Efficiënte reiniging en LC-MS/MS-based Assay ontwikkeling voor tien-elf translocatie-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Summary

Hier presenteren we een protocol voor een efficiënte Macrostap zuivering van de actieve niet-gelabelde mens tien-elf translocatie-2 (TET2) 5-methylcytosine-dioxygenase met behulp van ionenwisselingschromatografie- en haar kwantitatieve analyse met behulp van een vloeibare chromatografie-tandem-massa spectrometrie (LC-MS/MS)-gebaseerde aanpak.

Abstract

De epigenetische transcriptieregulatie gemedieerd door 5-methylcytosine (5mC) heeft een cruciale rol gespeeld in eukaryotische ontwikkeling. Demethylatie van deze epigenetische merken gebeurt door oxidatie van de sequentiële door tien-elf translocatie dioxygenases (TET1-3), gevolgd door de thymine-DNA glycosylase-afhankelijke base excision repair. Inactivering van het TET2 gen als gevolg van de genetische mutaties of door andere Epigenetische mechanismen wordt geassocieerd met een slechte prognose bij patiënten met uiteenlopende kankers, vooral hematopoietische maligniteiten. Hier beschrijven we een efficiënte Macrostap zuivering van enzymatisch actieve niet-gelabelde menselijke TET2 dioxygenase met cation exchange chromatografie. Verder bieden we een benadering van de vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) die kan scheiden en kwantificeren van de vier normale DNA-basen (A, T, G en C), evenals de vier gewijzigde cytosine honken (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl en 5-carboxyl). Deze test kan worden gebruikt om te evalueren van de activiteiten van wild type en mutant TET2 dioxygenases.

Introduction

De C5-positie van cytosine honken binnen apr dinucleotides is de site (5mCpG) van de overheersende methylering in zoogdieren genomen¹. Daarnaast een aantal recente studies hebben blootgelegd uitgebreide C5 cytosine methylering (5mC) in niet-CpG sites (5mCpH, waar H = A, T of C)^2,3. 5mC wijziging dient als een transcriptionele demper op endogene retrotransposons en gene initiatiefnemers^3,4,5. Methylation van DNA bij 5mC speelt ook een belangrijke rol in de inactivering van het X-chromosoom, gene inprenting, nucleaire herprogrammering en weefsel-specifieke gen expressie^5,6,7. Methylering van cytosine op de C5-positie is uitgevoerd door DNA methyltransferases en mutaties in deze enzymen veroorzaken aanzienlijke developmental gebreken⁸. De verwijdering van 5mC merken worden geïnitieerd door TET1-3 5mC oxidasen^9,10. Deze TET-familie dioxygenases converteren 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) door oxidatie van de opeenvolgende stappen^11,12,13. Tot slot vervangt thymine-DNA glycosylase 5fC of 5caC naar ongewijzigde cytosine met behulp van de base excision repair traject¹¹.

Het menselijk TET2 -gen werd geïdentificeerd als een vaak gemuteerde gen in uiteenlopende hematopoietische maligniteiten waaronder myelodysplastic syndromes (MDS)^14,15,16, MDS-myeloproliferatieve gezwellen ( MDS-MPN), en acute myeloïde leukemie (AML) afkomstig van MDS en MDS-MPN¹⁶. De niveaus van 5hmC wijziging in het beenmerg DNA zijn lager bij patiënten met TET2 mutaties vergeleken met degenen met wild-type (wt)-TET2¹⁴. Een aantal groepen hebben ontwikkeld TET2-knock-out Muismodellen te verhelderen van haar rol in de normale Haematopoiese en myeloïde transformatie^17,18,19,20. Deze muizen met mutaties in het gen TET2 waren aanvankelijk normale en levensvatbaar, maar uiteenlopende hematopoietische maligniteiten gemanifesteerd als ze ouder die hun vroege dood veroorzaakt. Deze studies toonden de belangrijke rollen gespeeld door de wt-TET2 bij normale hematopoietische differentiatie. In deze Muismodellen heterozygoot hematopoietische stamcellen (TET2^+/- HSCs) en het homozygoot TET2^{- / -} had HSCs een concurrentievoordeel ten opzichte van homozygoot wt-TET2 HSCs in de hematopoietische lineages repopulatie als beide TET2^+/- en TET2^{- / -} HSCs ontwikkeld divers hematopoietische maligniteiten^17,18. Deze studies tonen aan dat haploinsufficiency van TET2 dioxygenase de ontwikkeling van HSCs verandert en resulteert in de hematopoietische maligniteiten.

Gelijkaardig aan muizen met mutaties in het gen TET2, meeste leukemie-patiënten manifesteren haploinsufficiency van TET2 dioxygenase activiteit. Deze meestal heterozygoot somatische mutaties omvatten frame-shift en nonsense mutaties verspreid over het TET2 gen lichaam terwijl missense mutaties die het meeste geclusterd in het dioxygenase domein¹². Tot op heden wordt weinig karakterisering van de wt - en mutant-TET2 gemeld in de literatuur voornamelijk te wijten aan problemen met de productie van TET2 dioxygenase en haar assay-²¹. Wij rapporteren hier een eenvoudige stap voor stap zuivering van de inheemse TET2 dioxygenase met behulp van ionenwisselingschromatografie. Een kwantitatieve bepaling van de LC-MS/MS was verder geoptimaliseerd en gebruikt voor het meten van de enzymatische activiteit van inheemse TET2 dioxygenase.

Protocol

1. klonen en zuivering van niet-gecodeerde menselijke TET2 Dioxygenase

1. Het klonen van menselijke TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 Δ1481-1843) in de pDEST14 bestemming vector met behulp van de site-specifieke recombinatie techniek als eerder beschreven²².
   Opmerking: De vorige studies hebben aangetoond dat de C-terminal TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 Δ1481-1843) domein de minimale catalytically actieve domein^{21,23 is}. Om uit te drukken de ongecodeerde TET2 dioxygenase domein met behulp van het pDONR221 vector, werden Shine Dalgarno en Kozak sequenties verwerkt in de voorwaartse primer tijdens PCR (tabel 1).
2. Voor bacteriële transformatie, voeg 1 µL van recombinante pDEST14 expressie vector met niet-gecodeerde menselijke TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 Δ1481-1843) naar 100 µL van chemisch bevoegde E. coli BL21 (DE3) cellen in een tube van 1,7 mL. Houd het mengsel op het ijs gedurende ten minste 15 minuten gevolgd door warmte schok bij 42 ° C gedurende 30 s in een waterbad.
   1. Houd onmiddellijk na de schok van de warmte, de cellen terug op het ijs gedurende ten minste 2 min. Daarop 250 µL van super optimale bouillon met onderdrukking van de omzettingsproducten (S.O.C media) aan cellen toevoegen. Incubeer de bacteriecellen gedurende 1 uur bij 37 ° C in een shaker.
   2. Na incubatie, spin down de cellen door centrifugeren van de buis bij 9000 x g gedurende 1 min. Discard 70% supernatant door pipetteren en ontbinden van de pellet in links over media.
   3. Verspreid de celsuspensie op een Luria Bouillon (LB) agarplaat met 100 µg/mL ampicilline. Incubeer de plaat gedurende 16 uur bij 37 ° C.
3. Selecteer één geïsoleerde kolonie en het in LB-ampicilline media in een tube van 50 mL 10 mL beënten. Incubeer de buis bij 37 ° C in een shaker voor overnachting. Daarop kunt 100 µL van de cultuur van de tube 50 mL 100 mL LB-ampicilline media beënten. Incubeer de kolf bij 37 ° C op een shaker bij 180 t/min en gebruik het als primaire cultuur. Volgende dag gebruik 6 mL elke primaire cultuur om te enten 15 kolven, elk met 600 mL LB-ampicilline-media. Nu, incubeer 15 kolven bij 37 ° C op een shaker bij 180 t/min.
   Opmerking: Voor het verifiëren van getransformeerde klonen, uitvoeren DNA sequencing of beperking spijsvertering met de geïsoleerde plasmide DNA.
4. Om te controleren de dichtheid van bacteriële cultuur, meten de OD₆₀₀ met een spectrofotometer. Nadat de cultuur een bevolkingsdichtheid van 0,8 OD_{600 bereikt}, de uitdrukking van TET2 eiwit met 300 µL van 1 M (eindconcentratie van 0,5 mM in 600 mL) IPTG in elke kolf induceren en verder groeien de cultuur voor 16 h bij 17 ° C.
5. Na 16 h, wordt de bacteriecultuur overbrengen door centrifuge flessen. Centrifugeer de bacteriecultuur uiting van het TET2-enzym bij 5,250 x g gedurende 45 min. Gebruik de bacteriële pellet voor zuivering van de TET2.
   Opmerking: Alle resterende eiwit zuivering stappen op het ijs of bij 4 ° C. uitvoeren
6. Resuspendeer de pellet van bacteriële in 100 mL 50 mM MES (2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur) buffer, pH 6 en bewerk ultrasone trillingen ten voor 5 × 30 s op kracht 20 met 60 s koeling intervallen.
7. Draai de lysate bij 5,250 x g gedurende 45 min. verzamelen het supernatant met het oplosbare TET2 enzym en passeren van 0,45 µm filters vóór het laden op een FPLC systeem.
   Opmerking: In deze experimenten, het enzym van de TET2 was zeer stabiel, maar indien nodig een protease inhibitor cocktail met 1 mM benzamidine-HCl, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), en 0,5 mM 1,10 -o- phenanthroline kunnen worden toegevoegd aan de cel lysate aan voorkomen dat de afbraak van TET2 enzym. Vermijd het gebruik van EDTA of EGTA in de Inhibitor van de omwenteling cocktail als dit met de volgende catie-uitwisseling-chromatografie interfereren kunnen.
8. Pack 30 mL van een sterke cation exchange hars in een kolom van de FPLC. Equilibreer de kolom met 10 kolomvolumina van was buffer (50 mM MES buffer, pH 6) tegen het tarief van de constante stroom van 0.3 mL/min met behulp van een FPLC systeem.
9. Laden de geklaarde lysate op de kolom vooraf zijn geëquilibreerd en wassen met ∼10 kolomvolumina van was buffer totdat de stroom door duidelijk wordt.
10. Elueer TET2 met behulp van een 0-100% helling uit de buffer wassen aan de elutie buffer (50 mM MES buffer, pH 6, 1 M NaCl) in 15 kolomvolumina gevolgd door bedrijf aan 100% elutie buffer voor twee-kolomvolumina.
    Opmerking: Het verzamelen van monsters (van elke 100 µL) van cel lysate vóór en na kolom laden samen met de elutie van alle fracties en analyseren op 10% oplossing van SDS-pagina.
11. Zwembad de breuken die TET2 eiwitten bevatten, droge bevriezen, ontbinden enzym pallet in 10 mL water en winkel bij-80 ° C.

2. 5mC oxidatie door TET2 Dioxygenase

1. Voer alle demethylatie reacties in drievoud met 3 µg substraat (25-mer dubbele gestrande DNA, tabel 2).
   1. Toevoegen van 100 µg van gezuiverde TET2 enzym in 50 µL van de totale reactie buffer met 50 mM HEPES (pH 8,0), 200 µM FeSO₄, 2 mM 2OG (2-oxoglutarate/α-ketoglutarate), en 2 mM ascorbaat en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 h²¹.
   2. Doven TET2 gekatalyseerd oxidatiereacties met 5 µL van 500 mM EDTA.
2. Na het blussen van TET2 reacties, voorbereiden op monsters LC-MS/MS analyse door het scheiden van het DNA van TET2 reactiemengsel oligo zuivering kolommen gebruiken.
   1. Voeg 100 µL van oligo bindende buffer aan 55 µL van gehard reactie.
   2. Voeg daarop 400 µL ethanol 100% toe aan het mengsel. Laat dit mengsel door een oligo bindende kolom.
   3. Wassen van afhankelijke DNA met 750 µL was buffer en elueer in 20 µL water.
3. De geïsoleerde DNA met 2 eenheden van DNase verteren I en 60 eenheden van S1 nuclease bij 37 ° C gedurende 12 h tot individuele nucleoside-monophosphates.
4. Na vertering, 2 units van kalf intestinale alkalisch fosfatase (CIAP) toevoegen in de monsters en incubeer gedurende toevoeging 12u bij 37 ° C om de terminal fosfaat groepen van nucleoside-monophosphates nucleosiden verkrijgen.
5. Kwantificeren van alle nucleosiden, vooral gemodificeerde cytosines, met behulp van de onderstaande LC-MS/MS methode.

3. kwantitatieve LC-MS/MS-based Assay ontwikkeling

1. Bereiden van 100 µM-stockoplossing van alle gewijzigde cytosine nucleosiden [5-methyl-2-deoxycytidine (5mdC), 5-hydroxymethyl-2′-deoxycytidine (5hmdC) 5-formyl-2 '-deoxycytidine (5fdC) en 5-carboxy-2 '-deoxycytidine (5cadC)] en normale DNA bases (adenine, thymine, cytosine, en guanine) in HPLC-grade water voor de ontwikkeling van de LC-MS/MS methode.
2. Optimaliseren van nucleoside-afhankelijke MS/MS parameters door infusie van stamoplossingen, één filter tegelijk, in massaspectrometer op een debiet van 10 µL/min bij EMS scanmodus. Optimaliseren na parameters: Declustering potentiële (DP), ingang potentiële (EP), botsing cel ingang potentiële (CEP), botsing energie (CE) en botsing cel Exit potentiële (CXP) voor elk DNA nucleoside met kwantitatieve optimalisatie geautomatiseerde functie van de software.
3. Optimaliseren bron-afhankelijke MS/MS parameters door injecterend 10 µL van stockoplossing met behulp van een verloop met 25% oplosmiddel B op een debiet van 0.3 mL/min waar oplosmiddel A is 10 mM ammoniumacetaat (pH 4.0) en oplosmiddel B is 20% acetonitril met 10 mM ammoniumacetaat (pH 4.0). Optimaliseren na parameters: gordijn Gas (CUR): 10-50, temperatuur: 0-600 ° C, Gas Flow 1 (GS1): 0-50, Gas Flow 2 (GS2): 0-50, Collisionally geactiveerd dissociatie (CAD): laag-Medium-High, Ion spuiten spanning (IS): 4000-5500 voor elke DNA nucleoside met behulp van de handleiding kwantitatieve optimalisatie functie van de software in de modus van de FIA (Flow injectie analyse).
4. Uitvoeren om te scheiden van alle acht DNA nucleosiden, vloeibare chromatografie met behulp van de volgende verloop: 0% oplosmiddel B (0-2 min), 0-20% oplosmiddel B (2-5 min), 20-60% oplosmiddel B (5-9 min), 60-0% oplosmiddel B (9-10 min) en vervolgens equilibreer met oplosmiddel A gedurende 5 minuten op een debiet van 0.3 mL/min in een C18 kolom (deeltjesgrootte: 5 µm, porie-grootte: 120 Å).
5. Met behulp van de optimale parameters voor MS/MS (stap 3.2 en 3.3) in combinatie met het bovengenoemde vloeistofchromatografie verloop (stap 3.4), bepalen de reactie lineariteit aantoonbaarheidsgrens (LOD) en de ondergrens van de kwantificering (Ondergrens) met behulp van een twee-voudige seriële verdunning van een 100 µM standaard mengsel dat bevat alle acht nucleosiden. Standaard curven voor alle acht DNA nucleosiden tekenen.
6. Detecteren en kwantificeren van alle nucleosiden, vooral gemodificeerde cytosines, geproduceerd in stap 2.4 met behulp van de LC-MS/MS methode en standaard curven.

Results

Dynamische wijziging van 5mC in DNA door TET-familie dioxygenases speelt belangrijke rol in de epigenetische transcriptionele verordeningen. TET2 dioxygenase is vaak gemuteerd in uiteenlopende hematopoietische maligniteiten¹². Om te onderzoeken de rol van het TET2-enzym bij normale ontwikkeling en ziekte, hebben we het minimale catalytically actieve domein zonder enige affiniteit-tag in de pDEST14 vector²²gekloond. De niet-gecodeerde TET2 di...

Discussion

Mutaties in TET2 gen zijn enkele van de meest frequent aangetroffen genetische veranderingen bij patiënten met uiteenlopende hematopoietische maligniteiten. Tot nu toe honderden van verschillende TET2 mutaties, waaronder onzin, frame-shift en missense mutaties, zijn geïdentificeerd in patiënten¹². Patiënten met TET2 mutaties weergeven lage niveaus van genomische 5hmC in het beenmerg vergeleken met degenen met wt-TET2¹⁴. Mutant TET2 knock-in experimenten he...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Carbosynth	FH31182
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8633
α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)	Sigma-Aldrich	K1750
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	A1542
Acetonitrile	Fisher Scientific	75-05-8
HPLC grade water	Fisher Scientific	7732-18-5
Oligo clean and concentrator	Zymo Research	D4061
DNAse I	New England Biolabs	M0303S
S1 Nuclease	Thermo Scientific	ENO321
CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)	New England Biolabs	M0290S
LB Media	Affymetrix	J75852
IPTG	Carbosynth	EI05931
MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]	Carbosynth	FM37015
Sodium chloride	Fisher Scientific	7647-14-5
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
SP Sepharose	Fisher Scientific	45-002-934
2'-Deoxy-5-methylcytidine	TCI	D3610
2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine	TCI	D4220
2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt	Berry & Associates	PY 7593
5-Formyl-2'-deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7589
2'-Deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7216
2'-Deoxyadenosine	Carbosynth	ND04011
2'-Deoxyguanosine	Carbosynth	ND06306
2'-Deoxythymidine	VWR Life Science	97061-764
Gateway technology	Thermo Fisher	11801016
Beckman Allegra X-15R centrifuge	Beckman Coulter	392932
Sonic Dismembrator 550	Fisher Scientific	XL2020
ÄKTA FPLC system	Pharmacia (GE Healthcare)	18116468
FreeZone 4.5 freeze dry system	Labconco	7750020
Zymo Oligo purification columns	Zymo Research	D4061
BDS Hypersil C18 column	Keystone Scientific, INC	105-46-3
3200 Q-Trap mass spectrometer	AB Sciex
HPLC	Shimadzu HPLC
XK16/20 FPLC column	Pharmacia (GE Healthcare)	28988937