Methodenartikel

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

DOI:

10.3791/57831

⸱

25 oktober 2018

 ,  ,  , 
1Division of Molecular Hematology, Lund Stem Cell Center, Lund University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunophenotypic karakterisering en moleculaire analyse hebben lange tijd gebruikt om af te bakenen heterogeniteit en definiëren van afzonderlijke cel populaties. FACS is inherent een eencellige assay, maar voorafgaand aan de moleculaire analyse, de doelcellen zijn vaak prospectief geïsoleerd in bulk vervoeren, eencellige resolutie waarbij u verliest. Eencellige gen expressie analyse biedt een manier om moleculaire verschillen tussen de afzonderlijke cellen in heterogene cel populaties te begrijpen. In bulk cel analyse resulteert een oververtegenwoordiging van een afzonderlijke celtype in vooroordelen en occlusie van de signalen van zeldzame cellen met biologische belang. Door gebruik te maken van FACS index Sorteren gekoppeld aan eencellige gen expressie analyse, populaties kunnen onderzocht worden zonder verlies van eencellige resolutie terwijl cellen met tussenliggende cel oppervlakte marker expressie worden ook vastgelegd, waardoor beoordeling van de relevantie van continu oppervlak marker expressie. Hier beschrijven we een aanpak die eencellige omgekeerde transcriptie combineert kwantitatieve PCR (RT-qPCR) en FACS index Sorteren gelijktijdig karakteriseren de moleculaire en immunophenotypic heterogeniteit binnen cel populaties.

In tegenstelling tot de eencellige RNA sequencing methoden voorziet het gebruik van qPCR met specifieke doel versterking in robuuste metingen van lage-overvloed afschriften met minder uitvallers, terwijl het niet is verward door de kwesties in verband met cel-naar-cel variaties in lezen diepte. Bovendien, door rechtstreeks index-Sorteren single-cellen lysis buffer deze methode, voorziet cDNA synthese en specifieke doelgroep pre versterking moet worden uitgevoerd in één stap alsook wat betreft de correlatie van vervolgens afgeleide moleculaire signaturen met celoppervlak markering voor de expressie. De beschreven aanpak heeft ontwikkeld om te onderzoeken van hematopoietische single-cellen, maar hebben ook geweest tweedehands met vrucht voort andere celtypes.

Kortom, zorgt de hierin beschreven aanpak voor gevoelige meting van mRNA uitdrukking voor een panel van vooraf geselecteerde genen met de mogelijkheid tot het ontwikkelen van protocollen voor latere potentiële isolatie van moleculair verschillende subpopulaties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elke individuele bloedcel wordt verondersteld om te verblijven in een cellulaire hiërarchie, waar stamcellen vormen de apex op de top van een reeks van steeds meer begaan tussenliggende voorlopercellen, die uiteindelijk terminaal onderscheiden in de cellen van de definitieve effector specifieke uitvoering biologische functies1. Veel van de kennis over hoe de systemen van de cel van de stam worden georganiseerd is gegenereerd in het hematopoietische systeem, grotendeels als gevolg van de mogelijkheid om verschillende hematopoietische populaties hoogverrijkt voor stamcellen of verschillende progenitoren2 prospectief te isoleren door FACS sorteren. Hierdoor heeft voor veel van deze populaties te analyseren functioneel of moleculair, voornamelijk door middel van genexpressie profilering van3,4. Echter wanneer analyse van genexpressie van bulk populaties individuele verschillen tussen cellen zijn gemiddeld uit en5verloren. Dus kan arbeidsongeschiktheid te detecteren van cel naar cel variaties binnen heterogene cel breuken verwarren ons begrip van essentieel biologische processen als kleine deelverzamelingen van cellen de afgeleid biologische functie van die bevolking6, rekening 7. Omgekeerd, onderzoek van gen expressie handtekeningen bij eencellige resolutie bieden een mogelijkheid om af te bakenen heterogeniteit en omzeilen overschaduwt invloeden uit oververtegenwoordigd deelverzamelingen van cellen8.

Tot op heden zijn er vele protocollen voor eencellige gen expressie analyse ontwikkeld; met elke benadering heeft zijn eigen beperkingen. De vroegste methode was RNA fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-vis), die een beperkt aantal afschriften maatregelen tegelijk maar is uniek in dat het mogelijk voor onderzoek van RNA lokalisatie9,11 maakt. Vroege methoden met behulp van PCR en qPCR dat één of zeer weinig transcripties werden ook ontwikkeld12. Echter zijn deze laatste tijd vervangen door microfluidics gebaseerde methoden die kunnen gelijktijdig analyseren de expressie van honderden afschriften per cel in honderden cellen tot en met qPCR en zo toestaan voor het gebruik van de analyse van de hoge-dimensionale heterogeniteit vooraf bepaald gen panelen10,13. Onlangs RNA sequencing gebaseerde technologieën zijn wijd gewend voor eencellige analyse, als dit theoretisch kunnen de hele transcriptome van een cel meten en daarmee een verkennend dimensie aan heterogeniteit analyse10, toevoegen 14. gemultiplext qPCR analyse en eencellige RNA sequencing hebben verschillende functies, dus de reden voor het gebruik van een van de manieren is afhankelijk van de vraag alsook het aantal cellen in de doelpopulatie. De hoge-doorvoer en lage kosten per cel samen met onbevooroordeelde, verkennende kenmerken van eencellige RNA sequencing zijn wenselijk wanneer onbekende cel of grote populaties worden onderzocht. Eencellige RNA sequencing is echter ook gericht op hoge overvloedige afschriften vaker sequencing terwijl chat-kopieën met lage overvloed gevoelig voor dropouts zijn. Dit kan leiden tot aanzienlijk complexe gegevens die hoge-eisen bioinformatic analyse oplegt te onthullen van belangrijke moleculaire signalen die vaak subtiele of verborgen in technische lawaai15. Dus, voor goed gekarakteriseerd weefsels, eencellige qPCR analyse met behulp van vooraf bepaalde primer panelen geselecteerd voor functioneel belangrijke genen of moleculaire merkers kunnen dienen als een gevoelige, ongecompliceerde benadering bepalen de heterogeniteit van een bevolking. Het dient echter te worden opgemerkt dat in vergelijking tot eencellige RNA-seq, de kosten per cel is over het algemeen hoger voor eencellige qPCR methoden. Hier beschrijven we een aanpak die eencellige RT-qPCR combineert (vanaf Teles J. et al. gewijzigd 16), FACS index Sorteren17 en bioinformatica analyse18 om gelijktijdig het karakteriseren van de moleculaire en immunophenotypic heterogeniteit binnen populaties.

In deze benadering, de cel bevolking van belang is gekleurd en single-cellen worden gesorteerd door FACS rechtstreeks in lysis-buffermengsel in 96-wells-platen voor PCR. Tegelijkertijd zijn de niveaus van de expressie van een extra set van celoppervlak markers opgenomen voor elke eencellige tijdens FACS-sorteren, een methode die wordt aangeduid als het index-Sorteren. Het materiaal van de cel lysed wordt vervolgens versterkt en de expressie van genen van een geselecteerde verzameling van genen geanalyseerd met RT-qPCR, met behulp van een microfluidic platform. Deze strategie maakt het mogelijk moleculaire analyse van de gesorteerde eencellige evenals gelijktijdige karakterisering van elke afzonderlijke cel celoppervlak marker expressie. Door het direct toewijzen van moleculair verschillende subsets van cellen aan de expressie van de geïndexeerde gesorteerde markers, kunnen de subpopulaties worden gekoppeld aan een specifieke immunophenotype die kan worden gebruikt voor hun potentiële isolatie. De methode wordt beschreven stap voor stap in Figuur 1. Een vooraf bepaald gen panel verder draagt bij aan een hogere resolutie van de gerichte genexpressie, aangezien het omzeilt meting van irrelevante overvloedige genen die anders subtiele gen expressie signalen kan occlude. Bovendien, de versterking van het specifieke doel, één stap omgekeerde transcriptie en versterking voorziet in robuuste meting van lage uitgedrukt afschriften, zoals transcriptiefactoren of non-poly-adenylated RNAs. Nog belangrijker is, toestaan qPCR methoden voor meting van mRNA uit fusie-eiwit, die belangrijk zijn bij het onderzoeken van bepaalde kwaadaardige ziekten19. Tot slot het gericht aantal genen onderzocht, lage drop-out rates, en beperkte technische verschillen tussen cellen maken deze methode eenvoudig geanalyseerd ten opzichte van hogere dimensionale methoden, zoals eencellige RNA-seq. Door het volgen van het protocol, kan een hele experiment worden uitgevoerd, dan het sorteren van cellen aan de resultaten van het geanalyseerde, binnen drie dagen, waardoor dit een eenvoudige en snelle methode voor gevoelige, hoge-doorvoer eencellige gen expressie analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bereiding van Lysis platen

  1. Met behulp van een gratis Bank van RNA/DNA, voorbereiden genoeg lysis-buffermengsel 96 putjes, met 10% extra, door het mengen van 390 µL nuclease gratis water, 17 µL van 10% NP-40, 2.8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0,1 M DTT en 5.3 µL RNAse remmer (Zie Tabel van materialen). Vortex en de spin naar beneden.
  2. Distribueren van 4 µL van lysis buffer aan elk putje van een 96 goed PCR plaat en verzegel de platen met zelfklevende film. Spin down buizen voor het verzamelen van vloeistof op de bodem van de platen. Houden platen op ijs totdat de cel sorteren (maximaal 24 uur).

2. voorbereiding van de cellen voor het sorteren van de cel

  1. Ontdooi de juiste aantal cellen (hier, CD34 verrijkt hematopoietische stamcellen en voorlopercellen) voor het experiment. 1 x 106 cellen zijn geschikt voor het sorteren van ongeveer drie 96-wells-platen voor single-cellen met besturingselementen.
  2. Ontdooide cellen overbrengen in een conische tube van 15 mL en voeg 1 mL FBS elke 30 s tot een totaal volume van 8 mL is bereikt. Spin van cellen in een centrifuge op 350 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
  3. Resuspendeer de cellen in 8 mL buffer kleuring (PBS met 2% FBS) en centrifugeer bij 350 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
  4. Resuspendeer de cellen in 200 µL kleuring buffer en cellen voor controle vlekken verwijderen.
  5. Maken van fluorescentie minus één besturingselementen (FMO) voor elke fluorophore, door de kleuring van een fractie van cellen in 50 µL kleuring van de buffer. In dit voorbeeld worden 6 microcentrifuge buizen met 20.000 cellen gebruikt als FMOSs. Merk op dat het aantal cellen moet worden aangepast afhankelijk van de bevolking onderzocht. Alle antilichamen op dezelfde concentratie zoals in de steekproef vlek met uitzondering van één aan elke buis toevoegen.
  6. Maak enkele vlekken voor elk fluorophore door kleuring een fractie van cellen in 50 µL buffer voor elk fluorophore gebruikt. In dit voorbeeld worden 6 microcentrifuge buizen met 20.000 cellen gebruikt. Merk op dat de doelstelling voor elke antilichaam moet worden uitgedrukt door de cellen die worden gebruikt voor besturingselementen. Voeg elke antilichaam aan dezelfde concentratie zoals in de steekproef vlek in afzonderlijke buizen. Bovendien 20.000 onbevlekt cellen in 50 µL als een onbevlekt controle te houden.
  7. Toevoegen aan het monster van de cel, antilichamen met hun geschikte concentratie. Gebruikte CD34-FITC hier staan in een concentratie van de 1/100, 1/50, CD38-APC CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 en Lineage Mix: CD3-PECy5 1/50 CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, en CD235a-PECy5 1/1000.
  8. Incubeer de cellen met antilichamen voor 30 min op ijs in het donker.
  9. Wassen cellen met 3 mL buffer kleuring. Centrifugeer cellen bij 350 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
  10. Resuspendeer de cellen en herhaalt u stap 2.9.
  11. Resuspendeer monster in 500 µL en FMO in 100 µL kleuring buffer met 1/100 7AAD en filter cellen door een 50 µm filter om de schorsing van een eencellige.

3. cel sorteren

  1. Zorg ervoor dat de machine FACS is ingesteld up correct met drop vertraging en cytometer setup en bijhouden (CST) die onlangs zijn uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant, om ervoor te zorgen dat de nodige cellen worden gesorteerd. Voor hematopoietische cellen, is het gebruik van de 85 micron mondstuk en de maximale snelheid van 4 aanbevolen, terwijl de optimale gebeurtenis tussen 800 en 2000 evenementen/s bedraagt.
  2. Corrigeer voor spectrale overlap door fluorescentie compensatie uit te voeren en poorten volgens FMO besturingselementen of interne negatief ingesteld.
  3. Reanalysis van de doelpopulatie uitvoeren ten minste 100 doelcellen in een nieuwe microcentrifuge buis met 100 µL van vlek buffer wordt gesorteerd. FACS analyseren de gesorteerde cellen door het opnemen van de gesorteerde monster en ervoor te zorgen dat ze uiteindelijk in de poort van de soort.
  4. Set-up enkele cel plaat sorteren door de centrering van de daling in goed A1 in een 96 goed bord. Wanneer het is gecentreerd, sorteren op 50 – 100 6 µm deeltjes in alle putjes op de rand van een lege 96 goed plaat om ervoor te zorgen dat alle putjes krijgt een cel in het midden van elk putje.
  5. Indien mogelijk, kan een extra controle om ervoor te zorgen dat levensvatbare cellen worden gesorteerd op worden toegevoegd door het sorteren van single-cellen in vitro groeimogelijkheden. Hematopoiëtische cellen kunnen worden gekweekt in 96 U-onderkant goed platen in 100 µl SFEM met 1% penicilline streptomycine, 100 ng/mL, FLT3L, TPO en SCF. Analyseer elk putje na 3 dagen in cultuur voor cel kolonies met behulp van een microscoop.
  6. Verwijder zelfklevende folie van platen. Soort een eencellige belang (hier Lin-CD34 + CD38-cellen) in 92 uit de 96-wells, activeren INDEX-sorteren in de FACS sorteren software op te slaan van het profiel van de immunophenotypic voor andere markeringen van belang (hier CD45RA, CD49f en CD90) voor elke één cel.
  7. Sorteren van twee putjes met 10 tot 20 cellen respectievelijk voor lineariteit besturingselementen in de PCR versterking. Wells H1 en H2 worden meestal gebruikt.
  8. Houd twee putten zonder cellen als Nee-template beheert, meestal putjes H3 en H4.
  9. Zegel van de platen met duidelijke kleeffilm en draaien van de platen bij 300 x g gedurende 1 minuut voordat de module bevriezen op droog ijs.
  10. Winkel bevroren platen bij-80 ° C.
    Opmerking: Veilige stopplaats. Gesorteerde en lysed cellen kunnen worden gehouden bij-80 ° C voor langdurige opslag.

4. omgekeerde transcriptie en versterking van de specifieke doelgroep

  1. De primer mix voorbereiden op alle 96 gene doelen door toevoeging van 2 µL van elk paar primer, met inbegrip van huishouding gene primers en inleidingen voor spiked-controle RNA, in een 1,5 mL RNAse gratis tube op een gratis RNA/DNA-bank. Als gebruikend minder dan 96 inleidingen, voegt u een gelijkwaardige hoeveelheid nuclease gratis water voor de ontbrekende inleidingen. Inleidingen zijn apart besteld aan het gewenste gen-deelvenster.
  2. Omgekeerde transcriptie en specifieke doel versterking mix door toevoeging van 632.5 µL 2 x reactie mix, 101,2 µL Taq/SuperscriptIII, 151.8 µL Primer mix en 0,7 µL spiked in besturingselement RNA. Het uitvoeren van deze stap op een gratis DNA-bank. Meng door vortexing en spin tot verzamelen de vloeistof in de bodem van de buis. Houd op ijs tot toevoeging aan het monster.
  3. Make neen-reverse transcriptie controle mix voor vier putten door het mengen van 27.5 µL van 2 x reactie mix, 1.76 µL van enzym Taq, 6,6 µL van primer mix en 2.64 µL van nuclease gratis water. Spike in besturingselement RNA. Voer deze stap op een gratis DNA-bank. Vortex en spin tot verzamelen de vloeistof in de bodem van de buis en houd op ijs tot toevoeging aan monster.
  4. Ontdooi lysate platen op ijs. 8.75 µL van het eerder bereid omgekeerde transcriptie en specifieke doel versterking mix aan 92 wells, inclusief de lineariteit en neen-template besturingselementen toevoegen. 8.75 µL neen-reverse transcriptie controle mix toevoegen aan de vier resterende putten. Zegel platen met duidelijke kleeffilm en spin tot verzamelen vloeistof op de bodem van de platen.
  5. Uitvoeren van omgekeerde transcriptie en specifieke doel versterking door het uitvoeren van de plaat in een PCR machine volgens de voorversterker-programma; stap 1:50 ° C gedurende 60 min, stap 2: 95 ° C gedurende 2 min, stap 3: 95 ° C gedurende 15 s, stap 4: 60 ° C gedurende 4 min, herhaal 3-4 24 stappen tijden en tot slot stap 5: 8 ° C voor eeuwig.
  6. Na PCR voltooid is, blijven de plaat bij 8 ° C voor korte termijn opslag en -20 ° C voor lange termijn opslag.
    Opmerking: Veilige stopplaats. Versterkte materiaal kan worden bewaard bij 8 ° C voor korte termijn opslag en bij-20 ° C voor langdurige opslag.

5. bereiding van het monster en Assay platen Multiplex Microfluidic gen expressie analyse

  1. Bereiden assay laden plaat door pipetting 3 µL Assay laden reagens aan elk putje van een 96 goed plaat. Voeg 3 µL van elke primer aan individuele putjes in de plaat laden assay.
  2. Zegel plaat met zelfklevende film en draai tot verzamelen vloeistof op de bodem van de platen.
  3. Bereiden verdunning plaat door pipetting 8 µL van nuclease gratis water in alle wells van een 96 goed plaat. Voeg 2 µL van versterkte monster op de plaat van verdunning, het maken van een uiteindelijke verdunning 1:5.
  4. Zegel van de plaat met kleeffilm, Meng door vortexing plaat voor 10 s, en ten slotte spin tot verzamelen vloeistof op de bodem van de platen.
  5. Bereid monster laden mix door het zorgvuldig 352 µL van master mix te mengen met 35.2 µL van het monster laden reagens. Voorbereiding van monster laden plaat door aliquoting 3.3 µL van het laden van de mix aan elk putje van een 96 goed plaat.
  6. Voeg 2.7 µL van het verdunde monster in elk putje van de steekproef laden plaat.
  7. Zegel plaat met zelfklevende film en draai tot verzamelen vloeistof op de bodem van de platen.

6. laden van Microfluidic Chip

  1. Haal een nieuwe 96 x 96 microfluidic chip. Bereiden inhammen door prikken ze met een injectiespuit met de dop op om ervoor te zorgen dat ze kunnen worden verplaatst.
  2. Bubbels verwijderen uit spuiten. Volledige volume van injectiespuiten aan elke klep toevoegen terwijl de chip 45 graden kantelen en je houdt het ventiel. Eerste chip met de IFC-controller.
  3. Laden elke assay inlaat met 4,25 µL van elk van de putten in de bepaling laden plaat. Vermijd bellen. Als bubbels in de put wordt weergegeven, kunt u ze verwijderen met een pipet tip.
  4. Doorgaan met het laden van elk monster inlaat met 4,25 µL van elk van de putten in het monster laden plaat, voorkomen van bubbels en als bubbels wordt weergegeven, verwijdert u deze met pipet tip.
  5. Belasting chip met de IFC-controller.
  6. Controleer of de chip ziet er zelfs en dat alle kamers zijn geladen. Stof verwijderen van het oppervlak van de chip door het aanraken van het met tape. De chip in het multiplex microfluidic gen expressie platform uitgevoerd.

7. draait Chip op Multiplex Microfluidic gen expressie Platform

  1. Na het laden chip in het multiplex microfluidic gen expressie platform, de naam van het monster.
  2. ROX ingesteld als passieve kleurstof. Stel één sonde en FAM-MGB als fluorescentie. Gebruik 96 x 96 standaard v2 als protocol. Start uitvoeren.
  3. Verwijder chip wanneer uitvoert is voltooid.

8. voorlopige analyse van Chip Run

  1. Laden gegevens in Real-Time PCR analysesoftware.
  2. Namen van gene en cel door te plakken de indeling van de cel en gen uit een door tabs gescheiden bestand laden.
  3. Afbeelding weergave openen en selecteer ROX als kleurstof. Controleer of alle putjes ROX passieve kleurstof.
  4. Onderzoeken of alle versterking percelen ok, met een soepele amplificatie curve met geen spikes (vergelijkbaar met de 3E figuur kijken).
  5. Zorg ervoor dat alle single-cellen uitdrukking van spiked-controle RNA om ervoor te zorgen dat alles correct zijn geladen.
  6. Zorgen dat alle cellen huishouding genexpressie hebben en dus zijn gesorteerd naar behoren.
  7. Ervoor zorgen dat 10 en 20 cel lineariteit besturingselementen ongeveer 1 CT verschil hebben voor het valideren van lineaire versterking.
  8. Controleer of er expressie in de noRT controlemonsters. Als de expressie wordt gedetecteerd in de noRT kunt u overwegen sondes te sondes die niet gedetecteerd genomic DNA van latere punten wijzigen.
  9. Gegevens in CSV-bestanden voor verdere analyse exporteren.

9. eencellige analyse met behulp van SCExV

Opmerking: Een inleidende film is aanwezig20 te voeren het gereedschap. Hier wordt een korte aanbeveling over het doen van analyse met behulp van de besturingselementen in het protocol opgenomen gepresenteerd.

  1. Sluit aan op de website van SCexV20.
  2. Geëxporteerde CSV-bestanden uploaden.
  3. Koos het besturingselement spiked-in RNA als positieve controle. Elke cel heeft een besturingselement RNA CT boven 25 verwijderen. Normaliseren van de gegevens op mediaan expressie van besturingselement RNA.
  4. Klik op "hier -> Analyze". Verwijder noRT, notemplate, 10 en 20 controles van de cel in de optie van de cel uitsluiten.
  5. De cellen van het cluster met de clustering aanpak van keuze met het verwachte aantal clusters. Geanalyseerde waarden worden geëxporteerd.

10. Index-sorteren analyse

  1. Open FACS analysesoftware en laden van de geïndexeerde monsters.
  2. De scripteditor openen en uitvoeren van het script beschikbaar vanaf Quinn J. et al. 21
  3. Nu de analysesoftware FACS moet hebben gemaakt van een poort voor elk van de afzonderlijke cellen, open de redacteur van de lay-out en kleur van de cellen volgens de groepering van SCexV (beschikbaar in het bestand met de naam "Sample_complete_Data.xls").

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschreven is snel, gemakkelijk uitgevoerd en zeer betrouwbaar. Een overzicht van de experimentele opstelling wordt gepresenteerd in Figuur 1. Het volledige protocol, van sorteren van single-cellen, tot versterking van het specifieke doel, gen expressie metingen en voorlopige analyse kan worden uitgevoerd in drie dagen. Een voorbeeld van de geanalyseerde resultaten in de vorm van een warmte-kaart die voorlopige geanalyseerde gegevens vertegenwoor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren is de eencellige gen expressie analyse een waardevolle toevoeging aan het definiëren van de heterogeniteit van de verschillende cel populaties23geworden. De komst van RNA sequencing technologieën biedt theoretisch een mogelijkheid voor het meten van de gehele transcriptome van een cel, maar deze methoden worden bemoeilijkt door variaties in de cel-naar-cel sequencing diepten en drop-outs. Eencellige qPCR biedt een gevoelige en robuuste analyse van de expressie van honderden k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Zweedse Cancer Society, de Zweedse Onderzoeksraad, The Swedish Society voor medisch onderzoek, de Zweedse Childhood Cancer Foundation, The Ragnar Söderberg Foundation, en The Knut en Alice Wallenberg Foundation

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CD14 PECY5eBioscience15-0149-42Clone: 61D3
CD16 PECY5Biolegend302010Clone: 3G8
CD56 PECY5Biolegend304608Clone: MEM-188
CD19 PECY5Biolegend302210Clone: HIB19
CD2 PECY5Biolegend300210Clone: RPA-2.10
CD3 PECY5Biolegend300310Clone: HIT3a
CD123 PECY5Biolegend306008Clone: 6H6
CD235A PECY5BD Pharma559944Clone GAR2
CD34 FITCBiolegend343604Clone: 561
CD38 APCBiolegend303510Clone: Hit2
CD90 PEBiolegend328110Clone: 5E10
CD45RA BV421BD bioscience560362Clone: HI100
CD49f Pecy7eBioscience25-0495-82Clone: eBioGOH3
FBSHyCloneSV30160.3
PBSHyCloneSH30028.02
96-well u-bottom PlateVWR10861-564
SFEMStem cell technologies9650
Penicillin streptomycinHyCloneSV30010
TPOPeprotech300-18
SCFPeprotech300-07
FLT3LPeprotech300-19
Falcon Tube 15 mLSarstedt62.554.502
Eppendorph tubeSarstedt72.690.001
CST beadsBD642412
Accudrop BeadsBD3452496 µm particles 
Adhesive film ClearThermo scientific AB-1170
Adhesive film FoilThermo scientific AB-0626
96 well PCR plateAxygenPCR-96M2-HS-C
PCR 1.5 mL tubeAxygenMCT-150-L-C
T100 PCR cyclerBioRad186-1096
10% NP40Thermo scientific 85124
10 mM dNTPTakara4030
0.1 M DTTInvitrogenP2325
RNAsoutInvitrogen10777-019RNAse inhibitor
CellsDirect One-Step qRT-PCR KitInvitrogen11753-100
Neuclease free waterInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
2x Reaction MixInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
SuperScript III RT/Platinum Taq MixInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
Platinum Taq DNA PolymeraseInvitrogen10966026
TaqMan Cells-to-CT Control KitInvitrogen4386995
Xeno RNA ControlInvitrogen4386995From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression AssayInvitrogen4386995From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCsFluidigmBMK-M10-96.96
2x Assay Loading ReagentFluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
20x GE Sample Loading ReagentFluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
Control line fluid FluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4369016
BioMark HDFluidigmBMKHD-BMKHD
96.96 Dynamic Array IFCFluidigmBMK-M10-96.96GT
ExcelMicrosoftMicrosoft
FlowJo V10TreeStarTreeStar
Fluidigm real time PCR analysisFluidigmFluidigm
CD179a.VPREB1Thermofisher scientificHs00356766_g1
ACEThermofisher scientificHs00174179_m1
AHRThermofisher scientificHs00169233_m1
BCR_ABL.52Thermofisher scientificHs03043652_ft
BCR_ABL41Thermofisher scientificHs03024541_ft
BMI1Thermofisher scientificHs00995536_m1
CCNA2Thermofisher scientificHs00996788_m1
CCNB1Thermofisher scientificHs01030099_m1
CCNB2Thermofisher scientificHs01084593_g1
CCNCThermofisher scientificHs01029304_m1
CCNE1Thermofisher scientificHs01026535_g1
CCNFThermofisher scientificHs00171049_m1
CCR9Thermofisher scientificHs01890924_s1
CD10.MMEThermofisher scientificHs00153510_m1
CD11aThermofisher scientificHs00158218_m1
CD11c.ITAXThermofisher scientificHs00174217_m1
CD123.IL3RAThermofisher scientificHs00608141_m1
CD133.PROM1Thermofisher scientificHs01009250_m1
CD1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  2. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  3. Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27(2017).
  4. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
  5. Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
  6. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  7. Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  8. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
  9. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  10. Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019(2017).
  11. Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57(2014).
  12. Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
  13. Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63(2008).
  14. Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096(2013).
  15. Tung, P. -Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921(2017).
  16. Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
  17. Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
  18. Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320(2015).
  19. de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
  20. Lang, S., et al. SCExV. , Available from: http://stemsysbio.bmc.lu.se/SCexV/ (2015).
  21. Quinn, J. indexed-sorting. , Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016).
  22. Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
  23. Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
  24. Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
  25. Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
  26. Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692(2017).
  27. Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
  28. Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83(2016).
  29. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Genexpressie op enkelcelniveauFACS index sorterenstamcelheterogeniteitRT qPCR analyseflowcytometrieceloppervlaktemarkersmicroflu dische genexpressieprincipale componentanalyseprospectieve isolatie

Gerelateerde artikelen