Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Samenvatting

We beschrijven een gemodificeerde kleinschalige extractie en colorimetrische vitrotests van lactaat en pyruvaat in de nematode C. elegans. Bij gebruik van commerciële assay kits, is de technische ontwikkeling van hun gevoeligheid en nauwkeurigheid belangrijk. Eiwit neerslag in extractie is de meest kritische stap voor de kwantitatieve bepaling van intracellulaire metabolieten.

Samenvatting

Lactaat en pyruvaat zijn belangrijke tussenproducten van intracellulaire energie metabolische routes. Toezicht op de lactaat/pyruvaat ratio in cellen helpt om te bepalen of er een onbalans in de leeftijdsgebonden energiemetabolisme tussen Mitochondriale oxidatieve fosforylatie en aërobe glycolyse. Hier, laten we het gebruik van commerciële colorimetrische bepaling kits voor lactaat en pyruvaat in de model-organisme C. elegans. Onlangs, de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de colorimetrische/fluorimetrische assay kits zijn verbeterd sterk door onderzoek en ontwikkeling olv reagens fabrikanten. De verbeterde reagentia hebt ingeschakeld op het gebruik van kleinschalige tests met een 96-wells-plaat in C. elegans. In het algemeen, is een fluorimetrische assay superieur in gevoeligheid aan een colorimetrische bepaling; de colorimetrische benadering is echter meer geschikt voor het gebruik in gemeenschappelijke laboratoria. Een ander belangrijk punt in deze tests voor kwantitatieve bepaling is eiwit precipitatie van gehomogeniseerde C. elegans monsters. In onze eiwit neerslag methode, gemeenschappelijke neerslagmiddelen (bv., trichloorazijnzuur, perchloorzuur en metaphosphoric zuur) worden gebruikt voor de bereiding van de monsters. Een eiwit-gratis test sample wordt bereid door koude neerslaande (eindconcentratie van 5%) tijdens de homogenisering direct toe te voegen.

Inleiding

Lactaat en pyruvaat concentraties worden algemeen beschouwd als tussenproducten van de energie-stofwisseling en zijn gerelateerd aan de Staten van de glycolyse, tricarboxylic acid (TCA) cyclus en elektronentransport keten in de cellen van aerobe organismen. Een reeks reacties in de glycolyse oxideren glucose om pyruvaat, die ligt op een kruispunt van metabole en kan worden geconverteerd naar koolhydraten via gluconeogenese, vetzuren en energiemetabolisme door acetyl-CoA en het aminozuur alanine. De TCA cyclus gebeurt onder de aanwezigheid van voldoende opgeloste zuurstof en is essentieel voor de omzetting van glucose naar energie. Vooral de wijziging van de secundaire metabolisme is een interessant fenomeen waarin glycolyse voornamelijk voor de energieproductie gebruikt wordt en aërobe mitochondriale ademhaling, waarbij de TCA cyclus en het elektronentransport keten, werden in zoogdieren kanker cellen^1,2. We toonden onlangs dat de niveaus van lactaat en de daaruit voortvloeiende lactaat/pyruvaat (L/P)-ratio tijdens veroudering in de model-organisme Caenorhabditis elegans (C. elegans daalde). We vonden ook dat de zoogdieren tumor suppressor p53 ortholog CEP-1 in C. elegans een belangrijke rol in de leeftijd-gerelateerde veranderingen van energiemetabolisme door de activering van de transcriptionele doelstellingen^{3 heeft}.

In biologische testen, zoals het meten van lactaat en pyruvaat concentraties in cellen, zijn de gevoeligheid, de nauwkeurigheid, de steekproefgrootte, en de incubatietijd van colorimetrische/fluorimetrische assay kits verbeterd drastisch. Als gevolg van technologische innovaties zijn we nu in staat om te analyseren verschillende metabolieten en intermediaire metabolieten zonder de grootschalige cultuur van C. elegans, dat is moeilijk gezien de kleine omvang. In het algemeen, is de gevoeligheid van een colorimetrische bepaling een orde van grootte kleiner dan die van een fluorimetrische assay; de colorimetrische benadering is echter meer geschikt in de instelling van gemeenschappelijke laboratoria. Bovendien, een techniek van de extractie met homogenisering en eiwit neerslag is van cruciaal belang voor de kwantitatieve bepaling van de concentratie van lactaat en pyruvaat in C. elegans cellen omdat deze nematode is ingesloten in een exoskelet genaamd de cuticle, in tegenstelling tot zoogdieren gekweekte cel lijnen^4,5. Hier beschrijven we een protocol voor het analyseren van lactaat en pyruvaat concentraties werken met commerciële colorimetrische bepaling kits inclusief tips voor monster extractie van C. elegans.

Protocol

1. gesynchroniseerde cultuur van C. elegans

1. Vóór het zaaien stam cultuur de Escherichia coli (E. coli) OP50 's nachts bij 37 ° C in 300 mL Luria Bertani (LB) Bouillon vloeibare voedingsbodem. Winkel de gekweekte OP50 bij-4 ° C.
   1. Maken van LB Bouillon opgietvloeistof, 10 g trypton, gistextract 5 g, 10 g NaCl en 1,5 mL 1 N NaOH gebruiken, en toevoegen aan 1 L met gedeïoniseerd water. Autoclaaf.
      Opmerking: OP50 en C. elegans stammen zijn beschikbaar vanaf de Caenorhabditis genetica Center (Universiteit van Minnesota, St. Paul, MN, USA).
2. Nematode groei medium (NGM) agar, 3 g NaCl, 2,5 g pepton, 17 g agar, en gebruiken 975 mL gedeïoniseerd water. Autoclaaf. Cool tot 55 ° C, dan sterilely toevoegen, in orde, 1 mL van de 1 M MgSO₄, 1 mL van de 1 M CaCl₂, 1 mL 5 mg/mL cholesterol in EtOH, en 25 mL van de 1 M kalium fosfaat pH 6.0 in 90-mm petrischalen.
   1. Voor 1 M kalium fosfaat pH 6.0, gebruik 108.3 KH₂PO₄ g en 46.6 g. van K₂HPO₄en Voeg gedeïoniseerd water toe tot 1 L. Autoclave⁶.
3. 1-2 mL van de gekweekte OP50 op de platen van de agar NGM verspreid. Incubeer de platen 's nachts bij kamertemperatuur voordat u eventuele nematoden toevoegt om een dun laagje OP50.
   Opmerking: De NGM agar platen die geënte OP50 kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen voor 2-3 weken.
4. Voeg ten minste 100 wormen op een NGM agar bord met OP50, en cultuur bij 20 ° C tot het volwassen stadium. Ten minste drie platen zijn vereist.
5. Verzamelen eieren in utero, overdracht van gravid hermafrodieten aan de drie NGM agar platen elke met 5 mL S buffer in een conische buis 15 mL, en wassen van de wormen 3 keer met 15 mL S buffer met behulp van centrifugeren bij 300 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
   1. Om S buffer, 5,9 g NaCl en 50 mL 1 M kalium fosfaat pH 6.0 gebruiken, voegt u aan 1 L met gedeïoniseerd water. Autoclaaf⁶.
6. Los van de wormen in een alkalische hypochlorietoplossing voor axenization en bulk ei isolatie (0,5 mL verse bleekmiddel of equivalent: 5-6% natriumhypochloriet, 0,1 mL van 10 M NaOH, ongeveer 4.5 mL S buffer)⁶, en de oplossing gedurende 10-15 minuten op staan kamertemperatuur onder omzwenken door omkeren.
   Opmerking: Binnen 15 min, volwassen wormen moeten ontbinden, waardoor een wazige oplossing van eieren bevrijd van hun karkassen (de bevrijde eieren moeten worden bevestigd met behulp van een stereoscopische Microscoop). In plaats van 0,1 mL van 10 N NaOH, kan 0.2 mL 5 N NaOH ook worden gebruikt.
7. Na behandeling van hypochloriet, wassen van de ei-pellet 3 keer met 15 mL S buffer en resuspendeer in 5-6 mL S buffer. De vrijgegeven eieren tijdens een overnachting broedtijd bij 20 ° C in S buffer zonder E. coli voor een leeftijd-synchrone cultuur van L1 fase larven uitkomen.
8. Om te bepalen van het geschatte aantal L1 fase larven, de wormen een stereoscopische Microscoop met 10 µL van S buffer na resuspending van de larven ten minste 3 keer tellen en het gemiddelde berekenen. Vervolgens overdracht van de larven van de fase L1 aan vijf NGM agar platen met OP50 (1500-3000 wormen per plaat met behulp van een petrischaal 90-mm) en cultuur bij 20 ° C, totdat ze zijn uitgegroeid tot de jonge volwassen stadium, wanneer de self-fertilization begint en een paar eieren worden gelegd (gewoonlijk na 3 d ays).

2. extractie van cellulaire fractie van C. elegans

1. Het verzamelen van de jonge volwassen stadium (5-dagen oude dieren) uit de vijf NGM agar platen met S buffer (figuur 1A wormen).
   1. Schakel alleen levende wormen met behulp van de methode van sacharose⁶ voor flotatie op 30% (g/v) sacharose, meng de wormen geschorst in 3-4 mL S buffer met een gelijk volume van ijskoude 60% (m/v) sacharose in een conische buis 15 mL. Draai de buis bij 1.500 x g gedurende 15 s bij 4 ° C en verwijderen de drijvende wormen in een verse buis door ze te verplaatsen uit de wand van de buis met een pipet van Pasteur.
2. Wassen van de wormen 3 keer met S buffer door centrifugeren bij 1.500 x g gedurende 30 s bij 4 ° C. Check de natte hoeveelheid gewassen wormen na centrifugeren gebruik een 1.000 µL micropipet tip (figuur 1B).
3. Voeg de gewassen wormen op een gelijk volume van ijskoude 10% (m/v)-Trichloorazijnzuur (TCA; eindconcentratie van 5%) voor eiwit neerslag (Figuur 1 c). In plaats van TCA, kan perchloorzuur (PCA) of metaphosphoric-zuur worden gebruikt.
4. Meng de wormen met de neerslaande 40 slagen van een stamper met een Teflon homogenizer (Potter-Elvehjem weefsel grinder) met rotatie van maximaal 1300 toeren per minuut op ijs.
5. Het homogenaat overboeken naar een verse 1.5-mL microtube met een pipet van Pasteur, en bewerk ultrasone trillingen ten met behulp van een ultrasoon homogenizer gedurende 3 minuten (3 keer voor 1 min) met een taakcyclus van 20% op ijs.
6. Verduidelijking van het homogenaat door centrifugeren bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Neutraliseren het supernatant met 4 M KOH (0,25 volume 10% TCA) voor 20 min op ijs en centrifuge op 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Het supernatant (als een test sample) kan worden achtergelaten bij-80 ° C tot en met de volgende tests.

3. lactaat Assay met behulp van een colorimetrische Assay Kit

1. Het meten van de concentratie van lactaat in de monsters met behulp van een colorimetrische assay kit (Tabel van materialen). Duplex onderzoek voor de analysemonsters te verrichten. 5 of 10 µL van de proefstukken benadert toevoegen aan een 96-wells-plaat en het volume naar 50 µL per putje met de lactaat Assay Buffer die bij de kit geleverd.
2. Voor de standaard curve van lactaat, Verdun 100 mM L (+)-lactaat standaard tot 1 mM met lactaat Assay Buffer. Toevoegen van 0, 2, 4, 6, 8 en 10 µL van de 1 mM L (+)-lactaat standaard, die bij de kit wordt geleverd in een reeks van putten.
3. Voeg 50 µL van reactie Mix (met 46:2:2 van lactaat Assay Buffer, lactaat enzym Mix en lactaat Probe in DMSO, watervrij; alle gebruikte reagentia zijn voorzien van de kit) of de achtergrond controle Mix (met 48:2 van lactaat Assay Buffer en lactaat Probe) in elk putje en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-60 minuten, terwijl de monsters worden beschermd tegen licht.
4. Meet de extinctie van elk putje bij 570 nm met behulp van een microplate-lezer en aftrekken van de extinctie van de achtergrond controle Mix van de extinctie van de Mix.
5. De lactaat standaard curve uitzetten. Bereken de lactaat concentratie van de analysemonsters uit de lactaat standaard curve.

4. pyruvaat Assay met behulp van een colorimetrische Assay Kit

1. Het meten van de concentratie van pyruvaat in het supernatant (proefmonsters) met behulp van een colorimetrische assay kit (Tabel van materialen). Duplex onderzoek voor de analysemonsters te verrichten. Voeg 10 µL van de proefstukken benadert en 90 µL van werken reagens (met 94:1 van enzym Mix en kleurstof reagens, die zijn voorzien van de kit) in een 96-wells-plaat en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten terwijl de monsters worden beschermd tegen licht.
2. Meet de extinctie van elk putje bij 570 nm microplate lezer gebruikt.
3. De standaard curve van pyruvaat uitzetten. Bereken de pyruvaat concentraties van de analysemonsters uit de standaard curve van pyruvaat.

5. eiwitten Assay voor normalisatie met eiwitgehalte

1. Het meten van de eiwitconcentratie in het supernatant (proefmonsters) met behulp van een colorimetrische assay kit (Tabel van materialen). Echter, deze stap is niet beperkt tot een assay kit, en andere benaderingen kunnen worden gebruikt voor het meten van de eiwitconcentratie.
2. Normaliseren van de waarden van lactaat en pyruvaat concentraties tussen de proefstukken benadert met behulp van elke eiwitconcentratie totaal.
   Opmerking: Eiwitconcentratie van de analysemonsters voldoende zelfs na eiwit neerslag wordt gedetecteerd en wordt gebruikt voor de normalisatie stap onder monsters.

Resultaten

Met behulp van de colorimetrische testen voor de kwantitatieve bepaling van de concentraties lactaat en pyruvaat, toonden we de juistheid van deze tests vergeleken met vorige verslagen in C. elegans^7,8. Hier, was het proces van eiwit neerslag tijdens de extractie van het monster de meest cruciale stap voor het genereren van nauwkeurige waarden. Bij eiwit precipitatie, gemeenschappelijke neerslagmiddelen (bv., TCA...

Discussie

Bij gebruik van deze colorimetrische bepaling kits, is de meest kritische stap in monster extractie te detecteren van cellulaire lactaat en pyruvaat nauwkeurig in C. elegans het proces van eiwit neerslag tijdens homogenisering (Figuur 1). Het is niet strikt noodzakelijk is om het gebruik van een Teflon-homogenizer, als andere homogeniseerders (bijv., Dounce en tapered weefsel slijpmachines, of kraal molens) zijn ook geschikt voor de kleinschalige winning van wormen. We did ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit	BioVision	#K607-100	colorimetrisch/fluorometrisch 100 assays; Bewaren bij -20oC
EnzyChrom Pyruvaat Assay Kit	BioAssay Systems	#EPYR-100	colorimetrisch/ fluorometrisch 100 assays; Bewaren bij -20oC
BCA Eiwit Assay Kit	Thermo Scientific	#23225	colorimetrische test; bewaar bij  kamertemperatuur
Trichloroazijnzuur	Wako Pure Chemical	#207-04955	bewaren bij kamertemperatuur
Teflon homogenisator	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	In plaats van Iwaki/Pyrex, verkrijgbaar bij Wheaton