Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hoge resolutie vergelijking van bacteriële vervoeging frequenties

10.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57812

⸱

10 januari 2019

 ,  , 
1Applied Chemistry and Biochemical Engineering Course, Department of Engineering, Graduate School of Integrated Science and Technology, Shizuoka University, 2Department of Bioscience, Graduated School of Science and Technology, Shizuoka University, 3Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Research Center

In dit artikel

Samenvatting

Met een doel te begrijpen van het gedrag van verschillende bacteriële conjugative DNA elementen onder verschillende omstandigheden, beschrijven we een protocol voor de detectie van verschillen in de frequentie van de conjugatie, met een hoge resolutie te schatten hoe efficiënt de donor-bacterie met deze opdracht start Woordherkomst en-opbouw.

Samenvatting

Bacteriële conjugatie is een belangrijke stap in de horizontale overdracht van antibiotica-resistentiegenen via een conjugative DNA-element. Diepgaande vergelijkingen van geconjugeerde frequentie onder verschillende omstandigheden moeten begrijpen hoe verspreidt het conjugative element in de natuur. Conventionele methodes voor het vergelijken van geconjugeerde frequentie zijn echter niet geschikt voor diepgaande vergelijkingen vanwege de hoge achtergrond veroorzaakt door extra vervoeging gebeurtenissen op de selectieve plaat. We verlaagd met succes de achtergrond door de invoering van een meest waarschijnlijke aantal (MPN) methode en een hogere concentratie van antibiotica ter voorkoming van verdere vervoeging in selectieve vloeistof. Daarnaast ontwikkelden we een protocol voor het inschatten van de kans op hoe vaak donor cellen starten vervoeging gesorteerd enkele donor cellen in ontvangende zwembaden door fluorescentie-activated cell sorting (FACS). Met behulp van twee plasmiden, kon pBP136 en pCAR1, de verschillen in de frequentie van de vervoeging in Pseudomonas putida cellen worden opgespoord in vloeistof tegen verschillende opzwepende tarieven. De frequenties van geconjugeerde Inleiding waren hoger voor pBP136 dan voor pCAR1. Met deze resultaten, kunnen we beter de functies van de vervoeging in deze twee plasmiden begrijpen.

Inleiding

Bacteriële vervoeging van mobiele genetische elementen, conjugative plasmiden en integratieve en conjugative elementen (ICEs) is belangrijk voor de horizontale verspreiding van genetische informatie. Het kan bevorderen snelle bacteriële evolutie en aanpassing en overbrengen van multidrug resistentie genen1,2. De vervoeging frequentie kan worden beïnvloed door eiwitten gecodeerd op de conjugative elementen voor mobilisatie van DNA (MOB) en de paring paar vorming (MPF), met inbegrip van geslacht pili, die zijn ingedeeld volgens MOB en MPF type3,,4, 5. Het kan ook worden beïnvloed door de donor en ontvanger paar6 en de voorwaarden van de groei van de cellen7,8,9,10,11,12 ( groeitempo op jaarbasis, celdichtheid, stevige ondergrond of opgietvloeistof, temperatuur, beschikbaarheid van nutriënten en de aanwezigheid van kationen). Om te begrijpen hoe de conjugative elementen verspreid onder bacteriën, is het noodzakelijk om te vergelijken vervoeging frequentie in detail.

De vervoeging frequentie tussen donor en ontvanger paren na de paring worden meestal als volgt geschat door conventionele methoden. (i) ten eerste, het aantal kolonies van donor en ontvanger worden geteld; (ii) dan worden de ontvangende kolonies, waaraan de conjugative elementen (= transconjugants) geteld; (iii) en ten slotte de vervoeging frequentie wordt berekend door de kolonievormende eenheden (kve) van de transconjugants door die van de donor en/of ontvanger13. Wanneer u deze methode gebruikt, is de achtergrond echter hoog als gevolg van extra vervoeging gebeurtenissen die ook op de selectieve platen gebruikt plaatsvinden kunnen voor het verkrijgen van transconjugants wanneer de celdichtheid hoge10is. Het is daarom moeilijk te detecteren van kleine verschillen in frequentie (onder een 10-fold verschil). We introduceerde onlangs een meest waarschijnlijke aantal (MPN) methode met behulp van vloeibaar medium met een hogere concentratie van antibiotica. Hierdoor verminderd de achtergrond door remming van verdere vervoeging in het selectieve medium; Dus, de vervoeging frequentie kan worden geraamd met een hogere resolutie.

Vervoeging kan worden onderverdeeld in drie stappen: (1) bevestiging van de donor-ontvanger paar (2) opening van conjugative overdracht, en (3) dissociatie van het paar14. Tijdens stap (1) en (3) is er fysieke interactie tussen de donor en de ontvanger cellen; Dus, celdichtheid en de milieuomstandigheden kunnen invloed op deze stappen, hoewel de kenmerken van het geslacht pili ook belangrijk zijn. Stap (2) is waarschijnlijk geregeld door de expressie van verschillende genen die betrokken zijn bij de vervoeging in reactie op externe veranderingen, die kunnen worden beïnvloed door verschillende functies van de plasmide, donor en ontvanger. Hoewel de fysieke bijlage of detachement van donor en ontvanger paren kan worden wiskundig gesimuleerd met behulp van een schatting van cellen als deeltjes, worden de frequentie van de stap (2) experimenteel gemeten. Er zijn een paar verslagen over directe waarnemingen van hoe vaak donoren kunnen dit leiden tot vervoeging [stap (2)] met behulp van fluorescentie microscopie15,16; deze methoden zijn echter niet high-throughput omdat een groot aantal cellen moet worden gecontroleerd. Dus, wij een nieuwe methode ontwikkeld om schatting van de waarschijnlijkheid van het optreden van de stap (2) met behulp van fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS). Onze methode kan worden toegepast op elke plasmide, zonder identificatie van de essentiële genen voor Woordherkomst en-opbouw.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. bereiding van een Donor met groen fluorescente proteïne (GFP)- en kanamycine resistentie gen-gelabeld plasmiden

  1. Binnenbrengen van de pBP136 van de plasmide doel van markers
    Opmerking: Het doel van dit protocol is het genereren van pBP136::gfp. De bacteriestammen en plasmiden gebruikt in dit onderzoek zijn vermeld in tabel 1.
    1. Culturen van Escherichia coli DH10B pBP13617 in 5 mL steriele Luria Bouillon (LB) en E. coli S17-1λpir18 herbergen pJBA2819 herbergen groeien [met een kanamycine (Km)-resistentie gen en gfp mut3 * gen met haar promotor en terminator in een mini-Tn5] in 5 mL steriele LB met 50 μg/mL Km bij 37 ° C's nachts (O/N, 16-24 h) met schudden 200 omwentelingen per minuut (rpm).
    2. Oogsten en wassen
      1. Oogst 1 mL van elke cultuur, plaats deze in een 2 mL microtube en centrifuge (10.000 × g, kamertemperatuur, 2 min). Vervolgens Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 2 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
      2. Centrifuge opnieuw (10.000 × g, kamertemperatuur, 2 min) en resuspendeer in 500 μL van steriele PBS.
    3. Filteren paring
      1. Steriele LB platen (met 1,6% agar) voor te bereiden, en plaats een steriele 0,22 μm porie grootte membraanfilter op het. Mix 500 μL van E. coli S17-1λpir herbergen pJBA28 met E. coli DH10B pBP136 en spot het mengsel op het filter op de plaat LB herbergen. Incubeer de plaat O/N bij 30 ° C. Verwijder het filter uit de LB-plaat, plaats deze in een plastic buis van steriele 50 mL en voeg 1 mL steriele PBS.
        Opmerking: pJBA28 kan repliceren in aanwezigheid van Π eiwit, gecodeerd door de pir gene18, en kan worden overgedragen van S17-1λpir aan DH10B. pBP136 draagt geen marker gene17 en van DH10B kan worden overgedragen aan S17-1λpir. Daarom kunnen wij geen onderscheid S17-1λpir herbergen van pBP136 en pJBA28 van de DH10B herbergen pBP136 en de mini-Tn5 (omgezet in het chromosoom of pBP136) in dit stadium. We gebruikten dan mengsels van hen als donoren in opeenvolgende stappen (1.1.4.–1.1.5.).
    4. Een O/N cultuur van het bovenstaande paring mengsel in steriele LB met 50 μg/mL Km bij 37 ° C met schudden bij 200 rpm en een cultuur van Pseudomonas putida KT2440 groeien [Km-gevoelige (Kms), rifampicine-gevoelige (Rifs), Gentamicine-gevoelige (Gm-s), en tetracycline resistente (Tcr)] in medium met 12,5 μg/mL Tc bij 30 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
    5. Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze (de paring mengsel en KT2440) te gebruiken voor filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.
    6. Bereiden van steriele LB platen met 50 μg/mL Km en 12,5 μg/mL Tc (LB Km + Tc platen).
    7. Verdun de geresuspendeerde mengsel op het membraanfilter met steriel PBS (101–105-vouwen), en vervolgens verspreiding elke verdunning op LB Km + Tc platen en Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2-3-d.
    8. Kies kolonies van de platen, groeien een O/N cultuur in steriele LB met Km, evenals Tc en P. resinovorans CA10dm4RG (Rifr en Gmr)6 in steriele LB met Rif (25 μg/mL) en Gm (30 μg/mL) bij 30 ° C en 200 rpm.
      Opmerking: Zoals beschreven in de vorige opmerking, de kolonies op de LB + Km + Tc platen (van 1.1.7.) kan worden KT2440 herbergen pBP136 die een mini-Tn5 en KT2440 met een mini-Tn5, omdat pJBA28 kunnen direct worden overgebracht van S17-1λpir pBP136 en pJBA28 om KT2440 te herbergen. Dit is de reden waarom een andere paring met P. resinovorans CA10RG is vereist voor het verkrijgen van de target pBP136 met een mini-Tn-5 in de volgende stappen.
    9. Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze gebruiken voor filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.
    10. Bereiden van steriele LB platen met Rif, Gm en Km (LB Rif + Km + Gm platen).
    11. Resuspendeer het mengsel op het filter en vervolgens verdund het 101–105-vouw, verspreid het naar LB Rif + Km + Gm platen en Incubeer de platen voor 2 – 3 d bij 30 ° C.
    12. Kies de kolonies en controleren als zij pBP136 door PCR met behulp van specifieke primers voor het plasmide haven.
  2. Invoering van een selectieve marker-gen in de target plasmide pCAR1
    Opmerking: Het doel van dit protocol is het genereren van pCAR1::gfp
    1. Groeien van een cultuur van de O/N van P. putida KT2440 pCAR1 herbergen (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 200 rpm en 30 ° C en E. coli S17-1λpir18 herbergen pJBA28 in 5 mL steriele LB bevattende 50 μg/mL Km op 200 rpm en 37 ° C.
    2. Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze gebruiken voor filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.
    3. Verwijder het filter uit de LB-plaat, plaats deze in een plastic buis van steriele 50 mL en voeg 1 mL steriele PBS.
    4. Verdun de geresuspendeerde mengsel met steriel PBS (101–105-vouwen), en verspreid het verdunde mengsel op steriele selectieve LB + Tc + Km platen.
      Opmerking: pCAR1 niet gerepliceerd in E. coli; Dus, P. putida KT2440 herbergen pCAR1 met een mini-Tn5 kunnen worden geselecteerd op LB + Tc + Km platen.
    5. Kies een kolonie van de plaat, en groeien van een cultuur van de O/N in steriele LB met Km en Tc en een cultuur van P. resinovorans CA10dm4RG in steriele LB met Rif en Gm (200 rpm, 30 ° C).
    6. Na het oogsten en wassen zoals in stap 1.1.2, de cellen gebruiken voor de filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.
    7. Resuspendeer het mengsel op het filter en vervolgens verdund het, verspreid op LB Rif + Km + Gm platen en Incubeer de platen voor 2 – 3 d bij 30 ° C.
    8. Kies de kolonies en controleren als zij pCAR1 door PCR met specifieke primers voor het plasmide haven.
  3. Bevestigen van de overdraagbaarheid van de tagged-plasmiden en de donoren voor te bereiden voor de volgende stappen
    Opmerking: Het doel van dit protocol is te bevestigen de overdraagbaarheid van de bovenstaande gebouwd plasmiden en de donoren voor te bereiden voor de volgende stappen.
    1. Groeien van een cultuur van de O/N van P. resinovorans CA10dm4RG herbergen pBP136::gfp of pCAR1::gfp in steriele LB met Km en een cultuur van P. putida SMDBS [KmsGms, Rifr, Tcr, lacI q, in welk PA1/O4/O3-gfpmut3* niet vanwege haar chromosomale lacIq gen wordt uitgedrukt]21 in 3 mL LB met Tc (200 rpm, 30 ° C).
    2. Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze gebruiken voor filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.
    3. Plaats de filter in een steriele 50 mL kunststof buis en resuspendeer met 1 mL steriele PBS. Verdun de geresuspendeerde mengsel met steriel PBS (101–105-vouw), verspreid het verdunde mengsel op steriele selectieve LB + Tc + Km platen.
    4. Kies de kolonies en controleren als zij elk van de plasmiden door PCR met specifieke primers haven.
      Opmerking: Bevestiging van het standpunt van de invoeging van de mini-Tn5 door directe het rangschikken na extractie van het plasmide is optioneel, om te bevestigen dat de invoegpositie niet aan de overdrachtsfunctie van de plasmiden afdoet.

2. berekening van de vervoeging frequentie door de MPN-methode

  1. Bereiden van steriele LB Km en LB + Gm platen.
  2. Een O/N cultuur van P. putida SMDBS herbergen pBP136 groeien::gfp of pCAR1::gfp in 3 mL steriele LB met Km en een cultuur van P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) in 3 mL LB met Gm (140 rpm, 30 ° C).
  3. Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze te gebruiken voor filter paring bij 30 ° C gedurende 45 minuten zoals in stap 1.1.3.
  4. Serieel verdunde de bovenstaande donor en ontvanger cultuur (101 –107) en verspreid het op LB + Km (donor) of LB + Gm (ontvanger) platen (alle in drievoud) om te tellen de kolonievormende eenheden (kve). Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2 d.
  5. Resuspendeer het mengsel op het filter in steriele LB met Km en Gm, en serieel Verdun (van 21 224–107.2) met behulp van een 96-Wells cel cultuur plaat (in viervoud).
  6. Incubeer de 96-wells-plaat voor het juiste moment (2 d bij 30 ° C).
  7. De CFU van de donor en de ontvanger op de platen (stap 2.4.) tellen en tellen van het aantal putten waarin de transconjugants groeien.
  8. Bereken de MPN en haar afwijking met behulp van het MPN berekeningsprogramma ontwikkeld door Jarvis et al. 22, die beschikbaar op http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls is.
    1. Voer de naam van het experiment (ex., 'testen'), de datum van het experiment (ex., 2018/4/9), het aantal testreeks en de max. Nee. verdunningen (Voer '24') in rij #7 van het 'programma' blad van het Excel-bestand ('MPN_ver5.xls').
    2. ' 2-1 (= 0,5) naar 2-24 (= 5.96 × 10-8)' in de kolom 'verdunning factor d'invoeren '0,01' in de kolom 'volume in ml of g w'en ' 4' in ' nr. van buizen n' in het automatisch geproduceerde gegevenstabellen ' invoer '.
    3. Voer het aantal putten waarin de transconjugants op elke monsterverdunning (0-4 groeien).
    4. Druk op de bovenste rechts 'Resultaten berekenen' knop, en vervolgens de resultaten (in MPN/μl) en hun 95%-betrouwbaarheidsgrenzen (boven- en ondergrenzen) krijgen.
  9. Bereken de frequentie van de vervoeging van de plasmiden, door het aantal transconjugants (MPN/mL) te delen door de nummers van donor en ontvanger cellen (CFU/mL).

3. voorbereiding van de schatting van de waarschijnlijkheid van Donor aangestuurde Woordherkomst en-opbouw

  1. Een O/N cultuur van P. putida SMDBS herbergen pBP136 groeien::gfp of pCAR1::gfp in 3 mL steriele LB met Km en een cultuur van P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) in 3 mL steriele LB met Gm met behulp van 300 mL kolven (140 rpm, 30 ° C) als precultures.
  2. Breng 200 μL van de preculture in 200 mL verse steriele LB bevattende Km of Gm maatkolven van 500 mL en Incubeer bij 30 ° C met schudden bij 140 omwentelingen per minuut.
  3. Meten van de troebelheid op 600 nm (OD600) van de cultuur met behulp van een UV-VIS spectrofotometer en spot de cultuur, verdund in LB (101–108-vouwen verdunningen), op een LB-plaat met Km of Gm. Incubate deze LB platen bij 30 ° C gedurende 1-2 d , en het bepalen van de CFU.
  4. Plot de600 OD-waarden en de CFU met groei tijd voor het genereren van de groeicurven van de donor en de ontvanger.
  5. Culturen van de donor en ontvanger stam groeien tot halverwege log fase, op basis van de groeicurve.
  6. Na het oogsten en wassen van de cellen, 101–103 CFU van de donor in 10 μL van LB en 105–107 CFU van de ontvanger in 100 μl van LB te bereiden.
  7. Mix 10 μL van de donor en 100 μl van de ontvangende culturen op verschillende dichtheden in 96-wells-platen (in drievoud). Bijvoorbeeld, meng 101 CFU van de donor en 105 CFU van de ontvanger en toevoegen aan elk van de 96-wells, en meng 101 CFU van de donor en 106 CFU van de ontvanger in een andere 96-wells-plaat, en zo verder.
  8. Incubeer het mengsel bij 30 ° C voor 45 min, en voegt u hoge concentraties van antibiotica (100 μg/mL Km en 60 μg/mL Gm) aan elk putje te remmen verder Woordherkomst en-opbouw.
  9. Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 2 d.
  10. Het aantal putten waarin de transconjugants groeien.
  11. Kies de ontvangende dichtheid die geschikt is voor de schatting van de waarschijnlijkheid van donor aangestuurde geconjugeerde op basis van de bovenstaande gegevens (transconjugants moet worden gevonden in ten minste 1 goed van een 96-wells-plaat).
    Opmerking: Transconjugants zal groeien in alle putjes als de dichtheid van de cellen van donor en ontvanger hoog zijn en meer dan één vervoeging treedt op in een put. Daarentegen zal geen transconjugants worden gevonden in elke putten wanneer de celdichtheid te laag is. In de volgende sectie, wordt de cel van een enkele donor gesorteerd in een put. Daarom moet de ontvangende dichtheid op maximum.

4. de schatting van de waarschijnlijkheid van Donor aangestuurde Woordherkomst en-opbouw

  1. Bereiden van 200 mL van de cultuur van een mid log fase van donor P. putida SMDBS herbergen pBP136::gfp of pCAR1::gfp en die van de ontvanger P. putida KT2440RGD, zoals beschreven in 3.6 – 3.7.
  2. Plaats 106 CFU van de ontvanger in 100 μl van LB in ieder putje van een 96-wells-plaat.
  3. Opzetten van het systeem van FACS (stroom cytometry en cel sorter met een robotachtig wapen, een 488 nm argon laser en een opening van de sproeier 70 μm). Ingesteld op vooruit (FSC), spreidingsdiagrammen met gegevenspunten verbonden een drempel van 1% als de trigger van de overname. Afstemmen van de H-winst en een winst van de FSC en kant scatter (SSC) op maximale gevoeligheid, die valse positieve signalen, met behulp van PBS als een negatieve controle kunt uitsluiten. Stel de poort van de sorteren op basis van FSC en WS en 0.5 drop sorteren modus voor maximale sorteren zuiverheid.
  4. Sorteren van een enkele donor-cel met de FACS op een LB-plaat (384 verschillende plekken), Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 2 d en dan tellen hoeveel kolonies op de plaat uit de gesorteerde cellen verschijnen.
    Opmerking: Deze procedure is voor de validatie van de ingestelde poort. Als er 384 kolonies op de plaat zijn, betekent dit dat 100% van de gesorteerde cellen kolonies kunnen vormen. De gemiddelde geldigheidsduur van het sorteren is altijd 90-95%.
  5. Sorteren van een enkele donor-cel met de FACS in ieder putje van een 96-wells-plaat met de ontvanger (4.2).
  6. Incubeer de plaat gedurende 45 minuten bij 30 ° C, en voegt u hoge concentraties van antibiotica (100 μg/mL Km en 60 μg/mL Gm) aan elk putje om te voorkomen dat verdere Woordherkomst en-opbouw.
  7. Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 2 d.
  8. Tel het aantal putten in die transconjugants als groeide bepaald door visueel onderzoek met het blote oog.
  9. De waarschijnlijkheid van donor aangestuurde geconjugeerde berekenen door het aantal putten met transconjugants door het totale aantal putten waarin de donor was gesorteerd te delen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vergelijking van geconjugeerde frequentie door de MPN-methode

In ons vorige verslag, vergeleken we de frequenties van de vervoeging van pBP136::gfp en pCAR1::gfp in drievoudige verdunde LB (1/3 LB) vloeistof met verschillende opzwepende tarieven na een 45 min paring met 125 mL spinner kolven10. We vergeleken de frequenties van de vervoeging van pBP136::gfp en pCAR1::gfp me...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier presenteren we een high-resolution protocol voor de detectie van verschillen in vervoeging frequentie onder verschillende omstandigheden, gebruik een MPN-methode voor de raming van het aantal transconjugants. Een belangrijke stap in het protocol is het verdunnen van het mengsel van donor en ontvanger na de paring tot geen transconjugants groeien. Een andere stap is het toevoegen van hoge concentraties van antibiotica aan de selectieve vloeistof om te voorkomen dat verdere Woordherkomst en-opbouw. Deze procedures kun...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. K. Kamachi van het National Institute of Infectious Diseases (Japan) voor het verstrekken van pBP136 en Prof. Dr. H. Nojiri van de Universiteit van Tokio (Japan) voor het verstrekken van pCAR1. Wij zijn ook dankbaar Professor Dr. Molin Sølen van de Technische Universiteit van Denemarken voor het verstrekken van pJBA28. Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI (Grant nummers 15H 05618 en 15KK0278) aan MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MoFlo XDPBeckman-CoulterML99030FACS
IsoFlowBeckman-Coulter8599600Sheath solution
Fluorospheres (10 μm)Beckman-Coulter6605359beads to set up the FACS
IncubatorYamato Scientific Co. Ltd211197-IC802
UV-VIS Spectrophotometer UV-1800SIMADZU CorporationUV-1800
96-well platesNIPPON Genetics Co, LtdTR5003
microplate type Petri dishAXEL1-9668-01for validation of sorting
membrane filterADVANTECC045A025Afor filter mating
pippettesNichiryo CO. Ltd00-NPX2-20,
00-NPX2-200,
00-NPX2-1000		0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL
multi-channel pippetesNichiryo CO. Ltd00-NPM-8VP,
00-NPM-8LP		0.5-10 μL, 20-200 μL
TryptoneBD Difco211705
Yeast extractBD Difco212750
NaClSigmaS-5886
AgarNakarai tesque01162-15
rifampicinWako185-01003
gentamicinWako077-02974
kanamycinWako115-00342
Petri dishAXEL3-1491-51JPND90-15
microtubesFukaekasei131-815C
500 mL disposable spinner flaskCorningCLS3578

Referenties

  1. Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
  2. Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
  3. Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
  4. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
  5. Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
  6. Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
  7. Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
  8. Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
  9. Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
  10. Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248(2017).
  11. Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
  12. Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
  13. Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
  14. Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
  15. Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. The cytology of bacterial conjugation. EcoSal Plus. 2004, (2004).
  16. Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
  17. Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
  18. Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
  19. Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
  20. Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
  21. Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
  22. Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
  23. Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
  24. Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
  25. Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
  26. Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
  27. Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Conjugatiefrequentiemeest waarschijnlijke aantalfluorescentie-geactiveerde cel sorteringplasmide-DNA-overdrachtPseudomonas putidaantibioticaresistentiegenenhorizontale genoverdrachtseriële verdunningkolonievormende eenheden
Hoge resolutie vergelijking van bacteriële vervoeging frequenties
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.