Een roman verzadiging mutagenese aanpak: Macrostap karakterisering van regelgevende proteïne bindend Sites in RNA met behulp van fosforthioaten

Samenvatting

Eiwitten die specifieke RNA opeenvolgingen binden spelen een kritieke rol in genexpressie. Gedetailleerde karakterisering van deze bandplaatsen is van cruciaal belang voor ons begrip van de genexpressie. Hier, wordt een-voor-stapmodus aanpak voor verzadiging mutagenese van eiwit-bandplaatsen in RNA beschreven. Deze aanpak geldt voor alle websites van de binding aan eiwitten in RNA.

Samenvatting

Genregulatie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling. Talrijke DNA - en RNA-bindende proteïnen binden hun doel sequenties met hoge specificiteit te controleren van de genexpressie. Deze regelgevende eiwitten bepalen de expressie van genen op het niveau van DNA (transcriptie) of op het niveau van RNA (pre-mRNA-splicing, polyadenylatie, mRNA vervoer, verval en vertaling). Identificatie van regulerende sequenties helpt te begrijpen niet alleen hoe een gen is overgeschakeld in- of uitschakelen, maar ook welke downstream genen worden gereguleerd door een bepaalde regelgevende proteïne. Hier beschrijven we een one-step-aanpak waarmee de verzadiging mutagenese van een bindende eiwit in RNA. Het gaat om doping DNA sjabloon met niet-wild-type nucleotiden binnen de bindende site, synthese van afzonderlijke RNAs met elk nucleotide phosphorothioate en isolatie van de afhankelijke breuk na incubatie met eiwit. Interferentie van niet-wild-type nucleotiden leidt tot hun preferentiële uitsluiting uit de eiwit-gebonden. Dit wordt gecontroleerd door de Elektroforese van het gel na selectieve chemische decolleté met jodium van phosphodiester obligaties met fosforthioaten (phosphorothioate mutagenese of PTM). Deze-voor-stapmodus verzadiging mutagenese aanpak geldt voor de karakterisering van elke site bindende eiwit in RNA.

Inleiding

Genregulatie speelt een belangrijke rol in de biologie. Genen kunnen worden geregeld op het niveau van de transcriptie, pre-mRNA-splicing, 3' eind vorming, RNA export, vertaling, lokalisatie van mRNA, verval, posttranslationele wijziging/stabiliteit, etc. die beide DNA - en RNA-bindende proteïnen spelen een sleutelrol in gen verordening. Terwijl moleculair genetische analyses hebben talrijke regelgevende proteïnen geïdentificeerd, hebben slechts een klein gedeelte van hen volledig was gekenmerkt voor hun cellulaire functies of bindende sites in vivo. Fylogenetische sequentieanalyse en mutagenese bieden complementaire benaderingen karakteriseren van DNA - of RNA-eiwit interacties.

RNA-bindende proteïnen zijn belangrijk in ontwikkelings processen, met inbegrip van seksuele differentiatie. De Drosophila eiwit Sex-dodelijke (SXL) of het geslacht-hoofdschakelaar eiwit ontbreekt in de mannetjes, maar heden bij vrouwtjes. Het herkent uridine-rijke sequenties of pyrimidine-traktaten grenzend aan specifieke splice sites in downstream pre-mRNA doelen (transformator, Sex-dodelijkeen man-specifieke lethal2) in somatische cellen^{1,2 ,3,4}. Daarnaast reguleert het polyadenylatie site overschakelen door binding aan uridine-rijke polyadenylatie versterker sequenties in de versterker van rudimentaire (e(r)) transcript^5,6. SXL waarschijnlijk regelt extra doelen in de vrouwelijke germline dat nog moet worden vastgesteld van^{1,7,8,9,10,11, 12 , 13}.

Karakterisering van een bindende site impliceert typisch, mutagenese, bijvoorbeeld door schrapping of vervanging van één of meerdere nucleotiden. Elke mutant bindende site, ten opzichte van de wild-typen RNA volgorde, is vervolgens geanalyseerd met behulp van een reeks eiwitten concentraties te bepalen zijn bindende affiniteit (K_d of evenwicht dissociatie constant) voor de proteïne van belang; K_d is de eiwitconcentratie moet 50% RNA-bindende verkrijgen. Deze arbeidsintensieve proces van gedetailleerde mutagenese betreft generatie en analyse van talrijke mutanten — drie niet-wild type nucleotiden voor elke positie in de bindende site. Er is dus behoefte aan een alternatieve benadering voor snellere, eenvoudigere en goedkope verzadiging mutagenese van eiwit bandplaatsen in RNA.

Hier beschrijven we een one-step-aanpak waarmee de verzadiging mutagenese van een bindende eiwit in RNA. Het gaat om doping DNA sjabloon met niet-wild-type nucleotiden binnen de bindende site, synthese van afzonderlijke RNAs met elk nucleotide phosphorothioate en isolatie van de afhankelijke breuk na incubatie met eiwit. Interferentie van niet-wild-type nucleotiden leidt tot hun preferentiële uitsluiting uit de eiwit-gebonden. Dit wordt gecontroleerd door de Elektroforese van het gel na selectieve chemische decolleté met jodium van phosphodiester obligaties met fosforthioaten (phosphorothioate mutagenese of PTM). Deze-voor-stapmodus verzadiging mutagenese aanpak geldt voor de karakterisering van elke site bindende eiwit in RNA.

Protocol

Opmerking: Figuur 1 geeft een overzicht van phosphorothioate mutagenese en geeft een overzicht van belangrijke stappen in het proces.

1. generatie van een bibliotheek van mutanten — Doping DNA sjabloon met niet-wild Type nucleotiden

1. Synthetiseren T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') door chemische synthese op een DNA synthesizer.
2. Synthetiseren een gedoopt oligonucleotide (complementaire strand) door chemische synthese op een DNA-synthesizer die overeenkomt met de site van de bindende eiwit. Gebruik een passende mix van phosphoramidites tijdens de chemische synthese voor elke site van doping (X hieronder) met een ratio van 90% A als de wild-type nucleotide en 10% T als de niet-wild type nucleotide (Zie representatieve resultaten voor meer informatie over deze verhouding).
   Opmerking: Hier, de volgorde van de gedoopt oligonucleotide is 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. De onderstreepte volgorde is de omgekeerde aanvulling van SXL eiwit bindende site, plus extra nucleotiden buiten de bindende site waarmee nuttige besturingselementen waarin wordt bevestigd dat niet elke wijziging in het RNA beïnvloedt bindend, maar ook als laden besturingselementen voor vergelijking en normalisering van nucleotiden in de bindende site. De SXL-bindende site reeks UUUUUGUUGUUUUUUUU, die aanwezig is in de transformator pre-mRNA^14,15,16,17, werd gebruikt om de voorgestelde methodologie te ontwikkelen. De volgorde in cursief is een aanvulling op de volgorde van de primer T7 en de T7 promotor voor in vitro transcriptie.

2. synthese van RNA

1. RNA in een 20 µL transcriptie reactie, als eerder beschreven¹⁸synthetiseren.
   1. Mix-T7 transcriptie buffer en 1 µM T7 oligonucleotide, 1 µM doped oligonucleotide, 10 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM elke ATP, CTP, en UTP (calciumguanosine, adenosine, cytosinetrifosfaat en uridine trifosfaat) en 2 U/µL T7 RNA-polymerase.
   2. Toevoegen, in twee aparte microcentrifuge buizen, 0.167 mM α-thio ATP of 0.05 mM α-thio UTP fosforthioaten (zie schema in Figuur 2) geïntegreerd RNAs.
      Opmerking: Voor alternatieve protocollen, toevoegen 0.2 mM α-thio CTP of 0,2 mM α-thio GTP een passende transcriptie reageren met een gedoopt oligonucleotide om te testen van de twee resterende nucleotide vervangingen.
   3. Incubeer de RNA-synthese reactiemengsel gedurende 2 uur bij 37 ° C.
2. 2.5 µL hitte-labiele alkalisch fosfatase en 2.5 µL 10xphosphatase buffer toevoegen aan het RNA-monster. Deze 25 µL reactie gedurende 10-30 minuten bij 37 ° C te verwijderen 5' fosfaten uit te broeden.
3. Inactivering van de alkalische fosfatase-enzym door verwarming bij 80 ° C gedurende 2-5 min.
4. Radiolabel van het einde 5' van gedefosforyleerd RNA (5 pmole) met behulp van 1 µL T4 polynucleotide kinase en 1 µL γ -³²P ATP in een 10 µL reactie volume. Incubeer de reactie mix gedurende 30-60 minuten bij 37 ° C.
5. Inactivering van de T4 polynucleotide kinase enzym door verwarming bij 65 ° C gedurende 20-30 min.
6. Gel zuiveren het RNA door elektroforese in een 10% polyacrylamidegel denaturering. Zoek RNA op de gel met behulp van autoradiografie. Het segment van de gel met radiolabeled RNA accijnzen, verpletteren in een microcentrifuge-buis door te drukken tegen de muren met een pipet tip en geniet in proteïnase K (PK) buffer (100 mM Tris, pH 7.5, 12.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% natrium dodecyl sulfaat). Draai de buis bij kamertemperatuur van 2 h tot 's nachts.
7. Centrifugeer de gel drijfmest, negeren de gel en verzamelen van de bufferoplossing.
8. Pak de oplossing tweemaal met gelijk volume van fenol-chloroform en een keer met chloroform en verzamelen van de waterige fase.
9. Toevoegen aan het volume van de waterfase 0.1 van 3M Natriumacetaat, pH 5.2, vervoerder tRNA of glycogeen en 2.5 volume ethanol. Houd het monster bij-80 ° C gedurende 1 uur.
10. Het monster gedurende 5-10 min. in een hoge snelheid microcentrifuge 16,873 x gcentrifugeren. Verwijder zorgvuldig de buffer/ethanol oplossing zonder verstoring van de RNA-pellet.
11. Wassen van de pellet met 70% ethanol en Centrifugeer gedurende 2-5 min. verwijderen ethanol zorgvuldig. Droog de pellet in lucht.
12. Resuspendeer de pellet in 20 – 50 µL diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandeld water. Bewaren bij-20 ° C tot gebruik.
    Opmerking: Alle stappen met radiolabeled RNA met behulp van passende voorzorgsmaatregelen en over een plexiglas schild te beschermen tegen radioactiviteit. Op dit moment zijn draai kolommen veelgebruikte en handiger te verwijderen designated radioactiviteit, als alternatief voor de reiniging van het gel van RNA.

3. eiwit bindende reactie en scheiding van afhankelijke RNA

1. De recombinante eiwitten in Express en zuiveren van E. coli.
2. Recombinant eiwitconcentratie te schatten door spectrofotometrie of door onderscheid in een SDS-polyacrylamide-gel naast een bekende eiwit standaard, boviene serum albumine (BSA). Visualiseer de proteïne van belang en de BSA standaard door kleuring van de gel met Coomassie briljant blauw R-250. Kwantificeren van de proteïne in vergelijking met een bekende hoeveelheid BSA verdunningen op het zelfde gel.
   Opmerking: Bewaar recombinant eiwit bij - 80 ° C tot gebruik en verdund in 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic zuur (HEPES), pH 8,0, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0,2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), 0.05% NP-40, 20% glycerol. Gebruik van 0.5-1.0 mM protease inhibitor phenylmethane sulfonyl fluoride (PMSF) is optioneel.
3. Uitvoeren van RNA-bindende reactie (20-100 µL) van 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.5 eenheden/µL RNase remmer, 0.09 µg/µL geacetyleerd bovien serumalbumine, 1 mM EDTA, 0,15 µg/µL tRNA, 5'-eind radiolabeled RNA en 6 µL van (een geschikte concentratie concentratie waartegen ~ 50% van het RNA aan proteïne bindt) van het eiwit.
   Nota: Deze bindende buffer werkt voor drie RNA-bindende proteïnen (SXL, U2AF⁶⁵, en PTB), maar moet worden gestandaardiseerd voor een proteïne van belang. Eiwitconcentratie empirisch, schatten met behulp van verschillende verdunningen voor een bepaald eiwit-preparaat, die is vereist voor het verkrijgen van ongeveer 50% RNA-bindende. Deze voorwaarde of K_d vertegenwoordigt het meest gevoelige deel van de RNA-bindende-curve.
4. Incubeer de reactie van de bindende eiwit voor 20-30 min bij 25 ° C (of op ijs).
5. Scheiden de eiwit-afhankelijke RNA-Fractie van de niet-afhankelijke breuk met behulp van een van de twee benaderingen:
   1. Nitrocellulose filter bindende
      1. De bindende reactie (20-100 µL) toepassen op een nitrocellulose filter aangesloten op een vacuüm variëteit bij kamertemperatuur.
         Opmerking: Alleen de RNA-eiwit complex wordt bewaard op het filter en niet-afhankelijke RNA stromen door de filter. De aanpak van de bindende filter kunt hogere herstel van de afhankelijke RNA en is sneller en eenvoudiger, in vergelijking met de gel assay voor de verschuiving van de mobiliteit. Door het plaatsen van een membraan DEAE onder het nitrocellulose filter is het ook mogelijk om te verzamelen van de niet-afhankelijke RNA-fractie of gratis RNA voor vergelijking met de gebonden Fractie.
      2. Het gedeelte van het nitrocellulose filter met de ingehouden knippen radioactieve RNA in kleinere stukken te passen in een microcentrifuge buis, geniet in voldoende PK buffer (300 – 500 µL met 10-20 µg PK) om onder te dompelen de filter stukken en elueer RNA van het filter voor 2 tot 3 h of 's nachts.
      3. Pak met fenol-chloroform, chloroform, en verzamelen van de waterige fase. Natriumacetaat en ethanol toevoegen na incubatie in vriezer, centrifugeren, wassen, drogen en resuspendeer RNA in DEPC-behandeld water. Ga als volgt te werk zoals beschreven in stappen 2.10 tot en met 2.14 boven.
   2. Gel mobiliteit shift
      1. Bereiden en te polymeriseren een inheemse polyacrylamidegel van 5% (60:1 Acrylamide:bis-acrylamide) in 0,5 x TBE (standaard Tris-boraat-EDTA-buffer) voordat de bindende reactie, als alternatief voor de filter bindende methode.
      2. Stel vooraf de gel gedurende 15 minuten bij 250 V in een koude kamer (4 ° C).
      3. Laad elke bindende reactie (boven) in aparte putjes van de bovenstaande vooraf uitvoeren gel.
         Opmerking: De buffer van de opslag eiwit biedt voldoende glycerol hetvullenvan monster wells.
      4. Scheiden het RNA eiwitten gebonden door de Elektroforese van het gel in een koude kamer op 250 V gedurende 1 tot 2 uur, afhankelijk van de grootte van RNA en de specifieke proteïne.
      5. Zoek de positie van het RNA-eiwit complex aan de gel met behulp van autoradiografie. Accijnzen het gel-segment met de RNA-eiwit complex. Elueer RNA van het gel-segment door het verpletteren van het gel-segment en onderdompelen in de PK-buffer.
      6. Pak met fenol-chloroform, chloroform, en verzamelen van de waterige fase. Natriumacetaat en ethanol toevoegen na incubatie in vriezer, centrifugeren, wassen, lucht droog, en resuspendeer RNA in DEPC-behandeld water. Ga als volgt te werk zoals beschreven in stappen 2.10 tot en met 2.14 boven.

4. analyse van jodium-gekloofd Phosphorothioate producten voor detectie van Mutant Nucleotide posities

1. Toevoegen van 1 mM jodium in een 20 µL DEPC-behandeld water met maximaal 10 µg vervoerder tRNA te klieven RNAs (afhankelijke en totale RNAs) op de sites phosphorothioate statuten. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
   Opmerking: Meer informatie over jodium decolleté met iets andere voorwaarden — 7% (v/v) iodoethanol, Verwarming op 95 ° C gedurende 3 min — kan worden gevonden in Gish & Eckstein 1988¹⁹.
2. Neerslag gekloofd RNA door toevoeging van natrium acetaat/ethanol, zoals hierboven beschreven. Resuspendeer in een laden kleurstof voor denaturering gels. Verhit en laden van het monster te scheiden van de fragmenten van RNA door elektroforese in een denatureren polyacrylamidegel van 15-20%.
3. Bloot het polyacrylamidegel naar een X-ray film.
4. Detecteren bands in de gebonden fractie ten opzichte van de totale pool met behulp van autoradiografie.
   Opmerking: Voer alle stappen uit met jodium in de kap van een uitlaat. Voor RNA scheiding komt hier te staan, is een wig-vormige gel gebruikt, die wordt bereikt door een verdubbeling van de dikte van de beide afstandhouders aan de onderkant van de gel-platen door het invoegen van een extra duim lang spacer aan de onderkant van de gel. Deze shape kunt meer eenvormige of dichter afstand tussen kortere fragmenten van RNA. U kunt ook kan een phosphorimager worden gebruikt in plaats van X-ray films voor detectie en kwantificatie van radioactiviteit.

Resultaten

Beginsel van verzadiging mutagenese met behulp van doping:

Voor een passende molaire verhouding van wild-type en andere nucleotiden, door een gelijke mix van alle vier nucleotiden te gebruiken als slechts één positie is om te worden geanalyseerd. Echter als meerdere posities gelijktijdig worden geanalyseerd, moet de verhouding van niet-wild type te wild-type nucleotiden worden aangepast, dat wil zeggen, verminderd. Anders,...

Discussie

Mutagenese heeft lange tijd gebruikt om het eiwit bandplaatsen karakteriseren. Eerst kan een aantal mutanten worden gebouwd en individueel getest in de testen voor het analyseren van de gevolgen daarvan voor affiniteit bindend bindend. Hoewel een standaard mutagenese aanpak biedt een manier om te analyseren verschillende reeksen, meerdere stappen betrokken bij de standaardbenadering, zoals de bouw van mutanten en uitvoeren van een reeks van bindende reacties voor elke mutant, is moeizaam en tijdrovend en kan niet het toe...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Uridine 5’ a-thio trifosfaat	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-017
Adenosine 5’ a-thio trifosfaat	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-016
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
Dephosphorlyation Kit	NEB	M0508
T4 Polynucleotide Kinase	NEB	M0201S
Proteinase K	NEB	P8107S
T7 RNA polymerase	NEB	M0251S
RNasin	Promega		RNase inhibitor
Glazen platen	Standaard	Standaard
Gel elektroforeseapparatuur	Standaard	Standaard
X-ray films	Standaard	Standaard
Polyacrylamide gel oplossingen	Standaard	Standaard