Ovariële weefselkweek te visualiseren verschijnselen in muis eierstok

Samenvatting

Ovariële weefselcultures kan worden gebruikt als modellen van follikel ontwikkeling, ovulatie en follikel atresie en regulerende mechanismen van dynamische ovariële processen aan te geven.

Samenvatting

Zoogdieren vrouwtjes eisprong periodiek een bijna constante aantal eicellen tijdens elke cyclus van estrus. Om dergelijke regelmaat en periodiciteit, verordening treedt op op het niveau van de hypothalamische-hypofyse-gonadale as en op de ontwikkeling van de follikels in de eierstokken. Ondanks actieve studies zijn follikel ontwikkelingsmechanismen niet duidelijk, vanwege de verschillende stappen van de activering van de slapende primordiale follikel tot ovulatie, en de complexiteit van de verordening dat verschilt in elk folliculaire fase. Voor het onderzoek naar de mechanismen van ontwikkeling van de follikel en de dynamiek van de follikels gedurende de gehele estrus cyclus, we een muis ovariële weefselkweek model ontwikkeld dat kan worden gebruikt voor het observeren van de follikel ontwikkelen met behulp van een microscoop. Systematische follikel ontwikkeling, periodieke ovulatie en follikel atresie kunnen alles worden gereproduceerd in de gekweekte ovarium-model en de kweekomstandigheden experimenteel kunnen worden gedifferentieerd. We laten hier zien het nut van deze methode in de studie van de regelgevende mechanismen van ontwikkeling van de follikel en andere ovariële verschijnselen.

Inleiding

Vrouwelijke muis eierstokken verscheidene duizend follikels¹bevatten, en periodieke ovulatie rijpt ongeveer tien eicellen op elke cyclus van estrus. Follikels zijn ingedeeld in verschillende ontwikkelingsstadia: primordial, primaire, secundaire, follikelgroei, en Graafian de follikels, afhankelijk van de vorm van de granulosa cellulaire laag rond elke oöcyt. Meeste primordiale follikels zijn slapende, en sommige van hen zijn geactiveerd en uitgroeien tot primaire follikels bij elke estrus cyclus². Na de secundaire folliculaire fase, wordt ontwikkeling van de follikel voornamelijk geregeld door gonadotrofinen, folliculaire stimulerende hormoon (FSH) en het luteïniserend hormoon (LH). Echter, primordial en primaire follikel ontwikkeling is onafhankelijk van choriongonadotrofine, en de regulerende mechanismen die deze fasen regelen blijven slecht inderstood^3,4,5. Naast de groeifactoren en hormonen, wordt de primordiale en primaire follikel geregeld door de interacties tussen follikels^6,7. Dus we analyses van de follikel dynamics uitgevoerd in muis eierstok weefsels en onderzocht de bijbehorende regulerende mechanismen met behulp van ovariële weefselcultures^8,9,10.

Hierin, introduceren we twee methoden in webobjectmodel ovariële weefselkweek. De eerste wordt gebruikt voor het analyseren van de follikel ontwikkeling door meting van de folliculaire gebieden, en de tweede wordt gebruikt voor het bestuderen van het reguleringsmechanisme tijdens de vroege ontwikkeling van de follikel van primordial naar secundaire follikel fase met transgene muizen. Voor de analyse van de ontwikkeling van de follikel, we voornamelijk gebruikt eierstokken van 4 - weken oude vrouwelijke muizen omdat zij toestaan voor eenvoudige visualisatie van follikels. Om periodieke ovulatie en model in vivo de ontwikkeling van de follikel, wij gereproduceerd LH-piek en waargenomen ovulatie, follikel atresie en secretie van oestradiol weefselkweek omstandigheden. Beelden van de gekweekte eierstokken werden gevangen genomen en de ontwikkelingsprocessen follikel werden geanalyseerd door tracering veranderingen in de folliculaire gebied. In heldere veld microscopie analyses was het onderscheid tussen primordiale en vroege primaire follikels echter onduidelijk. Zo ontwikkelden we een methode voor het detecteren van kleine follikels en onderscheid maken tussen de primordiale, primair, en secundair follikel in gekweekte ovariële weefsels met behulp van Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 en de R26-H2B-mCherry transgene muizen eierstokken op dag 0 en 4 na geboorte¹¹. Oog1 uitdrukking is aantoonbaar in eicellen na inwerkingtreding meiose, en geleidelijk aan toeneemt met de ontwikkeling van de follikel, waardoor observatie van de overgang van primordial naar primaire follikels met behulp time-lapse beelden van gekweekte eierstok weefsel^{11 ,12}. Hoewel de morfologische methodes zijn gebruikt om de studie van de factoren die activeren van sluimerende primordiale follikels^13,14,15,16, is ontwikkeling van de fysiologische follikel in de eierstokken moeilijk te observeren, en de gevolgen van verschillende factoren blijven genfunctieonderzoek. De huidige cultuur-methoden werden ontworpen om aan te pakken van deze schaarste in real-time analyses van doel factoren.

In de huidige studie, we bijgehouden folliculaire ontwikkelen met behulp van een time-lapse beeldvorming methode en het proces van ontwikkeling van de follikel gekenmerkt. Onze nieuwe methoden bieden een ongekende hulpmiddel voor het onderzoeken van de Fysiologie van de eierstokken.

Protocol

Muizen werden gehuisvest in een milieuvriendelijke gecontroleerde kamer op 23 ± 1 ° C met een 12 h licht/12 h donker cyclus. Dierenverzorgers protocollen en experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren voor dier experimenten Aichi medische universiteit en door de zittende Animal Care en gebruik Comité zijn goedgekeurd.

1. voorbereiding van de voedingsbodem en gerechten

1. Toevoegen om te bereiden fundamentele kweekmedium, foetale runderserum (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL), en penicilline-streptomycine (100 U/mL penicilline; streptomycine, 100 mg/mL) minimale essentiële middellange Alfa (MEM-α) en mix in 50 mL tubes.
   Opmerking: Totale hoeveelheid vereiste voedingsbodems variëren tussen experimenten, maar 1 mL gestolde voedingsbodem is over het algemeen voldoende voor 3,5 cm glas-onder cultuur gerechten.
2. Giet 1 mL aliquots van gemengde kweekmedium in 3,5 cm glas-onder cultuur gerechten en stel plaats 30 mm cel cultuur inzetstukken in gerechten. Vooraf warm media en gerechten in een incubator (5% CO₂ en 37 ° C).

2. voorbereiding van eierstokweefsel

1. Vooraf warm met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (−) en MEM-alpha met 5% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine in een incubator (5% CO₂ en 37 ° C).
   Opmerking: Ongeveer 3 mL aliquots van PBS (−) per eierstok volstaan voor gebruik tijdens de eierstok ontledingen en 1 mL aliquots van MEM-alpha volstaan voor tijdelijke opslag van één van de eierstokken in 3,5 cm schotels.
2. Accijnzen eierstokken van 4 - weken oude vrouwelijke ICR (de naam na de Instituut van kankeronderzoek) muizen en versiering van de weefsels rond de eierstok met schaar en pincet onder een stereoscopische Microscoop. De verwijderde eierstokken in een kweekvloeistof reserveren (zie stap 2.1) tot gebruik.
   1. Plaats één van de eierstokken op filterpapier bevochtigd met vooraf opgewarmd PBS (−) (zie stap 2.1) en snijd in 4 stukken met behulp van een microtoom mes onder een stereoscopische Microscoop.
      Opmerking: Eierstokken van 4 - weken oude ICR muizen zijn ongeveer 2 mm in diameter. Het aantal stuks is afhankelijk van de grootte van de eierstok; evenwel toestaan dat ongeveer 500 µm dikke stukken voor juiste follikel waarnemingen (in stukken dikker dan 500 mm, weefsel transparantie wordt verlaagd; in stukken dunner dan 500 mm, vele follikelgroei follikels zijn gebroken en verloren).
   2. Na dissectie, plaatst u de gesneden eierstok specimens in voorverwarmde kweekmedium in 3,5 cm schotels (zie stap 2.1).

3. ovariële weefselkweek

1. Drop ongeveer 0,5 µL cultuurmedium per gesneden ovariaal weefsel op de cel cultuur invoegen waar de ovariaal weefsel zal worden ingesteld met behulp van een micropipet.
2. Plaats elk gesneden specimen in een druppel kweekmedium op de cel cultuur inzetstukken met pincet.
3. Cultuur van de eierstok weefsels in 5% CO₂ bij 37 ° C.
4. Vervang het kweekmedium met verse voorverwarmde medium om de 2 dagen.
   Opmerking: Het schema voor middellange wijzigingen voor de cultuur van de eierstok secties van 4 - weken oude ICR muizen wordt gepresenteerd in Figuur 1.
   1. Voor het reproduceren van de LH-piek, gekweekte 4 - weken oude ICR muizen eierstokken te behandelen met het medium waarin 100 mU/mL FSH en LH voor 12u elke 4 dagen (Figuur 1).

4. Microscoop beelden van gekweekte eierstokken

1. Start de gekweekte eierstokken imaging na dag 1, wanneer de weefsels hebben gehouden op de cel cultuur inserts en confocal of omgekeerde Microscoop-analyses uitvoeren om voldoende groei van de follikel tussen tijdstippen tussenpozen 24 h.
   Opmerking: Confocale microscopie is superieur aan omgekeerde microscopie om follikels in hele gekweekte eierstokken te observeren.

5. time-lapse beeldvorming van gekweekte eierstokken

1. Optimaliseer de time-lapse imaging voorwaarden, waaronder laser intensiteiten en blootstelling tijden voor het imaging systeem (tabel 1).
   1. Selecteer gekoppelde eierstok exemplaren van één muizen voor gebruik als behandeling en controlegroepen. Variëren laser intensiteiten en belichtingstijd te bereiken de beste beelden (tabel 1).
   2. Vergelijk follikel groei onder de voorwaarde van elke cultuur door het meten van de follikel gebieden in beelden van controlemonsters 24u tussenpozen en time-lapse imaging monsters (zie stap 6). Gelijktijdig, het aantal algemeen eicellen in elke eierstok-set en kies de optimale time-lapse imaging voorwaarden.
2. Opnamen tussenpozen 30 min met behulp van de time-lapse imaging systeem onder bepaalde voorwaarden (tabel 1).

6. follikel groei analyse

1. Meten om te analyseren de ontwikkeling van de follikel, de gebieden van de follikel in de opnames ImageJ softwarematig (http://resbweb.nih.gov/ij/).
   1. Aanvankelijk, stel de schaal van de afbeelding door te klikken op "Schaal ingesteld" onder "Analyseren" in de werkbalk. Voer de lengte van de zijde van de opname en het overeenkomstige aantal pixels in de lege velden van "De afstand van de bekende" en "Afstand in pixels", respectievelijk.
   2. Klik op "Vrije hand" in de werkbalk en een overzicht van de follikels in de beelden gevangen helder veld.
   3. Klik op "Maatregel" onder "Analyseren" in de werkbalk.
      Opmerking: Als andere meetgegevens gewenst zijn, klikt u op "meting" onder "Analyseren" in de werkbalk en schakel de juiste selectievakjes in de lijst.

7. analyse van de ontwikkeling van de follikel met behulp van transgene muizen

1. Eierstokken van postnatale dagen 0 en 4 (P0 en P4) vrouwelijke transgene muizen met de transgenen Oog1pro3.9 R26-H2B-mCherr, en cultuur op inserts zoals beschreven in stappen 1.1 – 3.2, behalve niet plak de P0 en P4 eierstokken verzamelen.
2. Vervang het kweekmedium met verse, voorverwarmde medium in 3,5 cm schotels in een broedmachine met 5% CO₂ bij 37 ° C om de 2 dagen.
   Opmerking: De concentratie van LH in het kweekmedium van P0 en P4 eierstokken kan ongewijzigd omdat LH spanningspieken niet in P0 en P4 muizen komen.
3. Stel de Microscoop te visualiseren alleen AcGFP1-positieve primaire follikels in de eierstokken van gekweekte P4 (tabel 1).
   Opmerking: Alleen primordiaal en primaire follikels zijn aanwezig in P4 vrouwelijke muis eierstokken.
4. Foto's vastleggen van gekweekte P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry transgene muizen eierstokken tussenpozen 30 min met behulp van de instellingen die worden gebruikt voor P4 eierstokken (zie stap 5.2).
5. Traceren en analyseren van de follikel ontwikkelen met behulp van AcGFP1 en H2B-mCHerry signalen.

Resultaten

Figuur 1 toont het protocol voor wijzigingen in de media tijdens ovariële weefselkweek. Na dit programma 4-week-oude ICR muizen eierstokken werden gekweekt en beeld intervallen van 24 uur met behulp van de confocal microscopie (Figuur 2). Tijdens de cultuur van de eierstok weefsels voor 3 weken, meest follikelgroei en secundaire follikels zijn gedegenereerd door follikel atresie en sommige waren algemeen (Fig...

Discussie

In deze studie ontwikkelden we twee nieuwe methoden voor het bestuderen van de ontwikkeling van de follikel in de eierstokken van de muis. De eerste methode houdt cultuur van gesneden ovariële volwassen muizen weefsels gevolgd door analyse van de ontwikkeling van de follikel en de tweede impliceert het gebruik van time-lapse imaging om te visualiseren van de vroege ontwikkeling van de follikel tijdens de gonadotrofinen-onafhankelijke-fase. Eerder, wij de huidige eierstok weefselkweek methode gebruikt ter beoordeling van ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Follicle stimulerend hormoon uit menselijke hypofyse	SIGMA	F4021
Luteïniserend hormoon uit paardenhypofyse	SIGMA	L9773
Penicilline-streptomycine oplossing	Wako Pure Chemical Industries	168-23191
MEM a, GlutaMax, geen nucleotiden	Thermo Fisher	32561037
Glasbodemschaal	MatTek	P35G-0-10-C	35mm schaal, No. 0 dekglas, 10mm glasdiameter
Millicell celkweekinsert	Merck Millipore	PICM0RG50	Diameter: 315 mm, poriegrootte: 0,4 mm, materiaal: hydrofiel PTTE
3,5 cm celkweekschalen	greiner bio-one	627160
50 ml / centrifugeerbuis met drievoudig afsluitdop	IWAKI	2345-050
Laagprofiel wegwerpmessen 819	Leica	14035838925
LSM 710	Carl Zeiss		Confocale microscoop
CellVoyager, CV1000	Yokogawa Electric Corporation		Time-lapse beeldvorming
BZ-X700	KEYENCE		Time-lapse beeldvorming