Methodenartikel

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

DOI:

10.3791/57843

⸱

7 september 2018

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze paper beschrijven we een protocol karakteriseren T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobulin (Ig) isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Deze methode gebruikt alleen of in combinatie met stroom cytometry onderzoekers te identificeren van verschillen in de B-cel-gemedieerde Ig isotype reacties in muizen na T-afhankelijke en T-onafhankelijke antigeen immunisatie zal toestaan.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antilichamen, ook wel genoemd zoals immunoglobulinen (Ig), uitgescheiden door B-lymfocyten, plasmablasts/plasmacellen, Humorale immuniteit gedifferentieerde bieden een formidabele verdediging tegen invasie ziekteverwekkers via diverse mechanismen. Een belangrijk doel van vaccinatie is voor het opwekken van beschermende antigeen-specifieke antilichamen om levensbedreigende infecties te voorkomen. Zowel zwezerik-afhankelijke (TD) en zwezerik-onafhankelijke (TI) antigenen robuuste antigeen-specifiek IgM reacties kunnen uitlokken en ook de productie van isotype-switched antilichamen (IgG, IgA en IgE) kunnen veroorzaken evenals de generatie van geheugencellen B met behulp geboden door antigeen presentatie van cellen (APCs). Hier beschrijven we een protocol karakteriseren TD en TI Ig isotype reacties in muizen met behulp van de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA). In dit protocol, zijn TD en TI Ig reacties ontlokte bij muizen door intraperitoneaal (i.p.) immunisatie met hapten-geconjugeerde model antigenen TNP-HC (in aluin) en TNP-polysaccharide (in PBS), respectievelijk. Om te induceren TD geheugen reactie, wordt een booster immunisatie van TNP-HC in aluin gegeven op 3 weken na de eerste immunisatie met de dezelfde antigen/adjuvant. Muis sera worden geoogst op verschillende tijdstippen vóór en na immunisatie. Totaal serum Ig niveaus en TNP-specifieke antilichamen zijn vervolgens gekwantificeerd aan de hand van Ig isotype-specifieke Sandwich en indirecte ELISA, respectievelijk. Om correct kwantificeren de serumconcentratie van elke Ig isotype, moeten de monsters op passende wijze te passen binnen het lineaire bereik van de standaard curven worden verdund. Met behulp van dit protocol, hebben wij consequent betrouwbare resultaten verkregen met hoge specificiteit en de gevoeligheid. Wanneer gebruikt in combinatie met andere aanvullende methoden, zoals de stroom cytometry, in vitro cultuur van milt B-cellen en immunohistochemische zal kleuring (IHC), dit protocol toestaan onderzoekers een uitgebreide inzicht van antilichaam Reacties in een bepaalde experimentele setting.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B-lymfocyten zijn de belangrijkste speler in de Humorale immuniteit en het enige celtype in zoogdieren die produceren antilichamen kunnen, ook aangeduid als immunoglobulinen (Ig)1,2. Antilichamen uitgescheiden door B-cellen zorgen voor een formidabele verdediging tegen invasie ziekteverwekkers via diverse mechanismen, met inbegrip van neutralisatie, opsonization en activering van de aanvulling, wat leidt tot protectieve immuniteit3. Secretie van antilichamen door B-cellen wordt alleen bereikt na volledige activering van bepaalde B-cellen, die normaal gesproken vereist dat twee verschillende signalen3. Signaal 1 doorgegeven door directe binding van het antigeen (Ag) naar de B-cel receptor (BHG) uitgedrukt op het oppervlak van specifieke naïef B cellen3. Afhankelijk van de bron van signaal 2, kan B-cel-activatie worden onderverdeeld in zwezerik-afhankelijke (TD) of zwezerik-onafhankelijke (TI)3,4. In een reactie TD antigeen wordt signaal 2 verzorgd door geactiveerde cognaat CD4 T helper (TH) cellen, die express CD154, de ligand voor de co-stimulatory receptor interactie CD40 uitgedrukt op B cellen1,2,3. In een reactie TI antigeen signaal 2 komt uit beide betrokkenheid van Toll-like receptoren (TLRs in het geval van type 1 TI Ag) of uitgebreide cross-linking van de BCRs (in het geval van type 2 TI Ag) op de B cellen3,4. Type 1 TI (TI-1) antigenen zijn microbiële liganden van TLRs, met inbegrip van bacteriële lipopolysacchariden (LPS), virale RNAs, en microbiële CpG DNA4,5. Type 2 TI (TI-2) antigenen zeer repetitieve structuur hebben, en zijn in staat om langdurige en voortdurende signalering naar de B-cel door meerdere cross-linking van de BCRs4,6. Typische voorbeelden van TI-2 antigenen zijn pneumokokken polysacchariden en hapten-geconjugeerde polysaccharide6,7. Zowel TD en TI antigenen robuuste antigeen-specifiek IgM reacties kunnen uitlokken en kunnen ook leiden tot de productie van isotype-switched antilichamen (IgG, IgA en IgE) met de hulp die geboden door antigeen presentatie van cellen (APCs) zoals dendritische cellen (DC's)1 ,2,3. Bovendien zowel TD en TI antigenen kunnen ertoe geheugen reacties met behulp van APCs, maar TD antigenen zijn efficiënter in inducerende geheugen B-cel generatie3,8.

In dit protocol zijn TD en TI Ig reacties ontlokte bij muizen door intraperitoneaal (i.p.) immunisatie met hapten-geconjugeerde model antigenen 2,4,6-trinitrophenyl-sleutelgat limpet hemocyanine (TNP-HC) en TNP-polysaccharide (neutraal, sterk vertakt en hoge-massa), respectievelijk9,10,11. TD-antigenen zijn het meestal gebruikt met adjuvans ter verbetering van de productie van antilichamen12. Hier in ons protocol, wordt TNP-HC geïnjecteerd met aluin, een veelgebruikte adjuvans in immunisatie studies12. Andere voorbeelden van hulpstoffen die kunnen worden gebruikt zijn volledig of onvolledig Freund van adjuvans (CFA- of IFA), monophosphoryl-lipide-A / trehalose dicorynomycolate ("Ribi" adjuvans), en apr oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. na immunisatie, muis sera op verschillende tijdstippen worden geoogst en TNP-specifieke antistoffen in sera worden gekwantificeerd aan de hand van Ig isotype-specifieke enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)9,10, 11.

ELISA is een plaat gebaseerde test die wijd is gebruikt als kenmerkend hulpmiddel in geneeskunde en ook als een analytisch hulpmiddel in biomedisch onderzoek15,16. Het wordt gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van de analyten met inbegrip van antilichamen, hormonen, cytokinen, chemokines, en verschillende antigenen, enz. ELISA kan worden uitgevoerd in verschillende indelingen, met inbegrip van directe, indirecte, sandwich en competitieve ELISA15,16. In het algemeen, het gaat om de immobilisatie van het antigeen op een effen oppervlak, meestal een 96-wells microtiterplaat plaat, die is geïncubeerd met een primair antilichaam. Na incubatie is het unbound antilichaam weggewassen. In een directe ELISA, is het primaire antilichaam direct geconjugeerd met een enzym (meestal mierikswortelperoxidase of alkalische fosfatase), die een chromogenic substraat klieven kan om de opbrengst van een zichtbare kleurverandering gedetecteerd door een signaal-detectie-instrument, zoals een spectrofotometer15,16. Daarentegen als een enzym-verbonden secundair antilichaam wordt gebruikt voor het binden van het primaire antilichaam, wordt dan dit beschouwd als een indirecte ELISA15,16. Directe ELISA is sneller terwijl indirecte ELISA gevoeliger15,16 is. De platen zijn bekleed met een "capture" antilichaam gebruikt om te immobiliseren van het antigeen van belang in de monsters in een sandwich-ELISA, en vervolgens het vastgelegde antigeen kan worden opgespoord door een andere "" detectieantilichaam in een directe of indirecte wijze15, 16. Sandwich-ELISA biedt hoge specificiteit aangezien het antigeen wordt gedetecteerd door twee verschillende antilichamen van het antigeen. De competitie is gevestigd tussen de monster-antigeen en het plaat-gebonden antigeen voor de binding met het primaire antilichaam in een competitieve ELISA, en vervolgens de concentratie van antigeen in de steekproef wordt gekwantificeerd door het meten van de afname van het signaal van het substraat 15 , 16. competitieve ELISA kan worden uitgevoerd met behulp van de hierboven genoemde directe of indirecte indeling en is nuttig voor het opsporen van kleine antigenen met slechts één epitoop15,16.

Alternatieve technieken voor het meten van antilichamen omvatten radio-immunoassay (RIA), electrochemiluminescence (ECL) assay en oppervlak plasmon resonantie (SPR) assay17. RIA was de eerste immunoassay ontwikkeld dat maatregelen de aanwezigheid van een antigeen (of antilichaam) met hoge specificiteit en de gevoeligheid met behulp van radiolabeled reagentia18,19. Echter, als gevolg van de bezorgdheid van radioactieve toxiciteit, verwijderingskosten, houdbaarheid en speciale licenties te werken met radioactieve materialen, ELISA is een betere en meer handige techniek voor common gebruikt20,21. ECL is een hooggevoelige test waarin chemiluminescentie reacties worden gestart met behulp van elektriciteit te genereren zeer reactieve soorten uit stabiele precursoren op het oppervlak van een elektrode, en kunnen worden gebruikt voor het meten van de hoeveelheid analyten (zoals antigenen of antilichamen)22. Echter, ECL vereist een speciaal instrument en dus is niet zo breed gebruikt als ELISA23. SPR is een directe test die kan worden gebruikt voor het meten van de binding van liganden (bv., antilichamen) aan geïmmobiliseerd moleculen (bv., antigenen) op een sensor chip oppervlakte24. SPR detecteert de interacties in real-time heel concreet en vereist niet het gebruik van gelabelde reagentia zoals in ELISA. Echter, SPR ook vereist dat een speciale apparatuur en lagere gevoeligheid dan ELISA17heeft. Gezien de beperkingen van de alternatieve methoden, is ELISA de meest geschikte en handige techniek voor ons doel in dit protocol. Hier beschrijven we het gebruik van sandwich-ELISA voor de analyse van de totale Ig isotype-niveaus en de procedures van indirecte ELISA voor de analyse van antigeen-specifieke Ig isotypes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol volgt de richtsnoeren van de ethische commissie van de institutionele dierlijke onderzoek van Rutgers University. Alle muizen worden gebruikt overeenkomstig de richtsnoeren van de NIH en onder een dierlijke protocol goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité.

1. bereiding van muizen en verzameling van naïeve muis Sera

  1. Houd alle muizen voor immunisatie experimenten in een specifieke pathogenen vrije dier faciliteit.
  2. Gebruik gender-matched, jonge volwassene (8-12 weken oud) van het knock-out en littermate controle muizen die dezelfde ouders en kooien voor immunisatie studies delen.
  3. Plan de immunisatie en serum collectie schema's zoals afgebeeld in Figuur 1.
  4. Oogst naïef serum van elke muis op 7 dagen (-7 dagen) vóór immunisatie. Volg de procedures van de retro-orbitaal bloeden en serum de voorbereiding zoals hieronder beschreven in stap 4.

2. voorbereiding van TNP-polysaccharide (een TI-antigeen) en TNP-HC (een TD-antigeen)

  1. Los de antigeen-poeders in steriele PBS (pH 7.4) grondig te maken van 0,5 mg/mL van TNP-polysaccharide materieel en 1 mg/mL TNP-HC stamoplossingen. Aliquoot elk antigeen stockoplossing in steriele microfuge buizen op 0,5 mL/buis, en houd de aliquots bij-80 ° C voor langdurige opslag. Vermijd meerdere bevriezen en ontdooien van het antigeen aliquots.
  2. Op de dag van de injectie, het berekenen van het volume van TNP-polysaccharide (50 µg/100 µL/muis) of TNP-HC (100 µg/100 µL/muis) moest volgens het aantal muizen worden geïnjecteerd. Ontdooi de juiste aantal TNP-polysaccharide of TNP-HC aliquots bij kamertemperatuur (RT).
  3. Voor TNP-HC injectie, eerst de aluin adjuvans (40 mg/mL) met 3 delen steriel PBS tot een eindconcentratie van 10 mg/mL verdund. Zorg ervoor dat de aluin adjuvans mengsel goed geschorste vóór verdunning.
  4. Combineren van gelijk volume van 10 mg/mL aluin adjuvans drijfmest uit stap 2.3 en de ontdooide TNP-HC-oplossing (1 mg/mL) in een polypropyleen tube van 5 mL, meng goed en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten voorbereiden deze TNP-HC/aluin Meng vers vóór de injectie.

3. de immunisatie van muizen

  1. Uitvoeren intraperitoneaal (i.p.) injectie van TNP-polysaccharide of TNP-HC/aluin te immuniseren van de muizen met 1 mL insuline spuiten in een kast van de bioveiligheid. Plaats de naald op ongeveer 30° hoek bij voorkeur in de lagere juiste kwadrant van elke muis om te voorkomen dat de injectie in de inwendige organen.
  2. Injecteren i.p. 100 µL van TNP-polysaccharide per muis op dag 0 voor TI Ag immunisatie(Figuur 1).
  3. Injecteren i.p. 200 µL van het mengsel van de TNP-HC/aluin (vers bereid in stap 2.4) per muis op dag 0 voor TD Ag immunisatie. Herhaal de zelfde injectie op dag 21 als een booster vaccinatie voor geheugen studies (Figuur 1B).
  4. Na de injectie, elke muis terug te keren naar zijn kooi en bewaar alle de ingespoten muizen op voorwaarde van specifieke pathogenen vrije.

4. retro-orbitaal bloeden en Serum voorbereiding

  1. Muis sera op verschillende tijdstippen van de oogst: voor TNP-polysaccharide immunisatie, muis sera te verzamelen op dag -7 en 7 (Figuur 1A); verzamelen voor TNP-HC/aluin immunisatie, muis sera op dag -7, 7, 14 en 28 (Figuur 1B).
  2. Anesthetize voor Retro-orbitaal bloeden, elke muis met 5% Isofluraan gedurende 1-2 min. in een kabinet van bioveiligheid25. Pedaal reflex om ervoor te zorgen voldoende verdoving van elke muis uitvoeren.
  3. Houd de narcose muis in een hand met de wijsvinger en de duim trekken van de huid rond de oogbol terug, zodat de oogbol uit de socket-25 steekt. Plaats een niet-EDTA Pasteur pipet of capillaire buis onder een hoek van 45° in de binnenste hoek van de oogkas onder de oogbol25.
  4. Zachte neerwaartse druk uitoefenen en draai de pipet of buis zachtjes te breken in de ader en verzamelen van 150-200 µL bloed in de pipet of buis. Onmiddellijk het bloed overbrengen in een steriele 1,5 mL microfuge buis en de muis terug te keren naar zijn kooi te herstellen.
  5. Laat het bloed monsters op RT voor 1-2 h zitten te coaguleren.
  6. Centrifugeer het gestolde bloedmonsters bij 13.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De duidelijke serum bovenop de bloedklonter overbrengen in een nieuwe steriele 1,5 mL microfuge buis.
  7. Herhaal stap 4.6 nog een keer te verwijderen van de resterende bloedstolsel en verzamelen de duidelijke serum.
  8. Aliquot het serum in steriele 1,5 mL microfuge buizen op 50 µL/buis, en op te slaan van de sera bij-80 ° C.
  9. Het oog voor bloeden op verschillende tijdstippen, zodat elk van beide ogen is bloedde hooguit twee keer voor de hele experiment worden afgewisseld. Bij de terminal bloeden, maximaal 1 mL bloed van elke muis voor euthanasie te verzamelen. De muis met 5% CO2 gevolgd door cervicale dislocatie euthanaseren.
    Opmerking: Milt B cellen kunnen worden geoogst voor stroom cytometrische analyses en in vitro cultuur studies. Wij bereiden ook genomic DNA van splenocytes om te controleren of het genotype van elke muis.

5. muis Ig Isotype-specifieke ELISA

  1. Bereiden de buffers en oplossingen voor ELISA.
    1. Het bereiden van 500 mL koppeling Buffer (PBS, pH 7.4).
    2. Bereiden van Wash 500 mL (PBS-T (0,05% Tween-20), pH 7.4).
    3. Bereiden van 100 mL Buffer blokkeren (1% BSA in PBS, pH 7.4, opgeslagen bij 4 ° C).
    4. Bereiden 1 L voor substraat Buffer (1 M diethanolamine, pH 9,8 (97 milliliters diethanolamine in 1 L H2O, pH aangepast met behulp van 10 M HCl) en 0,5 mM MgCl2). De Buffer substraat beschermen tegen licht door inwikkeling van de fles met aluminiumfolie. Bewaren bij 4 ° C.
    5. 100 mL eindeoplossing (3 M NaOH) voor te bereiden.
  2. Coat de ELISA-plaatjes:
    1. Voor de totale serum Ig isotype ELISA, jas 96-Wells immuno platen met 10 µg/mL isotype-specifieke polyklonale geit-antimuis Ig vastleggen (M, G1, G2a, G2b, G3, A of E) Abs in koppeling Buffer (PBS) op 100 µL per putje.
    2. Jas voor TNP-specifieke Ig isotype ELISA, immuno 96-wells-platen met 10 µg/mL TNP(38)-BSA in PBS op 100 µL per putje.
    3. Jas voor hoge affiniteit TNP-specifieke Ig isotype ELISA, immuno 96-wells-platen met 10 µg/mL TNP(3)-BSA in PBS op 100 µL per putje26. Incubeer de platen bij 4 ° C's nachts.
  3. Na een incubatieperiode van de coating, het wassen van de platen 2 keer met 200 µL per putje van PBS-T. Negeren van de Wash-Buffer en de vlek de platen (tik elke plaat ondersteboven op een stapel papieren handdoeken) droog na elke wasbeurt.
  4. Blokkeren van de platen: toevoegen van 200 µL per putje van blokkeren (1% BSA in PBS) Buffer in de gecoate platen en Incubeer de platen gedurende 1 uur op RT.
  5. Terwijl de platen blokkeren, maak verdunningen van Ig isotype normen en serummonsters in Buffer blokkeren in een aparte, onbehandelde 96-wells-plaat duikt met 150 µL per putje.
    1. Bereiden van 250 ng/mL Ig isotype normen als de standaard beginconcentratie (St01) en 7 tot en met 10 van de seriële verdunningen 1:2 van de Ig-normen (St02 St07 of St10, Figuur 2).
    2. Bereiden muis serum monsters bij een verdunning 1:100 of 1:500 factor als de startende verdunning en 3 of 4 van 1:10 seriële verdunningen voor totale Ig isotype of 1:5 seriële verdunningen voor TNP-specifieke Ig isotype van elk serummonster(Figuur 2). IgE ELISA, bereiden serummonsters van de muis op een 1:2 verdunningsfactor als de startende verdunning en 3 1:5 seriële verdunningen voor elk serummonster maken.
  6. Na het blokkeren, was de platen uit stap 5.4 driemaal met 200 µL per putje van PBS-T en vlek droog de platen na elke wasbeurt.
  7. 100 µL per putje van verdunde Ig isotype normen (geschikt voor het vastleggen en detectie Abs) en verdund serummonsters van stap 5.5 overbrengen aan de platen bereid in stap 5.6. Incubeer de platen aan de normen en de monsters bij 4 ° C's nachts.
  8. Spoel de platen 3 keer met 200 µL per putje van PBS-T en vlek droog de platen na elke wasbeurt.
  9. In elke plaat, voeg 100 µL per putje van 10 µg/mL van een geschikte alkalisch fosfatase (AP)-geconjugeerd isotype-specifieke geit-antimuis Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A of E) Abs verdund in Buffer blokkeren.
  10. Incubeer de platen met AP-geconjugeerde Abs voor 1-2 h op RT. Voor de detectie van de IgE, Incubeer de platen gedurende 1-2 uur bij 37 ° C.
  11. 1 mg/mL substraat oplossing voor te bereiden door het oplossen van twee tabletten van 5 mg fosfatase substraat in 10 mL substraat Buffer.
  12. Wassen van elke plaat 5 keer met 200 µL per putje van PBS-T en vlek drogen de platen na elke wasbeurt.
  13. Voeg 100 µL per putje van substraat oplossing in elke plaat. Laat de reactie te ontwikkelen op RT, wat gewoonlijk slechts een paar minuten duurt.
  14. Lees elke plaat op 405 nm met behulp van een microplate-lezer met de bijbehorende software.
    1. Klik op "instellingen" om de golflengten "Lm1" op "405 nm" en klik "OK".
    2. Klik op 'sjabloon' om 'leeg' wells, "normen" wells en "onbekend" putten volgens de 96-wells-plaat setup te wijzen.
    3. "Normen" de wells, klikt u op "serie" om de "Eerste steekproef"als"St01", selecteer "Beginnen bij" aan "Top", en "repliceert" als "2". Controleren"Monster Descriptor", en invoergegevens naar "Standaardwaarde": Selecteer "eenheden"als"ng/mL", "Starting waarde" als "250", "Step by" als "2" ingesteld. Klik op "OK".
    4. Klik op "Lezen" om te lezen van de plaat als de meest standaard bereikt geconcentreerde een optische dichtheid (OD) van ~ 1.
    5. Klik op het menu "bestand" en klik op "Opslaan" om het bestand te slaan.
    6. Klik op "Lees" om te lezen van de plaat weer als de meest geconcentreerde standaard OD405 ~ 1,5, of 2, 2.5, respectievelijk overbelast.
  15. Zet de reactie stop door 25 µL per putje van 3 M NaOH toe te voegen. Voer stappen 5.12 tot 5.15 voor een plaat op een moment.
  16. ELISA gegevens met behulp van de software gekoppeld aan de lezer microplate analyseren:
    1. Controleer de waarden van de OD405 van de Ig isotype normen voor lees-bestanden en selecteer een passende lezing met goede lineaire spreiding van de normen voor gedetailleerde gegevensanalyse.
    2. Selecteer het programma van de 4-Parameter montage standaard curven uitzetten. Controleer het co-efficiënt van de standaard curve (R2), die vereist is om te worden > 0.98 om van goede gegevenskwaliteit te waarborgen.
    3. Controleer of de OD405-waarden van elk monster afnemen met toenemende verdunningsfactoren. De concentratie van alle putjes van de verdunde monster ophalen door te klikken op "Onbekenden".
    4. Selecteer een passende waterput van elk monster met OD405 in het lineaire bereik van de Ig isotype standaard curve voor de berekening van de concentratie.
    5. Berekenen van het serum Ig isotype concentratie van elk monster met behulp van de formule: serum Ig concentratie = geselecteerde goed concentratie x verdunningsfactor.
  17. Plot de grafieken en het uitvoeren van statistische analyses met behulp van een geschikte software9,10,11. Maak verticale scatter percelen van serum Ig isotype niveaus te vergelijken van de Ig-reacties in de hetzelfde tijdstip. Zorg voor TD geheugen reactie studies, de tijdsverloop respons curves te onderzoeken van de Ig isotype reacties vóór en na de booster immunisatie. Gebruik foutbalken wilt weergeven van de standaarddeviatie (SD) van elke groep van monsters. Om te vergelijken Ig isotype reacties tussen twee genotypen van muizen, gebruiken de ongepaarde t -test voor tweezijdige gegevens om te bepalen van de statistische significantie. De p waarde < 0.05 als aanzienlijk verschillende instellen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol hebben we gebruikt om te onderzoeken van de rollen van een kritische regulator van het immuunsysteem, de TRAF3, in TI en TD Ig isotype reacties9,10,11. TRAF3 direct of indirect regelt de signaaltransductie van een aantal aangeboren en adaptieve immuun receptoren, met inbegrip van de TNF receptor superfamilie, Toll-like receptoren en T cel receptor/CD28, o.a.27...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we het protocol voor de karakterisatie van TD en TI Ig isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Succesvolle uitvoering van dit protocol vereist het gebruik van stoffen genoemd in tabel 1, waaronder assay ELISA-plaatjes, immunisatie Ags, muis Ig isotype-specifieke antilichamen en normen. Zorg moet worden genomen om te voorkomen met behulp van weefselkweek behandeld platen voor ELISA. Verdunningen van de normen en serummonsters moeten worden gedaan in afzonderlijke onbehandelde pla...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health grants R01 CA158402 (P. Xie) en R21 AI128264 (P. Xie), het ministerie van defensie verlenen W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), een piloot-Award van de kanker instituut voor New Jersey door Grant nummer P30CA072720 van het National Cancer Institute (P. Xie), een Busch biomedische Grant (P. Xie), een Victor Stollar Fellowship (A. Lalani), en een Anne B. en James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
VersaMax Tunable Microplate ReaderMDS Analytical TechnologiesVERSAMAXEquipment om de platen te lezen
SOFTmax PRO 5.3MDS Analytical TechnologiesSOFTmax PRO 5.3Software voor de platenlezer
GraphPad PrismGraphPadPrismSoftware voor grafieken en statistieken
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL)Biosearch TechnologiesF-1300-10Een TI Ag voor immunisatie
TNP-KLHBiosearch TechnologiesT-5060-5Een TD Ag voor immunisatie
TNP(38)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (conjugatieratio: 38)Coating Ag voor TNP-specifieke ELISA
TNP(3)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (conjugatieratio: 3)Coating Ag voor hoog affiniteit TNP-specifieke Ig
Imject AlumFisher Scientific PI-77161Alum adjuvant voor immunisatie
Falcon Polypropylene tubesFisher Scientific 14-959-11AVoor incubatie van TNP-KLH/alum
BD Insulin SyringeFisher Scientific 14-829-1BVoor i.p. injectie van muizen
Immuno 96-Well Plates, Flat-BottomFisher Scientific 14-245-61Voor ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-BottomVWR82050-622Voor seriële verdunningen van standaarden en monsters
Phosphatase substrate, 5 mg TabletsSigmaS0942-200TABAP substraat
DiethanolamineVWRIC15251690Een component van AP substraatbuffer
Goat anti-mouse IgMSouthernBiotech1020-01Capture Ab voor muis IgM
Goat anti-mouse IgG1SouthernBiotech1070-01Capture Ab voor muis IgG1
Goat anti-mouse IgG2aSouthernBiotech1080-01Capture Ab voor muis IgG2a
Goat anti-mouse IgG2bSouthernBiotech1090-01Capture Ab voor muis IgG2b
Goat anti-mouse IgG3SouthernBiotech1100-01Capture Ab voor muis IgG3
Goat anti-mouse IgASouthernBiotech1040-01Capture Ab voor muis IgA
Goat anti-mouse IgESouthernBiotech1110-01Capture Ab voor muis IgE
AP-Goat anti-mouse IgMSouthernBiotech1020-04Detectie Ab voor muis IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1SouthernBiotech1070-04Detectie Ab voor muis IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2aSouthernBiotech1080-04Detectie Ab voor muis IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2bSouthernBiotech1090-04Detectie Ab voor muis IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3SouthernBiotech1100-04Detectie Ab voor muis IgG3
AP-Goat anti-mouse IgASouthernBiotech1040-04Detectie Ab voor muis IgA
AP-Goat anti-mouse IgESouthernBiotech1110-04Detectie Ab voor muis IgE
Mouse IgM standardBD Biosciences553472TNP-specifiek IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standardBD Biosciences554054TNP-specifiek IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standardBD Biosciences556651TNP-specifiek IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standardBD Biosciences554055TNP-specifiek IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standardBD Biosciences553486KLH-specifiek IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standardBD Biosciences550924Mineralolie-geïnduceerde IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standardBD Biosciences557079TNP-specifiek IgE, Clone  C38-2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. Janeway's Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors--sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O'Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12(2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, Suppl 1 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7(2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719(2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997(2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O'Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Thymus afhankelijke immunoglobulineanalyse van muisserumisotype specifieke ELISATNP KLH immunisatieTNP polysaccharide immunisatieretro orbitale bloedafnamemicroplaatlezerflowcytometrie

Gerelateerde artikelen