Verkennen van de mogelijkheden van mesenchymale stamcellen blad over de ontwikkeling van hepatocellulaire Carcinoma In Vivo

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van een in vivo kanker model met behulp van blad celtechnologie. Een dergelijk model zou zeer nuttig zijn voor de evaluatie van antikanker therapeutics.

Abstract

Een in vivo dierlijk model dat menselijke kanker nabootst kon hebben verschillende toepassingen die belangrijke klinische informatie leveren. De momenteel gebruikte technieken voor de ontwikkeling van in vivo kanker modellen hebben aanzienlijke beperkingen. Daarom willen we in deze studie, cel blad technologie voor de ontwikkeling van een in vivo kanker model implementeren. Hepatocellulaire carcinoom (HCC) is met succes ontwikkeld bij naakte ratten met behulp van cel sheets gemaakt van HCC cel lijn cellen. De bladen van de cel kanker worden gegenereerd door intracellulaire hechting en de vorming van een gestratificeerde structuur, gecontroleerd door de extracellulaire matrix. Dit zorgt voor de HCC blad transplantatie in de lever en de oprichting van een dierlijk model van tumor-dragende binnen een maand. Daarnaast is de rol van mesenchymale stamcellen (MSC) in de ontwikkeling van deze kanker-model onderzocht. Naast de cellaag lijn HCC, een andere cel van de twee bladen zijn gemaakt: een vel van HCC cellen, beenmerg MSCs (BMMSCs) en een blad van HCC cellen en navelstreng MSCs (UCMSCs). Bladen die een combinatie van zowel HCC cellen en MSCs hebben zijn ook geschikt voor het produceren van een tumor-dragende dieren. Echter, de toevoeging van MSCs vermindert de grootte van de gevormde tumor en dit negatieve effect op de ontwikkeling van tumor varieert afhankelijk van de gebruikte MSCs bron. Dit geeft aan dat een cellaag gemaakt van bepaalde MSC-subtypen kan worden gebruikt in de tumor beheers- en controlesystemen.

Introduction

HCC is een primaire kanker van de lever die wordt sterk geassocieerd met een slechte prognose. Jaarlijks, bijna een half miljoen nieuwe patiënten zijn gediagnosticeerd met HCC, die 85% van lever kanker patiënten wereldwijd¹vertegenwoordigen. Hepatocarcinogenesis is geen enkele vorm ziekte; het is veeleer een verzameling van ziekten die hebben verschillende histopathologische kenmerken en genetische en genomische variabiliteit, in aanvulling op gevarieerd prognostische resultaten¹. Daarom zijn de belangrijkste uitdagingen bij de ontwikkeling van een effectieve therapeutische strategie voor HCC de beperkte kennis van HCC biologie en het gebrek aan een geschikte experimentele diermodel die kan helpen bij het begrijpen van deze ingewikkelde ziekte. Een in vivo dierlijk model dat menselijke kanker nabootst is nodig voor de selectie van kandidaat-genen en identificeren van prognostic/voorspellende markers betrokken in de inductie van kanker, maar ook voor het onderzoeken van de verschillende factoren die invloed kunnen hebben op kanker reacties aan therapeutische middelen.

In vitro studies van kanker zijn nog steeds geassocieerd met grote beperkingen. Dit is vanwege het feit dat kankercellen veel van hun functies in vivo verliezen als in cultuur gehandhaafd. De veranderingen die aan cellen in vitro resultaat van de afwezigheid van de Fysiologie van de hele weefsel in een ex vivo -instelling optreden. Kanker cel-naar-cel interactie (stromale, immuun, therapieën, epitheliale, enz.) binnen de tumor communicatie weerspiegelt sterk op kanker cel kenmerken². De communicatie van de tumor kan kanker cel gen/eiwit expressie en fenotypische kenmerken, naast angiogenetic en gemetastaseerde potentieel wijzigen. Het tweedimensionale (2D) in vitro cultuur systeem ontbreekt ook een matrix geschikt weefsel, hetgeen noodzakelijk is voor het reguleren van de progressie van de tumor. Dus, als gevolg van deze beperkingen, in vivo modellen moeten altijd worden benut ter ondersteuning van de voorlopige bevindingen van in vitro modellen. In deze studie gebruiken we celtechnologie blad te ontwikkelen van een in vivo dierlijk model dat verklaart het volledige biologische proces ten grondslag liggen aan de HCC.

Meer dan een decennium geleden, Okano van laboratorium gevestigd een nieuwe methode van weefselengineering gebaseerd op cel blad technologie³. Deze techniek maakt gebruik van een plastic thermo-responsieve cultuur zodat omkeerbare cel adhesie/detachement door het beheersen van de oppervlakte hydrophobicity. Met deze methode kunt een zachte oogsten van gekweekte cellen in een intact driedimensionale (3-D) formaat (i.e.,cell blad), met een goed onderhouden extracellulaire matrix (ECM) en cel-naar-cel interacties. De cel blad techniek vereist de precoating van cultuur gerechten met een poly(N-isopropylacrylamide) van de temperatuur-responsieve polymeer (PIPA ben), dat is commercieel beschikbaar en klaar voor gebruik. Bij een temperatuur lager dan 20 ° C, PIPA ben polymeren worden gehydrateerd en ontbinden in waterige oplossingen, overwegende dat bij een hogere temperatuur (37 ° C), de polymeren gedroogd worden en tot een troebel neerslag omvormen. Het polymeer bevat hydrofiele amide kettingen en hydrofobe zijketens (isopropyl groepen). Bij hoge temperaturen, wordt de Brownse beweging van de watermoleculen versterkt, dat bij een lage temperatuur, de moleculen van het water rondom de isopropyl-groepen van de verdeling gehydrateerd structuur en de groepen van hydrofobe isopropyl statistische vanwege de hydrofobe interacties. Daarom is de gehele keten van het polymeer aggregaten en precipitaten⁴.

In de gepresenteerde studie, is deze techniek ingezet om te ontwikkelen een HCC dierlijk model met behulp van drie verschillende cel sheets. Het eerste blad dienst bestaat uit HCC cel lijn cellen alleen, terwijl de andere twee platen bestaan uit een combinatie van HCC cel lijn cellen en MSCs uit twee verschillende bronnen: beenmerg MSCs (BMMSCs) en de navelstreng MSCs (UCMSCs). MSCs zijn niet-hematopoietische stromale cellen die kunnen differentiëren intocell derivaten van de mesenchymale afkomst, met inbegrip van adipocytes, osteocytes, chondrocyten en myocytes⁵. De reden dat we deze cellen in dienst bij het maken van de cellaag van kanker is de inconsistente rapportage over het effect van MSCs op kanker. Er is gesuggereerd dat MSCs kunnen het hebben van twee verschillende fenotypes: "MSC1", een proinflammatoire fenotype, en "MSC2", een immunosuppressieve fenotype⁶. MSCs express toll-like receptoren (TLRs). TLR4 priming van MSCs verhoogt de secretie van proinflammatoire factoren, terwijl TLR3 priming de secretie van immunosuppressieve factoren^{6 verhoogt}. Een in vitro studie van deze twee fenotypes gemeld dat een gezamenlijke cultuur van MSC1 met kanker cellijnen kanker-celgroei, verzwakt terwijl MSC2 co cultuur had het tegenovergestelde effect-⁷. Dit impliceert dat MSCs Pro-kanker of AntiKanker, afhankelijk van hun fenotype kunnen. Dus, naast de ontwikkeling van de HCC diermodel met behulp van blad celtechnologie, we willen verkennen van het effect van MSC transplantaties ontwikkelingssamenwerking van de tumor, en met behulp van deze cellen zal verbeteren of verminderen van de ontwikkeling van dit model.

Protocol

Het protocol volgt de dierenverzorgers richtsnoeren van de ethische commissie van de Universiteit van Koning Saud. Chirurgische ingrepen, anesthetica en andere medicijnen gebruikt op dieren worden goedgekeurd door Koning Saud Universiteit van ethisch comité. Alle experimenteel werk wordt uitgevoerd door naar behoren opgeleid personeel.

1. cel blad bouw

1. De gerechten van de cultuur (3,5-cm temperatuur-responsieve cultuur gerechten) jas met onverdunde foetale runderserum (FBS) en zorgen ter dekking van alle van het oppervlak van de schotel.
   Opmerking: Deze stap is belangrijk voor het losmaken van de cellaag, aangezien het de groei van de cellen in een enkelgelaagde ondersteunt en voorkomt cel aggregatie dat.
2. Incubeer de gerechten gedurende 24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO₂ en 95% lucht.
3. Verwijderen van de overtollige FBS uit de gecoate gerechten en laat de gerechten te drogen bij kamertemperatuur (RT) gedurende ten minste 1 uur.
4. Bereiden de drie cel schorsingen: 1 x 10⁶ HepG2 cellen, 1 x 10⁶ HepG2 cellen met BMMSCs en 1 x 10⁶ HepG2 cellen met UCMSCs (in een verhouding van 4:1 voor zowel BMMSCs als UCMSCs).
5. Zaad de juiste celsuspensie aan elk gelabelde gerecht.
6. Alle cellen in DMEM kweekmedium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine opschorten.
7. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO₂ en 95% lucht.

2. cel blad detachement

1. Bij 100% cel samenvloeiing, neemt u de gerechten uit de 37 ° C incubator.
2. Incubeer de HepG2 cel blad schotel voor 1 h op RT, terwijl de HepG2/BMMSC en HepG2/UCMSC cel blad gerechten gedurende 30-40 minuten bij 20 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO₂ en 95% lucht aan het broeden.
   Opmerking: De cellaag gemaakt van alleen HepG2 is kwetsbaar; vermindering van de temperatuur tot 20 ° C veroorzaakt schade aan de structuur van het blad.

3. prestaties van de chirurgische ingreep.

Opmerking: Tijdens de incubatietijd voor de cel blad detachement, de dierlijke procedure starten.

1. Instructies voor de bereiding van het gebied van chirurgie
   1. Alle chirurgische ingrepen in een steriele aparte ruimte binnen het laboratorium, zoals een capuchon, laminaire flow kabinet of een aseptische operatie kamer gedrag. Zorg ervoor dat alle oppervlakken van het gebied van chirurgie niet-poreus, verzegelde, duurzaam en sanitizable.
   2. Draag goede beschermende kleding, met inbegrip van scrubs, handschoenen, gezichtsmaskers en hoofd en schoen dekt.
   3. Gebruik chirurgische instrumenten die zijn schoon en gesteriliseerd (via autoclaaf; verzadigde stam onder hoge druk) aan het begin van de operatie.
   4. Handschoenen tussen ratten wijzigen
2. Voorbereiding van het dier voor chirurgie
   1. Gebruik van 8 tot 12-weken oude naakte ratten.
   2. Injecteerbare anesthesie voor ratten maken
      1. Ter voorbereiding van de verdoving oplossing, ketamine-xylazine, mix van 2 mL van ketamine, xylazine (bij een concentratie van 20 mg/mL) 1 mL en 1 mL steriele fysiologische zoutoplossing (b.v., natriumchloride 0,9%) in een steriele 10 mL serum collectie flesje en schud goed voor gebruik.
      2. Om toe te passen anesthesie, 0.2 mL van de oplossing van ketamine-xylazine per 100 g lichaamsgewicht van de rat intraperitoneally te injecteren.
         Opmerking: De totale dosis van de oplossing is 100 mg/kg van ketamine en 10 mg/kg xylazine.
   3. Het verwijderen van zichtbaar vuil/puin van de chirurgische site.
   4. Controleer de diepte van de verdoving door te testen van de pedaal terugtrekking reflex (voet pad snuifje op beide achtervoeten).
      Opmerking: Als de voet pad snuifje een reactie veroorzaakt, herhaal bij een dosis van 0,05 mL/100 g (ongeveer elke 30 min), en vervolgens gecontroleerd of de verdoving diepte.
   5. Desinfecteer het operatie gebied met een twee-traps scrub Povidon-jodium/isopropanol.
   6. Dekking van de rat met een steriele draperen om verontreiniging van de snede te voorkomen.
   7. De ratten subcutaan injecteren met buprenorfine (0,01 - 0,05 mg/kg)⁸ alvorens de incisie.
   8. Maak met een steriel scalpel een 7 - tot 10-cm gesneden tussen de huiden en onderliggende spieren bloot van de lever.
      1. De buikspier te scheiden van de huid met de vlakke achterkant rand van de scalpel.
      2. Zorgvuldig steek de linea alba met behulp van een scalpel en de verlaging uit te breiden met een scherpe schaar.

4. cel blad transplantatie

Opmerking: Cel blad transplantatie wordt uitgevoerd op de lever.

1. Verzamel de cellaag van de cultuur-schotel.
   1. Zachtjes Tik op de schotel cultuur over de Bank om los van het blad van het oppervlak te maken.
   2. Scheiden de cellaag van de schotel van oppervlak door schrapen van de rand van het blad in een halve cirkel met behulp van een steriele pipette uiteinde.
   3. Het gehele medium uit de cultuur-schotel voorzichtig te verwijderen.
   4. Zorg ervoor het blad intact zonder enige schade; anders, het kan niet worden gebruikt (Figuur 1).
      Opmerking: De resulterende bladen kunnen worden gedetecteerd rechtstreeks door het oog.
2. Een steriele membraan (filtreerpapier) om te oogsten van de cellaag van de schotel te bereiden.
   1. Ten eerste, geniet het membraan met normale zout. Verwijder vervolgens de overmaat zoutoplossing met een steriele wattenschijfje.
   2. Plaats de natte membraan op de cellaag, terwijl het vermijden van kreukels en luchtbellen tussen het membraan en het blad van de cel.
   3. Voeg enkele druppels van normale zout over het membraan en de cellaag hen gemakkelijker te verzamelen.
      Opmerking: Om te voorkomen breken de cellaag, niet koud zoutoplossing gebruiken en til het membraan en de cellaag met een tang.
   4. Laat het membraan voor een paar seconden om ervoor te zorgen dat de cellaag goed is aangesloten op het membraan, en dan het verzamelen.
3. De lever voorbereiden op cel blad transplantatie.
   1. Zorg ervoor dat de lever oppervlak is droog door zachtjes te tikken op het met een steriele wattenschijfje.
   2. Plaats het membraan met de cellaag met steriel pincet, over een enkele kwab van de rat lever.
   3. Voeg een paar druppels van steriele zoutoplossing en een zachte druk uitoefenen op het membraan loskoppelen van het blad van de cel uit.
   4. Wacht 5 minuten voordat zorgvuldig verwijderen van het membraan.
      Opmerking: Dit is gedaan om ervoor te zorgen dat de cellaag goed is aangesloten op de lever.
   5. Ten slotte sluit de onderliggende spieren en huid insnijdingen met 5-0 nylon hechtingen.
   6. Desinfecteer het operatie gebied met Povidon-jodium.
      Opmerking: Figuur 2 toont een diagram van de cel blad transplantatie procedure op de lever van een naakte rat.

5. na chirurgie Care

1. Onmiddellijk na de operatie, huis van de rat individueel Voorkom kannibalisme of verstikking en controleren regelmatig (ten minste elke 15 min) totdat het bewuste en volledig ambulant.
2. Vervolgens beoordelen de rats dagelijks voor 5-14 d, ten minste 5 d post-operatively, om ervoor te zorgen dat er geen complicaties zijn. Tijdens de dagelijkse beoordeling, zorg voor de volgende.
   1. De wond is gesloten, en de hechtingen zijn intact, zonder overdreven strak.
   2. Er zijn geen tekenen van infectie in de incisie site, zoals warmte, overdreven zwelling of purulent kwijting.
   3. Er zijn geen tekenen die pijn, zoals de verminderde consumptie van voedsel en water, gewichtsverlies, uitdroging, huid tenting of snelle en open Mondademhaling is gekoppeld. Naar besturingselement matige tot hevige pijn na operatie, indien van toepassing, injecteren de rats subcutaan met buprenorfine (0,01 - 0,05 mg/kg) elke 6-8 h⁹ voor een minimum van 48-72 uur postoperatief.

6. analyse van het getransplanteerde gebied

1. Een maand na de transplantatie, scarifice de rat en het verzamelen van de getransplanteerde gebied voor histologisch en analyse van immunohistochemical.

Results

Tumorigeniciteit van getransplanteerde cel bladen in ratten:

Een maand na de transplantatie, hebben alle getransplanteerde cel bladen in ratten levers ontwikkeld tumoren (Figuur 3). De gemiddelde grootte van de ontwikkelde tumoren uit HepG2, HepG2/BMMSC en HepG2/UCMSC cel bladen waren 4,5 cm, 4 cm en 2,5 cm, respectievelijk¹⁰.

Discussion

Een uitgebreide hoeveelheid onderzoek is gewijd aan de ontwikkeling van een adequaat in vivo preklinische diermodel strekking menselijke kankers. Op dit moment betrekken de belangrijkste benaderingen gebruikt voor het maken van kanker diermodellen genetische manipulatie en cel transplantatie¹¹. Genetisch gemodificeerde dierlijke modellen zijn goede instrumenten voor de identificatie en validatie van de doelgenen, evenals het begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen a...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
FBS	Gibco/Invitrogen	10270106
DMEM hoge glucose	Sigma	D5671-500ML
Penicillin/streptomycin	Life Technology	15070063
Steriele fysiologische zoutoplossing	Sigma	S0817-1GA
Humane HepG2-cellijn	ATCC, USA	HB-8065
Humane beenmerg MSCs-cellijn	PromoCell, USA	C-12974
Menselijke navelstrengweefsel MSCs	PromoCell, USA	C-12971
Ketamine 50%	Rompun, Bayer
Xylazine 2%	Rompun	23076-35-9
Alphadine® oplossing.	Riyadh Pharma	LBL0816
Dispositieven:
15mL Polypropyleen Hoog Helderheid PP Centrifugeerbuisjes	Falcon	352097
3,5 cm steriele UpCell kweekschalen met het filterpapier (membraan)	Sigma	174904-1CS
100-1000 µl  Pipetpunten	Sigma	CLS4868-1000EA
Basisprocedure-sluier	Thermofisher	PMD5293.0
Apparatuur
Plus pipet, variabel volume	Eppendorf® Research®	Z683779-1EA
Weefselkweekincubator 37 °C, 5% CO2	Elk merk
Biologische veiligheidskast	Elk merk
Weefselkweekincubator 20 °C, 5% CO2	Elk merk
Steriele chirurgische gereedschappen en naakte ratten:
Forceps
Schaar
scalpel
Nylonnaald  5-0	Accutome	AB-3854S	Monofilament, Lancet
1 ml Tuberculinesyringen	Fisher Scientific	14-826-88
Naakte ratten	Charles river