Methodenartikel

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

DOI:

10.3791/57819

⸱

29 juni 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, 3Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de replicaset methode, een benadering tot kwantitatief maatregel C. elegans levensduur/overleving en de healthspan in een high-throughput en robuuste manier, waardoor screening van vele voorwaarden zonder in te boeten op kwaliteit van de gegevens. Dit protocol details van de strategie en biedt een software-instrument voor de analyse van gegevens van de replicaset.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De replicaset methode is een benadering van kwantitatief meten van levensduur of voortbestaan van Caenorhabditis elegans nematoden in een high-throughput manier, waardoor een enkele onderzoeker op het scherm meer behandelingen of voorwaarden over dezelfde hoeveelheid tijd zonder verlies van kwaliteit van de gegevens. De methode vereist gemeenschappelijke uitrusting gevonden in de meeste laboratoria die werken met C. elegans en is dus eenvoudig te nemen. De aanpak op de keuring van onafhankelijke monsters van een populatie op elk observatiepunt, in plaats van één sample na verloop van tijd als met traditionele longitudinale methoden gecentreerd. Scoren met zich meebrengt vloeistof toe te voegen aan de putjes van de plaat in een multi goed, die C. elegans om te bewegen stimuleert en vergemakkelijkt quantifying veranderingen in healthspan. Andere grote voordelen van de replicaset methode zijn verminderde blootstelling van agar oppervlakken lucht verontreinigingen (bijvoorbeeld schimmel of schimmel), minimale behandeling van dieren, en bestandheid tegen sporadische mis scoren (zoals het bellen van een dier als dood wanneer het is nog steeds levend). Om op de juiste manier analyseren en visualiseren van de gegevens van een replicaset stijl experiment, was een aangepaste softwaretool ook ontwikkeld. Huidige mogelijkheden van de software omvatten plotten van overleving curven voor zowel replicaset en traditionele (Kaplan-Meier) experimenten, evenals statistische analyse voor de replicaset. De hier bedoelde protocollen beschrijven de traditionele experimentele aanpak en de replicaset methode, evenals een overzicht van de overeenkomstige data-analyse.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de meest transformatieve technologische vooruitgang naar het begrip van de genetische basis van veroudering was de ontwikkeling van voeding gebaseerde RNAi in C. elegans1; voorafgaand aan het experimenteel gebruik van RNAi waren vele fenotypes van veroudering niet genetisch hanteerbare. Voeding gebaseerde RNAi wordt bereikt door de productie van dsRNA binnen E. coli die overeenkomt met een endogene C. elegans mRNA: IPTG induceert bidirectionele transcriptie via een tussenvoegsel van ofwel C. elegans cDNA of een gedeelte van een Open leesraam binnen een plasmide-2. Wanneer C. elegans feed op intact is E. coli, dsRNA geproduceerd door bacteriën vervoerd vanaf de lumen in cellen van de darm via de SID-2 transmembraan eiwit3, en vervolgens wordt gedistribueerd door de rest van het dier via SID-14. Binnen elke cel, exogene dsRNA wordt verwerkt door de complexe Dicer in siRNA, die interactie met een volwassen mRNA via complementaire base paren maken een nieuwe siRNA-mRNA duplex. Deze duplex is erkend door de RISC-complex en gekloofd, waardoor de endogene mRNA5vernederende. Dus, door slechts veranderen de plasmide invoegen, kan een inactivering van de functie van bijna elk gen in het genoom van C. elegans . Deze ontdekking leidde tot de oprichting van verschillende grote voederen gebaseerde RNAi bibliotheken-collecties van getransformeerd E. coli -bestanden die kunnen worden gecombineerd om dekking van ongeveer 86% van bekend C. elegans genen6, 7.

Sinds de vooruitgang van voeding gebaseerde RNAi, hebben uitgebreide schermen in C. elegans geleid tot de ontdekking van meer dan 900 genen die levensduur wanneer geïnactiveerd (zoals blijkt uit de verenigingen van de RNAi-fenotype curator in WormBase), die we verwijzen veranderen om als gerogenes. Een rol voor de meerderheid van gerogenes in levensduur besturingselement werd ontdekt door voeding gebaseerde RNAi in slechts een paar baanbrekende rapporten (Zie figuur 1A en aanvullende bestand 1 voor details). In sommige gevallen zijn deze gerogenes gebaseerd op de meting van de levensvatbaarheid op één of een paar punten van de tijd, die niet een kwantificeerbare maatregel van de verandering in levensduur voorzien van RNAi behandeling geïdentificeerd. In andere gevallen, zijn deze genen kwantitatief beoordeeld voor veranderingen in levensduur, evenals extra leeftijd-geassocieerde fenotypen. Bijvoorbeeld, we eerder aangeduid 159 genen die noodzakelijk zijn voor zowel de normale als de verhoogde levensduur van dieren met verminderde insuline/IGF-1 signalering waren, en gekwantificeerd veranderingen in healthspan. Van deze, 103 gen inactivations leiden tot een progeric fenotype, zoals nederlaag in een of meer tekenen van vroegtijdige veroudering8 resulteerde.

Terwijl sommige gerogenes zijn geassocieerd met 100 of meer studies (bijvoorbeeld daf-16, daf-2, sir-2.1), hebben meer dan 400 gerogenes 10 of minder citaten (figuur 1Ben aanvullende bestand 2). Dus, terwijl uitgebreide voeding gebaseerde RNAi schermen hebben ontdekt en vluchtig gekenmerkt honderden vermeende gerogenes, hoe deze functie van genen in de controle van de levensduur en de genetische relaties tussen deze genproducten blijven slecht studeerde. Volledige longitudinale analyse voor leeftijd-geassocieerde fenotypen is een voorwaarde voor het identificeren van genetische interacties tussen gerogenes (b.v. epistatic interacties, asynthetic interacties, enz.). Verkrijgen van dieper inzicht in de genetische relaties tussen gerogenes vereist een kwantitatieve methode van hoge-doorvoer, die borduurt ook voort op de voordelen van voeding gebaseerde RNAi.

De meest voorkomende surrogaat maatstaf voor veroudering is levensduur. De traditionele aanpak voor het meten van C. elegans sterfte houdt de dood van individuele dieren na verloop van tijd in een steekproef van een kleine populatie. Een relatief klein aantal dieren na verloop van tijd worden gevolgd en regelmatig zachtjes zijn geprikt met een platina-draad of wimper, met beweging als een indicator van de levensvatbaarheid (figuur 2A). Deze methode heeft wijd gebruikt, want het biedt eenvoudige, directe metingen van het gemiddelde en de maximale levensduur. Deze traditionele methode is echter tijdrovend en relatief lage-doorvoer, die beperkt het aantal dieren en voorwaarden die tegelijkertijd op een gecontroleerde manier kunnen worden gemeten. Een recente studie van de simulatie vond dat veel C. elegans levensduur studies niet een groot genoeg aantal dieren om betrouwbaar detecteren van kleine veranderingen tussen voorwaarden9te kunnen doen assay. Deze traditionele methode omvat bovendien herhaaldelijk hanteren dezelfde cohort behoren van dieren na verloop van tijd, die op zijn beurt kan besmetting, introduceren en kunnen beschadigen of steeds fragiele, leeftijd dieren te doden.

We hebben een alternatieve "replicaset" methode voor het meten van C. elegans levensduur ontwikkeld. Te dien einde een grote populatie van leeftijd-gesynchroniseerd, isogene dieren zijn onderverdeeld in een aantal kleine populaties (of replica's). Genoeg replica monsters worden gegenereerd voor elk punt van de tijd in de geplande experiment. Op elk tijdstip van waarneming, worden een van de replica's is georkestreerd voor het aantal leven, dood en gecensureerde dieren en dieren binnen die repliceren verwijderd. Dus, meer dan de verwachte levensduur van de bevolking als geheel, een aantal onafhankelijke subpopulaties vormen regelmatig bemonsterd (figuur 2B). Bij het gebruik van replicasets is er geen herhaalde porren van dieren en geen herhaalde blootstelling aan potentiële verontreiniging van het milieu. Er wordt ook de levensvatbaarheid waargenomen bij de eenmalige punt volledig onafhankelijk van elke opmerking over een ander, die behandeling minimaliseert en verhoogt de doorvoer door ten minste een orde van grootte. Dit hebben wij kunnen kwantificeren veranderingen in levensduur voor honderden RNAi tegelijkertijd8,10 klonen.

Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor het uitvoeren van C. elegans levensduur via zowel de replicaset en de traditionele methoden voor het scoren van C. elegans levensduur. We laten zien dat vergelijkbare resultaten worden verkregen tussen de methoden. We hebben software ontwikkeld om te helpen in de grafische analyse van gegevens van de levensduur gegenereerd door beide aanpak, waarmee we vrij onder een GPL V3-licentie (Zie tabel van materialen). "WormLife" is geschreven in11, en bevat een grafische gebruikersinterface (GUI) voor het uitzetten van gegevens, die is getest in Mac OS en Linux. Tot slot, wij vergelijken en contrast van de beperkingen van elke methode en markeren van andere overwegingen bij de keuze tussen benaderingen voor het meten van kwantitatieve wijzigingen in C. elegans levensduur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. traditionele methode voor Scoring C. elegans levensduur

  1. Bereiding van reagentia
    1. Identificatie van genen te worden geïnactiveerd via voeding gebaseerde RNAi. Koop getransformeerde voorraden HT115 E. coli2 met de RNAi kloon van belang. U kunt ook subclone cDNA van het gen van belang in de plaats van de multicloning van de L4440-plasmide.
      Opmerking: HT115 is een stam RNase III-deficiënte E. coli met IPTG-afleidbare T7 polymeraseactiviteit, die wordt gebruikt om te voorkomen dat de afbraak van dsRNA binnen de bacteriën. Voor levensduur studies die geen van voeding gebaseerde RNAi gebruikmaken, kunnen HT115 of OP50, E. coli op standaard NGM platen gebruikte.
    2. Bereiden van 3 – 6 (of meer) 6 cm RNAi platen per testvoorwaarde (aanvullende bestand 3 voor recept). Opslaan RNAi platen bij 4 ° C vóór het zaaien met bacteriën voor tot enkele maanden.
    3. Groeien getransformeerde E. coli's nachts (16-20 h, 37 ° C incubator schudden van 180-220 toeren per minuut).
      Opmerking: HT115 E. coli is gegroeid in LB met ampicilline (50 mg/mL). Standaard OP50 E. coli is geen antibiotica resistente en groeit zonder ampicilline. Cultuur volume is afhankelijk van het aantal platen, maar is meestal tussen de 8 en 100 mL voor LB, afhankelijk van de proefopzet.
      1. Concentreren bacteriën door centrifugeren op 3000 x g gedurende 15-20 min. in een benchtop centrifuge. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 1/10e beginnen volume (d.w.z. 10 x) in LB met ampicilline voor HT115 (of zonder ampicilline voor standaard OP50).
      2. Aliquot 200 µL van geconcentreerd 10 x bacteriën aan elke plaat van 6 cm. Voorbereiding 3-4 replicatieonderzoeken per testvoorwaarde, met 2 extra back-platen, om te worden gebruikt in geval van besmetting. Bij de voorbereiding van platen, label ze dus de experimentator scoren van de test blind voor de experimentele omstandigheden is, met een kleurcode of soortgelijke coderingsschema dat. Zorg ervoor dat de code is vastgelegd.
      3. Laat open platen te drogen in een schone omgeving zoals een laminaire flow-bench totdat alle vloeistof is geabsorbeerd of overdekte platen te drogen op de Bank 's nachts toe te staan. De platen van de monitor tijdens het drogen om ervoor te zorgen dat de agar zonder overdreven drogen droog is.
        Opmerking: Overdreven drogen de platen leidt tot scheuren van de agar die leiden C. elegans tot zullen om ingraven in de agar. Natte die oppervlakken van de agar ook holen gravende bevorderen.
    4. Opslaan van gedroogde platen binnen het vak van een worm's nachts (maximaal 24 h) bij kamertemperatuur toe inductie van dsRNA productie. Na 1 dag op RT, slaan platen bij 4 ° C voor maximaal 2 weken in een verzegelde zip-lock zak (om te voorkomen dat platen uitdrogen). Vóór gebruik, terug platen tot kamertemperatuur binnen het zip-lock zak om condensatie van de invoering van airborne schimmel verontreinigingen te voorkomen.
  2. Synchronisatie van C. elegans met hypochloriet behandeling
    Opmerking: Zie aanvullende bestand 3 voor M9 en hypochloriet oplossing recepten.
    1. Gravid volwassen dieren met M9 verzamelen. Met een aangesloten glazen pipet kunt u naar 2 x 15 mL tubes.
    2. Buizen voor 30-inch ~ 2.000 rpm draaien. Controleer voor een pool van bij nematoden aan de onderkant van de buis. De bovendrijvende substantie gecombineerd. Twee keer wassen met M9 oplossing, herhalende spin en aspiratie.
    3. Resuspendeer C. elegans in 4 mL M9. Voeg toe 2 mL hypochlorietoplossing. Onmiddellijk vortex voor ~ 3 min, met periodieke krachtig schudden. Na 3 min, zoekt u een wolk van eieren onder een Microscoop ontleden. Vortex een extra 10-20 s als eieren niet na 3 min vrijgelaten zijn.
      Opmerking: De behandeling van hypochloriet Timing is essentieel. Eieren in de gravid volwassenen zijn wat behandeling overleven. Na ~ 3 min de gravid volwassenen openbreken en de eieren morsen uit. Echter, als de eieren zijn verpakt in hypochlorietoplossing lang na release zullen ze sterven. Omgekeerd, als gravid volwassenen zijn niet links in hypochlorietoplossing lang genoeg, geen eieren zijn verwerkt zal worden vrijgegeven.
    4. Snel wassen met M9 oplossing tweemaal zoals in stap 2.1.2.
    5. Resuspendeer de pellet van C. elegans ei in 3 mL M9 en overdracht aan een nieuwe tube van 15 mL. Toestaan dat embryo's om uit te komen 's nachts in 3 mL M9 oplossing met rotatie bij 20 ° C.
    6. Bereken de dichtheid van L1 dieren (of embryo's) per µL door slepen en neerzetten 10 µL van L1 oplossing 3 x op een 6 cm plaat en tellen het aantal L1 dieren voor het berekenen van het gemiddelde aantal L1s/µL.
      Opmerking: L1 dieren zullen vestigen na verloop van tijd. L1 oplossingen moeten daarom periodiek worden gemengd.
    7. Zaad 50 L1 dieren per plaat. Omkeren van platen en verzegelen met een rubberen band. Plaats de platen in een plastic worm-doos. Verzegel de doos in een grote zip-lock zak. Verplaatsen naar een 20 ° C incubator.
  3. Voorkomen van nakomelingen productie door de toevoeging van 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)
    1. Dieren groeien tot L4 fase bij 20 ° C. Controleren om te zien of gesynchroniseerd dieren hebben ontwikkeld om L4 ongeveer 40 h na het zaaien (stap 2.1.7).
      Opmerking:C. elegans ontwikkelings tijd zal variëren bij verschillende temperaturen12 en groei tarieven van mutant dieren waarvoor tarieven niet gekenmerkt empirisch getest moeten worden.
      1. Voeg 160 µL van 50 x FUdR aan elke 6 cm plaat met L4 dieren.
        Opmerking: Het is cruciaal voor de FUdR in de L4 stadium toevoegt. Zorg voor gemak, 1.000 x voorraden van FUdR door ontbinding van 1 g FUdR in 10 mL ultrazuiver H2O. Filter-steriliseren voorraad FUdR met een 0,2 µm filter en een 10 cc spuit. Aliquot ~ 1 mL voorraad in steriele 1,5 mL buizen. Bevriezen en opgeslagen bij-20 ° C.
    2. Inspecteren van platen voor de aanwezigheid van mannelijke C. elegans. Verwijder alle mannetjes.
      Opmerking: levensduur wordt meestal gemeten voor hermafrodieten en geen mannetjes. Hermafrodieten die paren leven korter dan unmated dieren, zelfs in aanwezigheid van FUdR13. Mannetjes zijn kleiner en dunner dan hermafrodieten en kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door een onderscheidend verslaafd staart14.
    3. Zet vak terug in de zip-lock zak. Terug naar 20 ° C incubator.
  4. Scoren van levensvatbaarheid
    1. Score van levensvatbaarheid dagelijks door het dier op het hoofd met een platina draad of wimper zachtjes aan te raken. Score van dieren die niet verplaatsen als dood en ze te verwijderen uit de plaat (figuur 2A). Noteer het nummer waargenomen dood voor elke voorwaarde voor elk tijdstip van de waarneming.
      Opmerking: Om het risico van het scoren van vooringenomenheid, de experimentator moet blijven blind voor experimentele omstandigheden en ook moet niet verwijst naar de resultaten van eerdere tijdstippen tijdens het scoren.
    2. Censor dieren die scheuren, sterven aan andere duidelijke ontwikkeling gebreken of crawl up aan de kant van de schotel: verwijderen deze dieren en record het nummer bij elk tijd waargenomen wijs voor behandeling in de statistische analyse. Bovendien, mannetjes zijn gevonden, verwijder ze en noteer deze als het aantal waargenomen.
    3. Herhaal vanaf stap 1.4.1 dagelijks totdat geen dieren niet levend.
      Opmerking: Moet het gazon van E. coli verminderen sterk of schimmel begint te groeien op de plaat, alle resterende dieren overdragen aan een nieuwe plaat met de juiste RNAi en FUdR.
  5. Data analyse - plotten en statistieken
    1. Input of open opgenomen observatie gegevens in software ondersteuning van survival analyse met de niet-parametrische Kaplan-Meier schatter15 en log-rank test16 (Zie aanvullende bestand 3). Zorg ervoor dat gecensureerde dieren omvatten. Neem geen mannen die werden waargenomen, indien van toepassing.
      Opmerking: gegevensindelingen kunnen variëren tussen software, maar een gemeenschappelijk formaat is opnemen van ieder dier afzonderlijk waargenomen op een aparte regel. De experimentele timepoint waartegen een dier werd waargenomen als dood is de "event"-tijd. Als gecensureerd, is de "event"-tijd het timepoint waartegen het dier werd gecensureerd. Er is meestal een veld of het aankruisvak in om aan te geven van de gecensureerde opmerkingen.
    2. Plot Kaplan-Meier overleving curven. Selecteer minder dan zes criteria voor een enkele plot als vele voorwaarden werden bepaald om de leesbaarheid te verbeteren.
      1. Kijk voor data problemen die visueel herkenbaar - metingen ontbreken, onverwachte controleresultaten, enz. — en richt deze voor statistische analyse.
    3. Gebruik van de functie log-rank test in uw software voor het uitvoeren van paarsgewijs statistische vergelijkingen. Ervoor zorgen dat alle beschikbare opties voor de behandeling van de gecensureerde resultaten voor recht-gecensureerd gegevens juist zijn ingesteld.

2. replica Set, methode voor Scoring C. elegans levensduur

Opmerking: terwijl de traditionele methode 3 – 6 platen per voorwaarde vereist (zie 1.1.2. hierboven), de replicaset methode vereist veel meer (zie stap 2.2.2 hieronder). De traditionele methode volgt dieren op de dezelfde plaat tijdens een experiment (figuur 2A). In tegenstelling met de replicaset dieren zijn slechts eenmaal scoorde: veel identieke replicatieonderzoeken worden aan het begin van het experiment zodanig instellen dat één repliceren gescoord wordt op elk tijdstip (per proef) (figuur 2B).

  1. De opstelling van de bibliotheek.
    Opmerking: Extra details over het afleveren van RNAi klonen geldt hier, als de replicaset protocol vatbaar is voor de gelijktijdige scoring van vele RNAi klonen, en kan worden geschaald naar ruim 100 klonen op een moment. Collecties van RNAi klonen zijn bewaard gebleven als glycerol voorraden bijgehouden in een indeling van de 96-wells-plaat. Replica Set experimenten gebruiken 24-Wells-platen. Nou is elk een verschillende testvoorwaarde, die kan overeenkomen met een verzameling van RNAi klonen, verschillende chemische behandelingen, dierlijke stammen, enzovoort.
    1. Monteer de lay-out van de sublibrary voor verzamelingen van RNAi klonen, zodanig dat de volgende voorwaarden wordt voldaan:
      1. Ervoor zorgen dat binnen een 96-Wells-collectie, goed A1 een lege vector negatieve controle.
      2. Voeg een extra lege vectorbestrijding willekeurig binnen elke 24 wells.
      3. De 96-wells-plaat in blokken van 24 wells, splitsen, zodat elke plaat 24-well heeft een willekeurig ingevoegd negatieve controle (figuur 2C).
      4. Een positieve controle willekeurig binnen elke groep van 24-putten (figuur 2C) invoegen.
        Opmerking: De positieve controle is afhankelijk van de experimentele vraag. Bijvoorbeeld, als een verzameling van RNAi kijken dat verhoging van de levensduur klonen, is daf-2(RNAi) vaak inbegrepen. Omgekeerd, wanneer we kijken naar verkorte levensduur, daf-16(RNAi) wordt vaak gebruikt.
  2. Voorbereiding van replicasets
    Opmerking: het aantal replicatieonderzoeken nodig is gelijk aan het minimum aantal tijdstippen (figuur 2B). A posteriori hoe lang voor het meten van de levensduur voor de aanvang van het experiment, evenals het scoren van de frequentie (bijvoorbeeld een replica instellen experiment uitgevoerd 40 dagen met elke andere dag scoren vereist een minimum van 20 replicasets voor voorbereiding moet je weten elke voorwaarde aan het begin van het experiment). Het is raadzaam om ~ 5 extra reservekopieseries (zie 2.2.2 en 2.2.2.3 hieronder).
    1. Als u wilt maken een verse stempel van de sublibrary van RNAi, beënten 200 µL LB + Amp per putje in een 96-Wells-indeling (600 µL platen) met behulp van een 96-pins plaat replicator door de volgende stappen uit:
      1. Steriliseren 96 pin plaat replicator door achtereenvolgens onder te dompelen de pinnen in 50% bleekwater, ultrazuiver H2O en ethanol. Houd de pennen ondergedompeld voor ten minste 30 s voor de bleekmiddel en ethanol.  Vlam de tips kort na onderdompeling in ethanol. Herhaal deze procedure.
        Opmerking: zorg dat alle bleekmiddel afspoelen, en laat niet de pinnen blootgesteld aan bleekmiddel voor langere perioden, zoals bleekmiddel de roestvrij-stalen pinnen corroderen kan.
      2. Verwijder voorzichtig zelfklevende folie dekking van bevroren 96-Wells-glycerol voorraad bibliotheek plaat en zachtjes maar stevig tips voor de gesteriliseerde plaat replicator vermalen in de putten van de voorraden nog bevroren glycerol. Inoculeer 200 µL LB + Amp culturen en verzegel de geënte plaat met een permeabel membraan. Culturen groeien 's nachts op de benchtop toestaan.
      3. De replicator van de plaat zoals in stap 2.1.1 steriliseren, zorgvuldig verwijderen van het zegel van de vloeibare cultuur plaat na overnachting groei en dompel toppen van de replicator pinnen. Passen de tips met zelfs druk voor een rechthoekige LB amp + tet agarplaat, en bacteriën van de overdracht van de pennen aan de plaat zachtjes met een kleine cirkelvormige beweging, ervoor te zorgen dat voldoende ruimte tussen aangrenzende vlekken overblijft. Toestaan van kolonies groeien 's nachts op de agarplaat bij 37 ° C. Zie aanvullende bestand 3 voor bereiding van LB + Amp/Tet platen.
      4. Vóór gebruik, slaan agarplaat bij 4 ° C omgekeerd (deksel zijde naar beneden), verpakt in paraffine film.
        Nota: Opslaan van kolonies deksel kant van condensatie aan het Kruis-besmetten RNAi klonen zal toestaan! Koloniën van E. coli kunnen worden opgeslagen voor 2 – 8 weken bij 4 ° C, afhankelijk van bepaalde RNAi klonen, zoals RNAi klonen werkzaamheid in inducerende dsRNA na IPTG inductie voor variabele lengtes van tijd behouden. Voor de kleine collecties van RNAi klonen, moet RNAi efficiëntie worden empirisch bepaald door RT-qPCR te bevestigen knockdown.
    2. Berekening van het minimumaantal 24-Wells-platen die nodig zijn voor een proces van het experiment: (# platen per replicaset) x (verwachte # tijd punten). Ervoor zorgen dat een paar extra replicasets opgenomen zijn voor de behandeling van vraagstukken zoals verontreiniging (figuur 2B).
      Opmerking: Het totale aantal RNAi klonen bepalen het aantal 24-Wells-platen te maken van één set replica's voor elk punt van de tijd (figuur 2C).
      1. Bereiden 24-Wells-platen, zoals stap 1.1.2 (aanvullende bestand 3 voor recept). Label platen bij de voorbereiding van hen dus de experimentator scoren van de test zal blind voor de experimentele omstandigheden, met een kleurcode of soortgelijke coderingsschema dat.
      2. Inoculeer één set van 1,5 mL LB + Amp culturen voor elke 10 replica's (zie 2.2.2). Inoculeer culturen in 96 goed diep-Wells-platen met behulp van de plaat replicator (zoals in 2.1.3) en bacteriële kolonies van 2.1.4 (figuur 2C, links). Zegel met ademend membraan, groeien 20u (37 ° C) met schudden.
      3. Beënt 120 µL van een overnachting cultuur aan elke plaat met een 6-well meerkanaalspipet met verstelbare tip afstand (figuur 2C, rechts). Droge platen ontdekt in de kap van een laminaire flow totdat alle vloeistof is geabsorbeerd. Niet te droog. Platen 's nachts bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
  3. Synchronisatie van C. elegans met behulp van hypochloriet behandeling
    1. Berekening van het minimumaantal dieren die nodig zijn voor het experiment: minimum aantal L1s nodig = (15-20 dieren per putje) (24 putten/plaat) (X platen/replicaset)(Y replica sets).
      Opmerking: de replicaset methode vereist meer dieren dan de traditionele methode. Een 10 cm plaat vol gravid wormen kunnen 20.000-50.000 L1 dieren afhankelijk van de dichtheid van gravid volwassenen. Evenzo opbrengst twintig 6 cm platen rond ~ 30.000 L1 dieren. Plan op te stellen van de voorbereiding van een ei dat het minimumaantal dieren nodig verdubbelt. Als de bevolking in voorbereiding heeft uitgehongerd, opnieuw feed of stuk aan een nieuwe plaat en laat minstens drie generaties op voedsel voor door17,18. Zorg ervoor dat te bevriezen terug overgebleven L1s.
    2. Volg de stappen 1.2 tot en met 1.2.6 zoals in de traditionele werkwijze te halen gesynchroniseerd L1 dieren. Beënt 15 – 20 L1 dieren in elk goed met een 6-well verstelbaar-spacing pipet en reagens reservoir, vergelijkbaar met 1.2.7. Periodiek Meng L1 oplossing voorkomen beslechting van dieren.
  4. Preventie van de productie van nageslacht door de toevoeging van 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)
    1. Volg stap 1.3.1.  Bereiden van steriele 50 x FUdR voorraad (zie stap 1.3.1.1).
    2. Wanneer dieren reach L4, toevoegt 25 µL van 50 x FUDR aan elk putje van een 24-well plate met behulp van een precisiepipet 6-kanaals verstelbaar-spacing.
  5. Score levensvatbaarheid
    1. Verwijder één set repliceren platen en putjes met de M9 oplossing, record totaal dieren per putje, overstroming en dan zachtjes aanraken niet-bewegende dieren op het hoofd met een worm pick (figuur 2B). Dieren niet te verplaatsen zijn scoorde als dood. Gooi scoorde platen. Record levensvatbaarheid dagelijks.
      Opmerking: Dieren die breuk, Toon bruto morfologische afwijkingen, verzuimd te ontwikkelen of aan de zijkant van de put omhoog kroop moeten worden gecensureerd door hen uitsluiten van zowel de dode en totale waarden.
      1. Het registreren van het aantal dieren dat binnen elk putje op elk punt van de tijd los van de andere waarden zijn gecensureerd.
      2. Doen niet score putten die hebben geen voedsel of zijn besmet (bijvoorbeeld schimmel of slijm); Deze putjes worden beschouwd als gecensureerd. Ook een goed te censureren als alle dieren morfologische of developmental gebreken worden weergegeven. Het opnemen van de censurerende gebeurtenis voor deze RNAi kloon/putje op dit tijdstip.
      3. Na het scoren van een repliceren plaat, gooi het. Blijven scoren een nieuwe repliceren stelt u elke dag totdat alle dieren over alle putjes dood zijn. Om het risico van het scoren van vooringenomenheid, de experimentator moet blijven blind voor experimentele omstandigheden en ook moet niet verwijst naar de resultaten van eerdere tijdstippen tijdens het scoren.
      4. Als alle dieren binnen een goed waren dood op een gegeven tijdstip, dan na het scoren van die dag, nagaan of alle dieren hebben gescoord als dood voor twee opeenvolgende tijdstippen voor een gegeven goed. Zo ja, is scoren levensvatbaarheid niet langer nodig voor dat goed in latere tijd punten.
      5. Voeren extra onafhankelijke experiment proeven. De resultaten bijhouden van opeenvolgende proeven afzonderlijk van die in vorige proeven, met het nummer van de proef genoteerd.

3. de grafiekgegevens

Opmerking: Met de replicaset methode een curve aanpassen wordt toegepast om de onderlinge aanpassing van de gemiddelde en maximale levensduur. De parameters voor de beoordeling van C. elegans sterfte passen een logit kromme19.  Zoals de meeste survival tools geen logit curve fitting ondersteunen, werd een nieuw programma ontwikkeld voor het plotten logit curven (voor Replica ingesteld); Kaplan Meier curves (voor de traditionele methode) worden ook ondersteund.

  1. Aan de slag met de software. Download het zip-bestand van versie voor de huidige versie (Zie Sectie materialen). Pak het zipbestand naar een map. Zie het bestand "readme" in de gehaalde omslag voor aanvullende installatie-instructies.
  1. Start de plotting interface. Zoek de locatie van de "code"-map in de map uitgepakt uit het zipbestand (bv  "/ Gebruikers/gebruikersnaam Desktop/WormLife/code").
    1. Voer de volgende commando's in de R console, vervangen door het pad van de map gewoon geïdentificeerd. Druk op enter of return na elk regel ingevoerd: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code") 2) source("plotGUI.R"), 3) openMain().
    2. Tijd gunnen om de interface te laden in een nieuw venster, het standaardscherm opvoeden zoals weergegeven in figuur 3A. Laat de R op de achtergrond uitgevoerd.
  2. Gegevens opmaken als door komma's gescheiden waarden (CSV) of tabs gescheiden waarde (TSV) bestanden. Het opgeven van kolommen en namen, afhankelijk van het soort analyse. Zie aanvullende bestand 4 (replicaset) en aanvullende bestand 5 (traditionele/Kaplan-Meier) voor vooraf opgemaakte voorbeeldgegevens.
    Opmerking: gegevens moeten worden opgegeven in een "lange" formaat, dat wil zeggen één rij per stam/behandeling per tijdstip per proef. CSV-bestanden worden aanbevolen voor de beste compatibiliteit tussen platformen.
    1. Verwijderen van rijen die overeenkomen met waarnemingen die werden overgeslagen of gecensureerd. Controleren op de afwezigheid van ontbrekende of niet-numerieke waarden, aangezien het in een fout resulteren kan wanneer de gegevens worden geïmporteerd.
    2. P.a. traditionele Kaplan-Meier stijl, doen niet bundelen gegevens uit onafhankelijke proeven-plot hen afzonderlijk. Voor de analyse van de replicaset, bundelen gegevens uit meerdere proeven, en vervolgens onderzoeken met behulp van de functionaliteit van de "TrialView" (zie 6.3.3.4).
  3. Met behulp van de plotting interface
    1. Een gegevensbestand ("importeren" onder het menu "Bestand") te laden met behulp van het dialoogvenster. ".Csv" om bestanden te openen, het bestandstype in de drop down naar aan ".csv" te wijzigen (de standaardwaarde is ".txt/.tsv"), ga naar de map met het gegevensbestand. Het bestand is hier de voorbeeldgegevens replicaset (aanvullende bestand 4).
      Opmerking: Importeren van een bestand als een dataset al geopend is zal vervangen de huidige dataset.
    2. Selecteer een bestand om te importeren om te starten van de wizard importeren, die helpt bij het identificeren van de kolommen van het geselecteerde bestand (Figuur S1A voor de replicaset). Als de invoergegevens correspondeert met een replicaset experiment, kies "Logit" voor studie type.
      Nota: De workflow importeren is verschillend tussen replicaset (Figuur S1A) en traditionele (Kaplan-Meier) (Figuur S1B).
    3. "Gegevens uitzetten". Selecteer "Regel toevoegen" om te beginnen met het uitzetten van gegevens. (Een regel komt overeen met een reeks voorwaarden. Er zijn mogelijkheden om te helpen met experimenten waar veel voorwaarden werden getest).
      1. Plot de controle voorwaarden-in het geval van de voorbeeldgegevens N2 (WT) met L4440 (lege vector) RNAi geschikt zijn. Selecteer "Regel toevoegen" onder het menu "Grafieken" om te starten van de wizard toevoegen regel: Selecteer de voorwaarde aan de plot en de grafische parameters voor de representatie van de lijn.
        1. Als u wilt een kromme voor een andere aandoening handmatig toevoegen, herhaalt u de stappen in 3.3.3.1
        2. Om te veranderen van kleur of symbool voor een lijn uitzetten, Kiesderegel "wijzigen" in het "menu van de grafiek".
        3. Als u wilt een lijn verwijderen zonder de goedkeuring van alle lijnen, Kiesderegel "verwijderen" onder het menu"grafiek".
        4. Schakel alle regels in het huidige perceel, Kiesderegel "wissen" onder het menu"grafiek".
        5. U "Set X schaal" onder het menu"grafiek" overschrijven de waarde automatisch geselecteerde maximale x-as (keer).
          Opmerking: de y-as (overlevende Fractie) geeft altijd 100% (boven) op 0% (onder) in stappen van 20%. De x-as wordt altijd weergegeven in stappen van 5. Aslabels niet uitgezet om flexibiliteit in labeling na het opslaan van afbeeldingen van de plot.
      2. JPEG-formaat als beelden wilt opslaan van de momenteel weergegeven plot, de optie "Opslaan Plot" in het "menu van bestand"; alleen het huidige perceel wordt opgeslagen.
      3. Voor het maken van afzonderlijke percelen voor vele verschillende voorwaarden in één experiment, kunt de software bepalen en uitzetten van een "series".
        Opmerking: De implementatie van het concept van de serie verhoogt efficiëntie bij het werken met grote experimenten.
        1. Als begint met een leeg perceel werkruimte, regels overeenkomt met controlevoorwaarden die moeten consistent worden over alle percelen in de reeks (zie 3.3.3.1) toevoegen.
        2. De reeks met "Define Series" definiëren in het menu van grafieken. Selecteer een voorwaarde die overeenkomt met de lijn eerst weer te geven in de serie; slechts één kan worden geselecteerd. Kies grafische parameters (lijn kleur en plot symbool) voor de regel, zoals in 3.3.3.1.
        3. Bekijk de percelen voor de verschillende testomstandigheden. De weergave van de "lijn van de serie" afwisselend voorwaarden met behulp van de links/rechts pijlknoppen op de zijkanten van het belangrijkste plot-venster en in het bovenste menu bar (figuur 3A-C).
          Opmerking: Als de regel van de geselecteerde reeks dezelfde voorwaarde als één van de eerder toegevoegde controle/referentielijnen is, de nieuwe regel kan verschijnen overlay.
        4. De reeks om bepaalde andere functies beschikbaar (opslaan serie percelen en Trialview-zie 3.3.3.4 voor de laatste) definiëren. Na het definiëren van een reeks, de optie "Opslaan serie Plots" uit het menu "File" waarnemingspunt image bestanden voor ieder waarnemingspunt in de serie in een nieuwe map opslaan.
      4. Trialview — visualiseren van de resultaten van onafhankelijke experimenten van een replicaset experiment. Als meerdere proeven werden uitgevoerd voor één of meer van de monster-groepen, plot de gegevens van de afzonderlijke trials en de samengevoegde gegevens uit alle proeven afzonderlijk om te evalueren van de samenhang tussen onafhankelijke experimenten (Zie afbeelding 3D).
        1. Een reeks opgezet zoals beschreven in 3.3.3.3. De verschillende proeven zullen worden uitgezet voor elk van de "verschillende" monster groepen in een ander beeld over de respectieve processen voor de opgegeven verwijzing/controlemonsters.
        2. De TrialView als beelden wilt opslaan, gaat u naar "Print TrialViews" in het menu Data; een JPEG-afbeelding zal worden uitgevoerd voor ieder waarnemingspunt in de serie.
          Opmerking: De resultaten van het voorbeeld in figuur 3D is voor een geval met twee proeven.
    4. Overzichtstabel van de gemiddelde levensduur voor de replicaset gegevens. Visueel inspecteren curven om redelijk fit van de gegevens, en selecteer vervolgens de samenvattende tabel "" optie in het menu Data op te slaan van een tabel met gemiddelde levensduur waarden (tijd op 50% overleving op logit curve) voor elk type monster.
  4. Statistische evaluatie van gegevens die zijn gegenereerd via de methode van replicaset
    1. Voor statistische analyse tussen twee groepen uit een replicaset experiment, wijzigen en uitvoeren van een script dat R, wordt geleverd in de release zip-bestand (zie "WormLife statistische analyse sjabloonscript. R").
      Opmerking: Vaardigheid in R is niet nodig om het script uitvoert. Aanvullende documentatie is in opmerkingen in het bestand. Het script is klaar voor analyse van het voorbeeld Replica Set gegevens. Gebruiker-geproduceerde gegevens in de juiste indeling kunnen (Zie aanvullende bestand 4) ook worden geanalyseerd.
      1. Open het scriptbestand in R (R GUI of RStudio).
        Opmerking: Dit geeft het script zonder het te lopen.
      2. Wijzig de locaties van de benodigde bestanden overeenkomt met de locatie op uw computer.
        Opmerking: Deze bestandspaden moet "qualified" (d.w.z. dient de locatie van het volledige bestand, inclusief mappen).
        1. Wijzigen van de paden (bestand/map plaatsen) voor "wlDir" (locatie van de map), "dataFile" (de replicaset gegevensbestand te analyseren), "compFile" (specificatie van vergelijkingen uit te voeren, indien van toepassing) en "outputPath" (de locatie waar de bestanden met resultaten zal worden geschreven to).
      3. Stel de kolomnamen in de sectie "Opgeven kolommen in het gegevensbestand" als de namen van de kolommen in het bestand dat moet worden geanalyseerd verschillend van het voorbeeldbestand zijn. Een kolom voor elke parameter opgeven. Als een studie meerdere stammen heeft, maar geen RNAi (of een andere behandeling) moet u een kolom in het gegevensbestand met lege items of hetzelfde voor alle rijen (bijvoorbeeld "no_treatment", enz.).
      4. Stel de parameter "compFile". Als de "compFile"-parameter is ingesteld op NA, dan is alle mogelijke paarsgewijze vergelijkingen van groepen zal worden uitgevoerd.
        Opmerking: Een groep wordt gedefinieerd door de combinatie van de stam/genotype en behandeling, die zijn samengevoegd en weergegeven als "strain_treatment". Grotere studies met vele groepen, kan een CSV-bestand opgeven vergelijkingen worden verkregen. Zie het voorbeeldbestand "comps_rsm_example.csv".
      5. Stel het aantal iteraties voor Monte Carlo resampling ("k.resamp", de standaardwaarde is 1000).
        Noot: P-waarden van 0 kunnen worden teruggestuurd wanneer er te weinig herhalingen worden uitgevoerd; in dergelijke gevallen dient te worden verslag "p < 0.01" (als k.resamp = 100), of "p < 0,001" (als k.resamp = 1.000), enz.
      6. Voer het script uit: "source" knop in RStudio (rechtsboven in het bewerkingsvenster) of "brondocument" in het menu "bewerken" in de R-GUI. (Uitvoering kan enige tijd duren.)
      7. Wanneer de "drukke" R-indicator niet meer wordt weergegeven, opent u de output directory-er zullen een tabel met de resultaten van elke vergelijking (mediane overleving, p-waarden, veranderings-% gemiddelde levensduur).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de ontwikkeling van een nieuwe methode is het noodzakelijk dat de nieuwe methode aanvaarde resultaten uit vorige benaderingen recapituleert en voldoet aan de norm binnen een veld. Eerder hebben wij empirisch aangetoond dat de replicaset en de traditionele methoden voor de keuring van C. elegans levensduur soortgelijke resultaten20produceren. Wild-type C. elegans (N2) onderhouden bij 20 ° C typisch leven tussen 20 en 25 dagen, die we waargenomen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zowel de traditionele en replica set methoden vereisen de synchronisatie van chronologisch leeftijd dieren. We nemen een methode waarmee wordt gesynchroniseerd van dieren met behulp van hypochloriet behandeling van gravid volwassenen, waar alleen bevruchte eieren met de gravid volwassene behandeling overleven. Deze embryo's uitkomen in vloeibare suspensie en ontwikkelingsachterstand aanhouding op de eerste larvale stadium (L1). Na het zaaien L1 dieren op voedsel ( E. coli bijvoorbeeld waarin dsRNA naar ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering voor dit werk beschreven in dit manuscript werd verstrekt door: het Bureau van de Universiteit van Rochester van de Proost en de School van geneeskunde en tandheelkunde Dean's Office via de Health Sciences Center voor computationele innovatie (HSCCI); de Ellison medische Foundation nieuwe geleerden in Aging Fellowship (AG-NS-0681-10) de financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)Gold Bio12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)Alfa AesarL16497
24 Well Culture PlatesGreiner Bio-One#662102
Rechthoekige onbehandelde enkele-well plate, 128x86mmThermo-Fisher242811
600 µL 96-well platesGreiner Bio-One#786261
2mL 96-well platesGreiner Bio-One#780286
Luchtdoorlatende plaatsealVWR60941-086
96-pin plaat replicatorNunc250520
bacto-peptonVWR90000-368
bacteriologische agarAffymetrix/USB10906
C. elegans RNAi clone bibliotheek in HT115 bacteriën- AhringerSource BioscienceC. elegans RNAi Collectie (Ahringer)Zie ook Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone bibliotheek in HT115 bacteriën- VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Bron (Vidal)Zie ook Rual et. al, Genome Research 2004. Deze bibliotheek is ook verkrijgbaar bij Dharmacon.
WormLife- Software voor Replica Set OverlevingsanalyseSamuelson LabN/Ahttps://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Lege Vector PlasmidAddgene1654https://www.addgene.org/1654/
Wormbasehttp://www.wormbase.org/ 
OASIShttps://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prismhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854(1998).
  2. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
  3. Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
  4. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
  5. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
  6. Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
  7. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  8. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  9. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
  10. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
  11. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org/ (2018).
  12. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  13. Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
  14. Hodgkin, J. Male Phenotypes and Mating Efficiency in CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 103 (1), Available from: http://europepmc.org/articles/PMC1202023/?report=abstract 43-64 (1983).
  15. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
  16. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
  17. Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
  18. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
  19. Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
  20. Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278(2014).
  21. Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
  23. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
  24. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964(2014).
  26. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
  27. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  28. Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).
  29. Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
  30. Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
  31. Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
  32. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
  33. Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
  34. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
  35. Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
  36. Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  37. Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
  38. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
  39. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  40. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Replica Set MethodC elegans LifespanHigh throughput ScreeningFeeding based RNAiSurvival Curve AnalysisMulti well Plate AssayFUdR TreatmentL1 Animal SeedingPlate ReplicatorData Analysis Software

Gerelateerde artikelen