) de mogelijkheid om grootschalige en reproduceerbare formuleringen8,9,10. Terwijl de FNP was eerder gereserveerd voor de formulering van solid-core nanodeeltjes, ons lab heeft onlangs uitgebreid het gebruik van de FNP te nemen van de consistente vorming van uiteenlopende PEG -bl- PPS nanostructuur morphologies11, 12, met inbegrip van polymersomes11 en bicontinuous nanospheres12. We vonden dat FNP kan vormen monodispers formuleringen van polymersomes zonder de noodzaak voor extrusie was, wat resulteert in superieure polydispersiteit indexwaarden in vergelijking met niet-geëxtrudeerde polymersomes gevormd door dunne film rehydratie en oplosmiddel dispersie 11. Bicontinuous nanospheres, met hun grote hydrofobe domeinen, konden niet worden gevormd door dunne film rehydratie, ondanks die onder een aantal oplosmiddel voorwaarden met FNP12.

Hier, wij bieden een gedetailleerde beschrijving voor de synthese van de PEG -bl- PPS diblock copolymeren gebruikt bij de vorming van de polymersome, de beperkte impingement jets (CIJ) mixer gebruikt voor FNP, de FNP protocol zelf, en de implementatie van een geautomatiseerd systeem te reduceren van variabiliteit van de gebruiker. Informatie over het steriliseren van het systeem om voldoende te produceren endotoxine-vrije formuleringen voor gebruik in vivoen representatieve gegevens over de karakterisering van polymersomes gevormd door de FNP is inbegrepen. Met deze informatie, zal lezers met belangstelling voor gebruik te maken van de polymersomes in vitro en in vivo arbeidsongeschiktheid zitten kundig voor fabriceren hun eigen steriele, monodispers-formuleringen. Lezers met ervaring in de formuleringen van de nanocarrier en met polymeer synthese expertise zal zitten kundig voor hun eigen polymeersystemen FNP gebruiken als een potentiële alternatief voor hun huidige formulering technieken snel te testen. Bovendien kunnen de hierin beschreven protocollen worden gebruikt als leermiddelen voor de formulering van de nanocarriers in nanotechnologie laboratorium cursussen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. synthese van Poly(ethylene glycol) -blok-poly (propyleen sulfide)-Thiol

  1. Synthetiseren methoxy-poly(ethylene glycol) mesylaat (Mn: 750) (MeO-PEG17-Ms, ik).
    1. Los 10 g MeO-PEG17-OH in 200 mL 100% tolueen binnen een 3-hals ronde onderkant kolf (RBF) onder magnetische roeren bij 600 omwentelingen per minuut.
    2. De 3-hals RBF verbinden met een Dean-Stark apparaat, zelf verbonden met een koeler, houd het hele systeem onder inert gas, stikstof of argon.
    3. Plaats de 3-hals RBF in een oliebad, warmte tot 165 ° C al roerend bij 600 omwentelingen per minuut.
    4. Verwijder sporen water en 100 mL tolueen met behulp van Azeotropisch distillatie.
    5. De 3-hals RBF uit olie verwijderen, loskoppelen van het apparaat Dean-Stark met behoud van inert gas voorwaarden en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
    6. Voeg 5,6 mL 100% triethylamine (3 molaire eq.) en 300 mL watervrij 100% tolueen MeO-PEG17-OH oplossing al roerend bij 600 omwentelingen per minuut.
    7. De 3-hals RBF verplaatsen naar een ijsbad, roeren op 600 rpm en inert gas voorwaarden te handhaven.
    8. Verdun 3.1 mL voor 100% methanesulfonyl chloride (3 molaire eq.) in 30 mL 100% tolueen, langzaam toevoegen aan de 3-hals RBF via een trechter toevoeging al roerend bij 600 omwentelingen per minuut.
    9. Roer 's nachts bij 600 omwentelingen per minuut bij kamertemperatuur onder inert voorwaarden.
    10. Filter oplossing via een Buchner trechter vol met diatomeeënaarde (Zie Tabel van materialen) te verwijderen van zouten.
    11. Verwijder tolueen via een rotatieverdamper met het waterbad ingesteld op 40 ° C, rotatie bij 120 omw / m, en druk tussen 50-100 mbar instelt.
    12. Opnieuw los product in 200 mL 100% dichloormethaan (DCM), en filtreer door een Buchner trechter vol met diatomeeënaarde (Zie Tabel van materialen).
    13. Verwijder DCM via een rotatieverdamper met het waterbad ingesteld op 40 ° C, rotatie bij 120 omw / m, en druk ingesteld op tussen de 450-600 mbar.
    14. Spaarzaam opnieuw los product in 100% DCM en langzaam precipiteren product door het ontkleuring (via Pipet van Pasteur) toe te voegen aan 500 mL ijskoud 100% diethylether. Blijven roeren bij 300 omwentelingen per minuut.
    15. Decanteren of gecombineerd Schakel diethylether van geprecipiteerde product, MeO-PEG17- mesylaat, en winkel overnachting in vacuüm exsiccator volledig drogen.
    16. Gebruik product onmiddellijk, of opslag onder inert gas bij-20 ° C voor enkele maanden.
  2. Synthetiseren methoxy-poly(ethylene glycol) thioacetate (MeO-PEG17-TA, II).
    1. Los 5 g MeO-PEG17-Ms (I) in 200 mL 100% watervrij dimethylformamide (DMF) in een 3-hals RBF, roer bij 600 omwentelingen per minuut bij kamertemperatuur onder inert gas.
    2. 2.5 g 100%-kaliumcarbonaatoplossing (3 molaire eq.) aan het roeren oplossing toevoegen.
      Opmerking: kaliumcarbonaat zal niet volledig oplossen in oplossing.
    3. Verdun 1.3 mL voor 100% thioacetic zuur (3 molaire eq.) in 100 mL voor 100% watervrij DMF, en ontkleuring toevoegen aan oplossing via een trechter toevoeging.
      Opmerking: Thioacetic zuur heeft een geur sterk, onaangenaam. Wees voorzichtig om te houden van alle bevuilde objecten binnen de chemische zuurkast 's nachts voorafgaand aan verwijdering of reiniging.
    4. Roer krachtig (rpm 600 of hoger) 's nachts bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Zout vorming kan gemakkelijk verstoren de roeren van deze oplossing. Wees voorzichtig om 's nachts te roeren.
    5. Filter oplossing via een Buchner trechter vol met diatomeeënaarde (Zie Tabel van materialen).
    6. Verwijder DMF via een rotatieverdamper met het waterbad ingesteld op 60 ° C, rotatie bij 120 omw / m, en de druk instellen tussen 5-15 mbar.
    7. Los product in 100% tetrahydrofuraan (THF) 100 mL en voeg toe aan een kolom vol met neutrale aluminiumoxide rood/oranje gekleurde onzuiverheden te verwijderen.
    8. Verwijder THF via een rotatieverdamper met het waterbad ingesteld op 40 ° C, rotatie bij 120 omw / m, en druk ingesteld op tussen 200-300 mBar.
    9. Spaarzaam opnieuw los product in 100% DCM. Als een zout neerslag vormt, filter oplossing via 6 μm porie filter papierformaat met een Buchner trechter.
    10. Langzaam precipiteren product door toevoeging van ontkleuring via Pipet van Pasteur aan 500 mL ijskoud 100% diethylether, roeren bij 300 omwentelingen per minuut. Diethylether wellicht verder worden gekoeld tot-20 ° C in een explosieveilige vriezer urenlang als neerslag niet crasht uit oplossing bij 4 ° C.
    11. Decanteren of gecombineerd Schakel diethylether van geprecipiteerde product, MeO-PEG17-Thioacetate. 'S nachts produkt opslaat in een vacuüm exsiccator, en vervolgens onder inert gas bij-20 ° C.
  3. Synthetiseren diblock copolymeren poly(ethylene glycol) -blok -poly(propylene sulfide)-thiol (PEG17-bl- PPS35-SH, III).
    1. MeO-PEG17-TA (II) oplossen in 10 mL voor 100% watervrij DMF binnen een kolf Schlenk onder argon, al roerend bij 400 t/min in een waterbad kamertemperatuur.
    2. Voeg 1.1 molaire eq van natrium methoxide (0,5 M-oplossing in methanol), toestaan aan het roer bij 400 t/min gedurende 5 minuten.
    3. 35 molaire eq van 100% propyleen sulfide, snel, aan de oplossing toevoegen. Laat het roer bij 400 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten.
    4. Toevoegen van 10 molaire eq 100% ijsazijn, toe aan het roer bij 400 t/min gedurende 5 minuten.
    5. Verwijder DMF via een rotatieverdamper met het waterbad ingesteld op 60 ° C, rotatie bij 120 omw / m, en de druk instellen tussen 5-15 mbar.
    6. Opnieuw los product spaarzaam in 100% DCM, neerslag in 80 mL 100% methanol, verdeeld over twee 50 mL conische centrifuge buizen.
    7. De conische buisjes centrifuge bij 7500 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Gecombineerd weg supernatant.
    8. Winkel product, PEG17-bl- PPS35-SH, overnachting in een vacuüm exsiccator, en vervolgens onder inert gas bij-20 ° C.

2. Monteer PEG -bl -PPS Nanocarriers via Hand-Powered Flash Nanoprecipitation

  1. (Optioneel) Het steriliseren van de beperkte impingement jets (CIJ) mixer.
    1. Binnen een biologische veiligheidskast (BSC), onderdompelen mixer met alle onderdelen gedemonteerd binnen 0,1 M NaOH's nachts.
    2. Monteer CIJ mixer, en stroom door endotoxine-gratis water met behulp van luer-lock spuiten.
    3. Controleer de pH van het water, en blijven stromen van water door tot pH registers als neutraal.
  2. Ontbinden van PEG17-bl- PPS35-SH polymeer en hydrofobe lading in THF (impingement oplossing 1).
    1. Weeg 20 mg PEG17-bl- PPS35-SH in een 1,5 mL-buis.
    2. Toevoegen van hydrofobe kleurstoffen (bijvoorbeeldDiI, ICG), drugs (bijvoorbeeldrapamycin), of andere lading.
      Opmerking: Cargo mogelijk droog, of in een water-mengbare oplosmiddelen, bij voorkeur THF opgeloste. Als lading onoplosbaar in THF of DMF is, kan een andere water-mengbare oplosmiddelen worden gebruikt, maar spaarzaam, als het polymeer is waarschijnlijk niet oplosbaar. De hoeveelheid lading die kan worden geladen is afhankelijk van de eigenschappen van de lading zelf (bijvoorbeeld het molecuulgewicht, hydrophobicity, sterische overwegingen), en zou moeten worden onderzocht op een case-by-case basis11,12.
    3. Voeg 500 µL van 100% THF aan de polymeer en lading, vortex krachtig te ontbinden.
  3. Hydrofiele lading in waterige buffer (impingement oplossing 2) los. Los hiervoor hydrofiele lading moet worden geladen in polymeer blaasjes in 500 µL van een waterige buffer (bijvoorbeeld met fosfaat gebufferde zoutoplossing, zuiver water, enz.) zo nodig.
  4. Buffer aan reservoir toevoegen.
    1. 2,5 mL van een waterige buffer van keuze (bijvoorbeeld 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing) toevoegen aan een voldoende grote reservoir (bijvoorbeeld een flesje van 20 mL glas Scintillatie). Plaats reservoir onder CIJ mixer zodanig dat de uitstroom uit de mixer direct het reservoir komt.
  5. Impingement oplossingen in aparte 1 mL plastic disposable spuiten laden.
  6. Aantasten oplossingen tegen elkaar om tegelijkertijd vormen van nanostructuren en ze laden met de lading.
    1. Spuiten in Luer-lock adapters aan de bovenkant van de mixer CIJ invoegen.
    2. Drukken in een enkele, vloeiende en snelle beweging, beide spuiten gelijktijdig en met gelijke kracht.
      Opmerking: Als u meerdere opeenvolgende problemen uitvoert, eerst verzamelen uitstroom in een lege reservoir.
    3. (Optioneel) Het uitvoeren van meerdere problemen. Split ontluikende nanostructuur oplossing tussen twee spuiten, en herhaal stap 2.6.1-2.6.2 tot 4 keer.
    4. Verzamelen van uitstroom in het waterige buffer gevuld reservoir bereid in 2.4.1 en zachtjes roeren zodat mengen.
  7. Gelost lading en/of organische oplosmiddelen verwijderen.
    1. (Optie 1) Dialyze nanocarrier formulering in de dezelfde waterige buffer die wordt gebruikt voor impingement en in het reservoir, met behulp van de buis van een passende MW cutoff gedurende ten minste 24 uur met ten minste 2 wijzigingen van de buffer. Dit kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Nanocarriers zal worden bewaard door buizen met een MW cutoff < 100.000 kDa en potentieel kan worden gehandhaafd door hogere cutoffs ook. Deze optie houdt steriliteit wanneer uitgevoerd in een BSC met behulp van steriele buffer.
    2. (Optie 2) Filteren formulering via een grootte uitsluiting of ontzouten/buffer wisselingskolom (bijvoorbeeld Sepharose 6B kolom) 1 x PBS als de waterige buffer gebruiken.
      Opmerking: Deze optie handhaaft steriliteit wanneer uitgevoerd in een BSC met een kolom die grondig is gesteriliseerd.
    3. (Optie 3) Verwijder de vluchtige organische oplosmiddelen, met behulp van vacuüm uitdroging 's nachts.
    4. (Optie 4) Filteren van formulering met behulp van een tangentiële filtratie-stroomsysteem met behulp van een 50-100 kDa filter op een debiet van 20-60 mL/min gedurende 15 minuten tot 1 uur, afhankelijk van het molecuulgewicht van de unencapsulated lading weg wordt gezuiverd (grotere lading zal langer duren).
  8. (Optioneel) De formulering van de nanocarrier te concentreren.
    1. (Optie 1) Concentreren met behulp van een spin concentrator systeem (bijvoorbeeld spin kolom met MW cutoff > 100.000), gebruikt zoals beschreven door de fabrikant.
      Opmerking: Nanocarriers wellicht geresuspendeerde worden tussen de draaiingen en vereisen een aantal draaiingen te concentreren tot gewenste volume. Spin concentratie kan verminderen steriliteit van nanocarrier formuleringen.
    2. (Optie 2) Volume met behulp van vacuüm uitdroging te verlagen.
      Opmerking: Volumeverandering is moeilijk te controleren in deze omstandigheden, en moet worden gezorgd om osmolariteit vóór en na de concentratie.
  9. Opslaan nanocarriers bij 4 ° C voor weken tot maanden. Vóór gebruik na opslag, kort vortex nanocarrier formuleringen.

3. het karakteriseren van Nanocarrier formuleringen

  1. Maatregel laden van efficiëntie
    1. Als vracht tl is of sterk bij een bepaalde golflengte buiten 260-450 nm absorbeert, meet fluorescentie/extinctie met behulp van een fluorimeter/spectrofotometer.
      Opmerking: PEG -bl- PPS absorbeert sterk van 260-310 nm en polymersome formuleringen absorberen van 310-450 nm, waarin kwantificering van lading die op een soortgelijk golflengte absorbeert kan bemoeilijken.
    2. Als lading binnen het bereik van 260-450 nm absorbeert en hydrofiele, PEG -bl- PPS nanostructuren verstoren door het toevoegen van 25 μL van de formulering op een gelijk volume van 1% H2O2 of 1% Triton X-100 en vervolgens scheiden en onderscheiden lading van polymeer absorptie via krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) met behulp van een grootte uitsluiting kolom compatibel met waterige buffers (bijvoorbeeld een kolom Sepharose 6B) 11.
    3. Als lading binnen het bereik van 260-450 nm absorbeert en oplosbaar in THF of DMF is, lyophilize de formulering door bevriezing 100 μl in een plastic buis van 1,5 mL bij-80 ° C's nachts. Plaats vervolgens de buis in een vacuum glas-container en plaats op een lyophilizer. Kan 24 uur duren voordat lyofilisatie te laten plaatsvinden en vervolgens opnieuw los in 50 μl van DMF of THF vóór scheiding en opsporing via HPLC.
  2. Maatregel nanocarrier grootte en morfologie
    1. Gebruik dynamische lichtverstrooiing (DLS)11 of nanoparticle bijhouden analyse13 om nanocarrier grootte te meten.
      Opmerking: Nanocarriers gevormd van PEG17-bl- PPS35-SH naar verwachting hebben een gemiddelde diameter van tussen de 100-200 nm, met een polydispersiteit index < 0.3.
    2. Nanocarrier morfologie met behulp van cryogene Transmissie Electronenmicroscopie (cryoTEM)14bepalen.
      Opmerking: Nanocarriers gevormd van PEG17-bl- PPS35-SH naar verwachting polymeer blaasjes (polymersomes) met een duidelijk waarneembare polymere membraan en grotendeels bolvorm.
  3. (Optioneel) Test formuleringen voor endotoxinen
    1. (Optie 1) Gebruik van een cel-gebaseerde bepaling voor de aanwezigheid van endotoxinen, bijvoorbeeld RAW blauwe cellen of HEK blauwe TLR4 cellen (Zie Tabel of Materials), zoals beschreven door fabrikant, in beide een kwantitatieve of kwalitatieve assay voor lipopolysacchariden (LPS)13 .
    2. (Optie 2) Gebruik een Limulus Amebocyte Lysate (LAL)15 assay kit, zoals beschreven door de fabrikant.

4. de fabricage van een high-speed-spuitpomp voor FNP

  1. Aangepaste instrument onderdelen fabriceren.
    Opmerking: 3D-modellen voor het verspanen van alle aangepaste onderdelen vindt u in de aanvullende materialen.
    1. Machine van de multi-gelaagde instrument van ¾" acrylplaten chassis en monteren (Zie Aanvullende bestanden 1-5).
      Opmerking: Acryl heeft slechte chemische weerstand. Als het instrument is om met agressieve oplosmiddelen worden gebruikt, de basis van een metal machine geschikt wordt geacht voor de toepassing.
    2. 3D print delen met afgedrukt met polylactide (PLA) plastic.
      1. De spuit uitzetting (SE) 2-delige apparaat afdrukken: SE deel 1 - achterzijde FNP blok houden vervoer (figuur 5F, grijze deel; Aanvullende bestand 6) en SE deel 2 - Front uitzetting guide (figuur 5F, zwarte deel; Aanvullende bestand 7). Zie aanvullende bestand 2 voor schema's.
      2. Afdrukken van de infrarode sensor accolades (figuur 5I, zwarte dozen; Aanvullende bestanden 8 en 9).
      3. (Optioneel) De dubbele spuit plunjer brace afdrukken.
  2. Instrument chassis lagen samen met M5 hex bouten vast en rubberen voetjes aan de base toevoegen.
  3. Een single-board-computer met het besturingssysteem van Raspbian GNU/Linux 8.0 (Jessie) (gebaseerd op Linux Debian) configureren.
    Opmerking: Software voor het bedienen van het Instrument is beschikbaar op aanvraag. Instrument software broncode beschikbaar op aanvraag. Na ontvangst van zip-bestand, downloaden alle afhankelijkheden die zijn opgegeven in het README-bestand. Deze software omvat een eenvoudige grafische gebruikersinterface waarmee controle over instrument werking, met inbegrip van run basisparameters (motor snelheid, richting, enz.). Gebruikers worden aangemoedigd om uit te breiden op de bestaande broncode en aangepaste programmamodules op maat gemaakt voor gebruik in hun eigen experimenten. Alle software is geschreven met Python 2.7.12 en is niet momenteel compatibel met Python 3. RPi, PicoBorgRev, kivy en multiprocessing modules worden gebruikt. Het Leesmij-bestand bevat gedetailleerde informatie met betrekking tot de software distributielicentie.
  4. Installeer een 24 V DC motor (figuur 5A) en precisie dia (4,5"(114,3 mm) beroerte; 1,27 mm schroef leiden) geborsteld (figuur 5C).
    Opmerking: De 24 V DC motor gebruikt hier heeft een RPMmax, ikmaxen full-load koppel van 4,252 RPM, 4,83 A, en ~0.2 N * m, respectievelijk.
    1. (Optioneel) Schakel opvulling onder de motor te dempen van trillingen tijdens operatie.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen dat een 2-3 mm dik rubber pad aan de motor vervoer afmetingen van de instrument-base wordt gesneden.
    2. Monteer de precisie dia aan de basis van het instrument.
      1. Verwijder de ankerstang tijdelijk.
      2. Mount-dia met behulp van twee #8-32 platte machine schroeven.
    3. Mount gelijkstroommotor om precisie-dia met behulp van de schroef lichtbundel koppeling (1-1/4" lengte) met 6/16" en 1/4" diameter verveelt.
      Opmerking: Afhankelijk van de dikte van acryl gebruikt aan de basis lagen van instrument machine, shims kunnen nodig zijn om het niveau van de motor en precisie dia schachten.
  5. Uitzetting platform monteren van metalen platen en L-vormige hoek bretels (figuur 5D). Onedel metaal platform om glijdende platform (verbonden aan ankerstang) monteren met behulp van #6-32 schroeven. Zie precisie dia schema geboden door de fabrikant voor meer informatie over de beperkingen van de montage.
  6. Assembleren spuit uitzetting systeeminstellingen.
    1. Bevestig de lineaire beweging kussen blokken (montage platformen + lineaire beweging lager) op M8 verchroomd roestvrij stalen rails (de parallelle stalen rails kunnen worden gemakkelijk waargenomen in Figuur 5).
    2. Draad rails via lineaire schacht gids/ondersteuning en vergrendelen van de rails. Gebruik drie gidsen per spoor. Mount SE delen 1 en 2 op kussen blokken met behulp van de M4 machine schroeven.
    3. Losjes toetreden SE delen 1 en 2 met hex bouten M8. De ruimte tussen SE deel 1 en 2 met spiraalvormige drukveren die betrekking hebben op elke bout die zijn beveiligd tussen twee naar binnen gerichte nylon bussen (Zie figuur 5F) configureren. Monteer deze bussen op de buitenkant van de SE deel 1 en SE deel 2.
  7. Draad circuit (Zie Figuur 6 voor het bedradingsschema core)
    1. De motorcontroller verbinden met de I2C/SDA, 3.3 V en GND pinnen op de enige raadscomputer.
    2. DC motor terminals verbinden met de M en M + blokken van het motor controller boord. De 24 V, 2,5 A voeding (figuur 5B) verbinden met de V + en GND blokken van de motorcontroller (de controller is ingekapseld in een eenvoudig elektronica doos in het definitieve ontwerp, Zie Figuur 5 H).
    3. Sluit de 3V3 en 5V pinnen van de motor control board aan de respectieve pinnen op de enige raadscomputer. Verbinden met SDA en SCL pinnen van de motorcontroller pin 3 en 5 van de enige raadscomputer, respectievelijk.
      Opmerking: Commando's worden uitgegeven aan de DC-motor uit de enige raadscomputer via een motor controller. Motor snelheid wordt gecontroleerd door het reguleren van de spanning over de motor terminals via puls breedte modulatie. Bij deze instelling het maximale huidige loopt door de 24 V DC-motor (full-load stroomsterkte: 4,83 A) wordt beperkt tot 2,5 A door de 24 V-voeding. Het is aanbevolen dat het motorcircuit is bedraad via een verbreekcontact, normaal gesloten (NC) noodstop (figuur 5J). Doen biedt een manier om te verstoren het motorcircuit zodat een fundamentele nood afsluitbewerking.
    4. Voorste en achterste infrarood naderingssensoren (digitale afstand sensoren, figuur 5I) verbinding te maken met RPi GPIO pinnen 24 en 23, respectievelijk.
      1. Route sensor bedrading door leidingen in de base instrument.
        Opmerking: De IR-sensoren zijn contactloze pauze-beam bewegingssensoren met een registratiebereik van 2-10 cm.
      2. 4.7.4.2 snap de bedrade IR sensoren in 3D-gedrukte infraroodsensor accolades (figuur 5I, zwarte dozen) en mount op de instrument-base. Wanneer correct ingesteld in de brace, moet de sensor gezicht uitsteken naar buiten uit de 14 mm x 7 mm rechthoekige opening van de brace.
        Opmerking: deze sensor bretels kunnen tijdelijk gemonteerd worden met behulp van Velcro of een lijm (tijdelijke montage is nuttig om op de juiste manier aanpassen en optimaliseren van de IR sensor plaatsing). U kunt ook permanent mount door het boren van kleine gids gaten in het instrument base en het veiligstellen van de bretels met M2 schroeven.
    5. Een 7" touchscreen LCD display sluit aan op de 5V, GND, en seriële interface (DSI) pinnen van de enige raadscomputer weer te geven. De 7" RPi en LCD display van de vergadering is afgebeeld in Figuur 5 g.

5. het fabriceren van Polymersomes via FNP met behulp van de op maat gemaakte High-Speed-spuitpomp

  1. (Optie 1) Auto-run modus gebruiken.
    1. Selecteer Auto uitvoeren vanuit het hoofdmenu. Het systeem zal gebruikers vragen om het toestaan van de motor om automatisch te plaatsen de spuit uitzetting platform naar het begin van de dia precisie. Zorg ervoor dat het pad in voor en achter het metalen plaatje duidelijk is voordat u verdergaat.
    2. Laden 1 mL kunststof spuiten zoals beschreven in punt 2.5 en mount spuiten op de vrouwelijke Luer-aansluitingen van de CIJ-mixer. Laden van CIJ mixer (met spuiten verbonden) in het rechthoekige openen van de achterste uitzetting vervoer (Zie figuur 5E).
    3. Instellen van de gewenste snelheid van de motor (eenheden: rpm) met behulp van de schuifknop in de GUI (Zie de opmerking hieronder voor belangrijke overwegingen). De optimale motorsnelheid zal afhangen van de specifieke pomp en de installatie maar moet een debiet van ten minste 1 mL/s voor de CIJ mixer kanaal afmetingen hier geboden.
      Opmerking: Houd de volgende richtlijnen tijdens het debiet van de instelling. In de verticale handbediende FNP configuratie, reactanten worden uitgezet aan het spuiten met een snelheid van ~ 1 mL/s, maar kan zeer variabel wanneer hand aangedreven. Dit is gewoon het debiet via de injectieampul, die wordt beheerd door het tarief waartegen de gebruiker de plunjer van de injectiespuit voorschotten. Merk op dat het tarief van 1 mL/s niet te verwijzen naar het debiet van de afrit van de kleinere diameter mondstuk. Op de hierboven opgegeven kanaal afmetingen, ~ 1 mL/s moet worden gehandhaafd om ervoor te zorgen een passende Reynold nummer voor turbulente mengen10. Verschillende debiet kunnen worden gebruikt zolang de kanaal diameter te handhaven van een Reynold getal dat turbulente omstandigheden ondersteunt is aangepast. De spuit plunjers zijn gevorderd door een loodrechte metalen plaat, die beweegt langs een hoge precisie aluminium dia gekoppeld aan de 24 V DC borstelmotor. In deze configuratie, het maximale vat debiet wordt beïnvloed door een aantal factoren, met inbegrip van (1) de motor maximumsnelheid (4,252 rpm) en de leiding van de schroef van de precisie dia (1,27 mm) die is gekoppeld aan de motor shaft (2) het koppel van de motor (~0.2 N * m voor full-l OAD torque), die is nodig om te overwinnen van de weerstand tegen stromen (3) tegendruk bijdragen van vloeibare indienststelling en de uitgang van de CIJ-mixer, en (4) de kracht van de injectienaalden die gebruikt (gebruikers moeten rekening te houden met de krachten die op het spuiten en spuiten van gebruiken passende sterkte). Met betrekking tot punt (2), wanneer stroom te verhogen is snelheid voldoende koppel vereist om te voorkomen dat de motor stalling met behoud van gestage uitzetting onder toenemende tegendruk. – Ter illustratie van de stroom van het vat, vat debiet stem dat het bovengenoemde systeem kunt bereiken, kunt u overwegen het geval waar de FNP wordt uitgevoerd met behulp van de reactanten in twee één-milliliter spuiten geladen. Om een 1 mL/s stroom moet door het vat, de motor vooraf de metalen plaat de afstand bepaald door de lengte van de zuiger (~ 68 mm voor een typisch één mL spuit) in één seconde. Mits de 1,27 mm schroef lood van de precisie dia, hieruit volgt dat een DC-motor die op 4,252 rpm staat tot bevordering van het platform is ~ 90 mm/s (71 rev/s * 1,27 mm/Rev.). Dit komt overeen met een vat debiet van ~1.3 mL/s, die groter is dan de 1 mL/s target rate.
    4. Controleer voordat u het instrument, het systeem om ervoor te zorgen dat het pad van het platform is vrij van obstakels, en dat de voor- en achterzijde IR nabijheid detectoren zijn duidelijk van obstakels (de IR sensoren zijn de kleine zwarte dozen in de buurt van de precisie dia terminals; Zie figuur 5I). Ook voor zorgen dat de uitlaat van de capillaire buis van de CIJ-mixer is gerouteerd in een passende collectie container (ex: glazen bekerglas, enz.).
    5. Om te verdrijven reactanten uit de spuiten en in de CIJ-mixer, drukt u op de knop uitvoeren in de software-interface.
  2. (Optie 2) Gebruik handmatige run modus. Verwijzen naar de Auto Run modus aanwijzingen hierboven en noteer de volgende wijziging om 5.1.5: druk op de knop voortdurend via de voltooiing van de run (dat wil zeggen gedrukt, het platform in reactie op een gebeurtenis op-pers, en de motor voorschotten stopt in reactie op een gebeurtenis op-release).
  3. (Optie 3) Gebruik handmatige platform positionering modus; deze modus kan gebruikers positie van het platform door het uitvoeren van de motor bij lage snelheid (20% vermogen) in reactie op de forward en reverse knoppen op de software-interface.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier hebben we een eenvoudig protocol voor de formulering van nanocarriers kan laden van hydrofiele en hydrofobe lading die veilig voor in vivo muis en11,13van de administratie van de niet-menselijke primaten zijn gepresenteerd. We hebben ook een gedetailleerd protocol voor de synthese van het polymeer gebruikt in onze representatieve resultaten, samen met een beschrijving voor de fabricage van een aangepaste instrument v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij hebben verstrekt gedetailleerde instructies voor het snelle fabricage van polymersomes met behulp van PEG17-bl- PPS35-SH als de diblock-copolymeer. Vesiculaire polymersomes zijn de primaire statistische morfologie geassembleerd op deze verhouding van PEG hydrofiele en hydrofobe PPS blok molecuulgewicht. Wanneer meerdere keren Gemeenschapsverdrag, ze hebben een diameter en polydispersiteit die overeenkomt met polymersomes nadat hij door een 200 nm membraan geëxtrudeerd gevormd via

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen dat personeel en instrumentatie ondersteuning van de structurele biologie faciliteit aan de Northwestern University. De steun van de R.H. Lurie uitgebreide kanker centrum van Northwestern University en de Noordwestelijke Universiteit structurele biologie faciliteiten wordt erkend. De detector van de directe elektron Gatan K2 werd gekocht met middelen die door de Chicago biomedische Consortium met steun uit de fondsen Searle op The Chicago Gemeenschap Trust. Wij danken ook de volgende faciliteiten aan de Northwestern University: de Keck interdisciplinaire oppervlak wetenschap faciliteit, de structurele biologie-faciliteit, de biologische Imaging faciliteit, het Center for Advanced Molecular Imaging en de analytische Bionanotechnologie apparatuur Core. Dit onderzoek werd gesteund door de subsidie van de National Science Foundation 1453576, de nationale instituten van gezondheid directeur van nieuwe Innovator Award 1DP2HL132390-01, het centrum voor regeneratieve nanogeneeskunde katalysator Award en de 2014 McCormick katalysator Award. SDA werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH predoctoraal biotechnologie opleiding Grant T32GM008449.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB EditionCanaKitUPC 682710991511
Linear Bearing Platform (Small) - 8mm DiameterAdafruit1179
Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, MetricVXBkit11868
Linear Rail Shaft Guide/Support - 8 mm DiameterAdafruit1182
Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacityMcMaster-Carr5236A16
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motorIron HorseMTPM-P10-1JK43
Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD DisplayRaspberry PiB0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - Advanced motor control for Raspberry PiPiBorgBURN-0011
Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cmPololu1134
Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal TorqueRulandPSR16-5-4-A
Polyethylene glycol monomethyl etherSigma Aldrich202495
Methanesulfonyl chlorideSigma Aldrich471259
TolueneSigma Aldrich179418
Toluene, AnhydrousSigma Aldrich244511
TriethylamineSigma AldrichT0886
Celite 545 (Diatomaceous Earth)Sigma Aldrich419931
DichloromethaneSigma Aldrich320269
Diethyl etherSigma Aldrich296082
N,N-Dimethylformamide, anhydrousSigma Aldrich227056
Potassium carbonateSigma Aldrich791776
Thioacetic acidSigma AldrichT30805
TetrahydrofuranSigma Aldrich360589
Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann ISigma Aldrich199974
Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanolSigma Aldrich403067
Propylene sulfideSigma AldrichP53209
Acetic acidSigma AldrichA6283
MethanolSigma Aldrich320390
Sodium hydroxide solution 1.0 NSigma AldrichS2770
Endotoxin-free waterGE Healthcare Life SciencesSH30529.01
Paper pH stripsFisher Scientific13-640-508
Endotoxin-free Dulbecco's PBSSigma AldrichTMS-012
Borosilicate glass scintillation vialsFisher Scientific03-337-4
1 mL all-plastic syringeThermo ScientificS75101
Sepharose CL-6BSigma AldrichCL6B200
Liquid chromatography columnSigma AldrichC4169
CIJ mixer, HDPECustom
Triton X-100Sigma AldrichX100
Hydrogen peroxide solutionSigma Aldrich216763
HEK-Blue hTLR4InvivoGenhkb-htlr4
RAW-Blue CellsInvivoGenraw-sp
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1
PYROGENT Gel Clot LAL AssaysLonzaN183-125

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
  2. Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
  3. Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
  4. Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
  5. Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
  6. Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
  7. O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
  8. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  9. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302(2003).
  10. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  11. Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
  12. Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
  13. Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
  14. Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624(2018).
  15. Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
  16. Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
  17. Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
  18. Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flash NanoprecipitationPolymer VesiclesBioactive Protein LoadingImmunostimulant DeliverySynthetic NanocarriersHigh Speed Syringe PumpConfined Impingement JetsDynamic Light ScatteringCryogenic Transmission Electron MicroscopyTangential Flow Filtration

Gerelateerde artikelen